Messung der taktile Allodynie in einem Mausmodell der bakteriellen Prostatitis

Zusammenfassung

Infektion der Prostata kann ein Faktor bei der Vermittlung Schmerzen im Beckenbereich bei chronischer Prostatitis sein. Wir beschreiben das Verfahren zur Herstellung von standardisierten bakteriellen Inokulums Instillation von Bakterien in die Harnröhre des männlichen Mäusen und Methodik zur Messung taktile Allodynie bei Mäusen über die Zeit.

Zusammenfassung

Uropathogenen Escherichia coli (UPEC) sind Erreger, die eine wichtige Rolle bei Harnwegsinfektionen und bakterielle Prostatitis ¹ spielen. Wir haben kürzlich gezeigt, dass UPEC eine wichtige Rolle bei der Initiierung von chronischen Schmerzen im Beckenbereich ^2, ein Merkmal Chronische Prostatitis / chronisches Schmerzsyndrom des Beckens (CP / CPPS) ^3,4 haben. Infektion der Prostata durch klinisch relevante UPEC können initiieren und zu etablieren chronischen Schmerzen durch Mechanismen, die Gewebeschäden und die Einleitung von Mechanismen der Autoimmunität ⁵ verbunden sein können.

Eine Herausforderung für das Verständnis der Pathogenese der UPEC in der Prostata ist die relative Unzugänglichkeit der Prostata zur Manipulation. Wir verwendeten ein zuvor beschriebenes intraurethrale Infektion Methode ⁶ eine klinische Stamm UPEC in männlichen Mäusen somit Gründung einer aufsteigenden Infektion der Prostata zu liefern. Hier beschreiben wir unsere Protokolle für die Standardisierung der bacterial Inokulum ⁷ sowie das Verfahren zur Katheterisiervorrichtung narkotisierten männlichen Mäusen zur Instillation von Bakterien.

CP / CPPS wird hauptsächlich durch das Vorliegen von taktiler Allodynie ^{4 charakterisiert.} Behavior-Tests auf dem Konzept der kutanen Hyperalgesie aus bezeichnet viszeralen Schmerzen ^8-10 basiert. Ein gereizter Fokus der viszeralen Geweben reduziert kutanen Schmerzschwelle ermöglicht eine übertriebene Reaktion auf normalerweise nicht-schmerzhafte Reize (Allodynie). Anwendung normaler Kraft auf die Haut führen anormalen Reaktionen, die mit der Intensität des darunterliegenden viszeralen Schmerzen erhöhen neigen. Wir beschreiben Methoden in NOD / ShiLtJ Mäusen, die von Frey Fasern zu verwenden, um taktile Allodynie über die Zeit in Reaktion auf eine einzelne Infektion mit Bakterien UPEC quantifizieren.

Protokoll

Ein. Bakterien Vorbereitung für Maus Impfung

Folgendes muss unter aseptischen Bedingungen erfolgen.

1. Nehmen Sie ein 17 x 100 mm Polypropylen-Röhrchen mit Kappen und 3 ml frisches Luria Broth (LB)-Medium. Mit autoklaviert Tipps, nehmen Sie sich gefrorenen Bakterien Glycerin Lager des Stammes CP1 ² und übertragen eine kleine Menge der Kultur in das Röhrchen mit der LB-Medien. Den Schlauch Kappe so dass Sauerstoff noch in der Lage, um das Rohr eindringen - die Kultur muss unter aeroben Bedingungen wachsen. Das Röhrchen bei 37 ° C in einem Schüttelinkubator bei 220 rpm über Nacht.
2. Am nächsten Tag übertragen 5 ul-Nacht-Kultur in ein frisches Röhrchen mit 3 ml LB-Medium wachsen und unter statischen Bedingungen in einem Inkubator über Nacht bei 37 ° C.
3. Am Tag 3 Transfer 40 ul der Kultur in aa 50 ml Röhrchen mit 40 ml LB-Medium jeweils. In einem 37 ° C statische Inkubator über Nacht.
4. Schalten Sie ein und stellen Zentrifuge auf 4 ° C.Sobald Zentrifuge Endtemperatur erreicht, übertragen jede 40 ml Kultur in einem 40 ml Nalgene Zentrifugenröhrchen.
5. Wiegen Röhrchen Zentrifuge auszugleichen - die Lautstärke mit LB-Medium, wie gebraucht. Spin Röhrchen bei 6.000 rpm für 20 min.
6. Überstand sorgfältig abnehmen und vorsichtig auszusetzen Bakterienpellet in 40 ml steriler PBS.
7. Wiederholen Sie Schritt 1,5 mit PBS.
8. Absaugen Überstand und auszusetzen Bakterien in 500 ul sterilem PBS. Wird die Lösung in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Nehmen Sie sich 10 ul der Suspension und verdünnen in 990 ul eiskaltem PBS. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die OD _{420 nm} zu lesen, um die Lautstärke für die Impfung benötigten bestimmen. Um das entsprechende Volumen bestimmen eiskaltem PBS, um Pellets in auszusetzen: Nehmen Sie die OD _{420 nm-Nummer} (in ml) und subtrahieren die geschätzte Volumen des Bakterienpellet [ex. OD _{420 nm} = 0,545, Pellet ca. 0,075 ml. 0,545 bis 0,075 = 0,470].
9. Entfernen 10 ul der Bakteriensuspension und diLaute in 990 ul eiskaltem PBS. Lesen Sie die OD _{420 nm.} Das Ziel ist, eine OD _{420 nm-Wert} für die verdünnte Suspension von 1,000 ± 0,010 zu erreichen. Wenn die Anzahl Ihrer Verdünnung oberhalb dieses Ziels, fügen mehr Volumen der Suspension und nehmen eine andere Lesart. Wenn die Zahl unter dem 0,990 dann drehen sich die Aussetzung und wiederholen OD _{420 nm} Lesen bis zum Erhalt gewünschte Lektüre.

2. Tierische Infektion

Mäuse (5 bis 7 Wochen alt, zehn pro Gruppe) wurden vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erworben.

1. Mäuse werden anästhesiert durch Inhalation von 1-4% Isofluran in einem Plexiglas-Kammer und sind bis recumbent überwacht.
2. Eine Maus zu einem Zeitpunkt ist zur Instillation von Bakterien durch Katheterisierung mit einem Polyethylen (PE10) Katheter an einer modifizierten 30 G Nadel einer Hamilton-Spritze aus Glas (Länge 1,5 bis 2,0 cm) entnommen. Der Katheter mit der Nabe der Nadel eingeführt wird. Die Maus ist placed auf die dorsale Oberfläche unter Narkose gehalten mit einem Nasenkonus.
3. Der Penis des Maus extrudiert wird durch sanften Druck und großzügigen Mengen an Schmiermittel auf Wattestäbchen ist zum Schmieren Eingang des penilen Harnröhre verwendet.
4. 10 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 1 x 10 ⁸ Bakterien in die Harnröhre von betäubten Mäusen nach Katheterisierung eingeführt.
5. Die Mäuse werden in einer anästhesierten Zustand für 15 min in dem Plexiglas-Kammer aufrechterhalten nach bakterieller Einführung bakteriellen Befestigung zu ermöglichen und eine sofortige Wasserlassen verhindern.
6. Mäuse werden wieder in ihre Käfige gesetzt und überwacht für die nächsten 24 Stunden.

3. Behavior Testing

Die Mäuse wurden vor der Infektion (Baseline) und an den Tagen 3, 7, 14, 21 und 28 nach der Infektion getestet. Bezeichnet Hyperalgesie und taktile Allodynie wurde anhand von Frey Filamente aufgebracht auf den Bauch ^11,12 und der plantaren region der Hinterpfote ^13. Testing zu einem festen Zeit-of-day wurde perfomed wurden Standard-Methodik und einzelne Experimentator Prüfung von allen Tieren beschäftigt. Verblendet Testen von Gruppen wurde verwendet, um die Grenzen der verhaltensbasierte Schmerzen Tests in Tiermodellen zu bekämpfen. Fünf einzelne von Frey Filamenten mit Kräften von 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 und 4,0 g (Stoelting, USA) wurden auf das Abdomen und Häufigkeit der Wegziehreaktionen aufgebracht wurde berechnet.

1. Nach einer 30 min Eingewöhnungszeit werden die Mäuse in den einzelnen Plexiglas Kammern (6 x 10 x12 cm) in-house mit einem Edelstahl-Drahtgitter-Boden aus gelegt.
2. Bezeichnet Hyperalgesie und taktile Allodynie wurden getestet unter Verwendung der fünf von Frey Filamenten. Jedes Filament wurde für 1-2 Sekunden mit einem Inter-Stimulus-Intervall von 5 Sekunden für insgesamt 10-mal angewendet, und die Haare wurden in aufsteigender Reihenfolge der Kraft getestet.
3. Jedes Filament mit dem unteren Bauchbereich in der allgemeinen Umgebung der Prostata aufgebracht undwurde darauf geachtet, verschiedene Bereiche innerhalb dieser Region zu stimulieren Desensibilisierung zu vermeiden oder "Wind up"-Effekte. Filamente wurden mit ansteigender Kraft für 1-2 sec mit mindestens 5 sec Intervallen zwischen Stimulationen für insgesamt 10-mal angewendet.
4. Drei Arten von Verhalten eine positive Reaktion auf Filament Stimulation betrachtet: 1) scharfe Einziehen des Bauches, 2) sofort Lecken oder Kratzen im Bereich der Wendel Stimulation; 3) Springen.
5. Ansprechfrequenz wurde als der Prozentsatz der positiven Antwort (von 10, z. B. 5 Antworten von 10 = 50%) berechnet und die Daten wurden als mittlere Prozentsatz der Ansprechfrequenz ± SE gemeldet
6. Tiere mit mehr als 25 positiven insgesamt Baseline Antworten werden von der Studie ausgeschlossen.
7. Taktile Allodynie wurde auf dem Plantarbereich der Hinterpfote mit von Frey Filamente mit Kräften von 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 und 4,0 g getestet. Der Median 50% Wegziehschwelle (5) wurde mit dem up-downMethode, bei der Prüfung mit 0,04 g Filament gestartet wurde angewendet senkrecht zur Fußsohle der Hinterpfote, bis der Faden leicht gebeugt. Filamente wurden in aufsteigender Reihenfolge, bis eine positive Antwort wurde beobachtet, getestet. Eine positive Antwort auf das Filament wurde entweder als eine scharfe Rückzug der Pfote oder Lecken der Test paw definiert. Wenn eine positive Antwort aufgezeichnet wurde der nächste schwächeren Filamenten aufgebracht wurde, und wenn eine negative Antwort beobachtet wurde, dann wird die nächste stärkere Filament aufgebracht wurde.
8. Die Experimente und Methoden beschrieben, wurden überprüft und von der Northwestern University Tierpflege und benutzen Ausschuss.

Ergebnisse

Wir untersuchten NOD / ShiLtj und C57BL/6J männlichen Mäusen auf das Vorhandensein von chronischen Schmerzen bei bakteriellen Infektion. Männliche Mäuse (5 bis 7 Wochen alt) wurden mit Kochsalzlösung oder Bakterien in die Harnröhre (Abbildung 1) zugetropft. Mechanische Stimulation des Beckenbodens mit von Frey Filamente Kochsalzlösung eingeflößt C57BL/6J-Mäuse und UPEC-infizierten C57BL/6J Mäusen führte zu einer Reaktion Frequenz, die nicht während der 28-tägigen Kurs des Experiments (Abbi...

Diskussion

Infektion der Maus Prostata mit UPEC ermöglicht für die in vivo-Modellierung von Ereignissen, die an der Pathogenese von bakteriellen Prostatitis, CP / CPPS oder als prädisponierende Ereignis in chronischen Entzündung beteiligt sein können. Die Methoden für die bakterielle Vorbereitung und Instillation draw auf eine große Menge an Literatur beschrieben auf UPEC Modelle weiblichen Harnwegsinfektion ^7,14. Das Modell verfügt über eine breite Anwendbarkeit für das Studium Pathogenese, Testung potentielle...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
Kulturröhrchen	BD Falcon	352059
LB Broth Miller	EMD	EM1.10285.0500
Nalgene Zentrifugenröhrchen	Thermo	3118-0050
Isofluran	Butler Schein	NDC 11695-6776-1
Katheternadel 30G	Hamilton	91030
PE10 Schlauch	BD Intramedic	427400
Von Frey Filaments	Stoelting	58025-31