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Methodenartikel

Der Einsatz von Chemostate in Microbial Systems Biology

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DOI:

10.3791/50168

⸱

14. Oktober 2013

 ,  , 
1Center for Genomics and Systems Biology, Department of Biology, New York University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Zellwachstumsrate ist ein regulierter Prozess und eine wesentliche Determinante für Zellphysiologie. Kontinuierliche Kultivierung mit Chemostate ermöglicht extrinsischen Kontrolle der Zellwachstumsrate von Nährstoffmangel erleichtert die Untersuchung der molekularen Netzwerke, die Zellwachstum und wie diese Netzwerke entwickeln, um das Zellwachstum zu optimieren steuern.

Zusammenfassung

Zellen regulieren ihre Wachstumsrate in Reaktion auf Signale von der Außenwelt. Als die Zelle wächst, müssen diverse zelluläre Prozesse koordiniert einschließlich makromolekulare Synthese, Stoffwechsel und letztlich Einsatz für die Zellteilungszyklus ist. Der Chemostat, eine Methode der experimentell Steuerung der Zellwachstumsrate, liefert ein leistungsfähiges Mittel, systematisch zu untersuchen, wie Wachstumsrate Auswirkungen zelluläre Prozesse - einschließlich der Genexpression und Stoffwechsel - und die regulatorischen Netzwerke, die die Geschwindigkeit von Zellwachstum steuern. Wenn für Hunderte von Generationen Chemostate beibehalten kann zur adaptiven Evolution der Mikroben in Umweltbedingungen, die das Zellwachstum zu begrenzen studieren. Wir beschreiben das Prinzip der Chemostatkulturen, zeigen deren Betrieb und liefern Beispiele für ihre verschiedenen Anwendungen. Nach einer Periode des Stillstands nach ihrer Einführung in der Mitte des zwanzigsten Jahrhunderts, die Konvergenz der genomweiten Methoden mit einer erneutenInteresse an der Regulation von Zellwachstum und die molekularen Grundlagen der adaptiven Evolution ist anregend eine Renaissance in der Verwendung von Chemostate in der biologischen Forschung.

Einleitung

Das Wachstum der Zellen wird durch komplexe Netzwerke von zusammenwirkenden genetischen und Umweltfaktoren 1,2 geregelt. Die multifaktorielle Regulation von Zellwachstum erfordert einen System-Level-Ansatz für ihre Studie. Jedoch ist die strenge Untersuchung regulierten Zellwachstum durch die Schwierigkeit der experimentell Steuern der Rate, mit der Zellen wachsen in Frage. Darüber hinaus wird in selbst die einfachsten Experimente extrazellulären Bedingungen sind häufig dynamisch und komplex wie Zellen zu verändern ständig ihre Umwelt, wie sie sich vermehren. Ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen, die experimentelle Kontrolle der Zellwachstumsraten definiert, unveränderlich und kontrollierten Umgebungen ermöglicht: Eine Lösung für diese Probleme wird durch die Chemostat zur Verfügung gestellt.

Die Methode der kontinuierlichen Kultivierung mit einem Chemostat wurde unabhängig von Monod 3 und Novick & Szilard 4 im Jahr 1950 beschrieben. Wie ursprünglich konzipiert, werden die Zellen in einem festen Volumen von Medien, die con ist gewachsenlaufend durch Zugabe von neuen Medien und gleichzeitiger Entfernung des alten Medien und Zellen (Fig. 1) verdünnt. Gekoppelten Differentialgleichungen (2) beschreiben die Änderungsrate der Zelldichte (x) und die Konzentration des Wachstums-limitierende Nährstoff (e) in dem Chemostatgefäß. Wichtig ist, dass dieses System von Gleichungen, sagt eine einzige (nicht Null) stabil stationären (Abbildung 3) mit der bemerkenswerten Implikation, dass im stationären Zustand, gleich der Rate ist die spezifische Wachstumsrate der Zellen (dh die exponentielle Wachstumsrate konstant) bei der die Kultur verdünnt wird (D). Durch Variation der Verdünnungsrate ist es möglich, stationäre Populationen von Zellen in unterschiedlichen Wachstumsraten und unter verschiedenen Bedingungen von Nährstoffmangel zu etablieren.

Die experimentelle Kontrolle der Wachstumsrate mit Chemostate war entscheidend für die Entwicklung des Verständnisses, wie Veränderungen der Zellphysiologiemit Wachstumsraten 5,6. Das ehemalige Hauptstütze der mikrobiologischen Methoden wurde jedoch bei der Explosion in der molekularbiologischen Forschung während des späten zwanzigsten Jahrhunderts zunehmend unklar. Heute, erneutes Interesse in der Wachstumskontrolle in beiden Mikroben und vielzelligen Organismen und dem Aufkommen der genomweiten Methoden zur Analyse auf Systemebene hat die Motivation für den Einsatz von Chemostate erneuert. Hier beschreiben wir drei Anwendungen, die auf die präzise Steuerung von Zellwachstumsraten und der äußeren Umgebung, die eindeutig mit Chemostate möglich zu nutzen. Zunächst beschreiben wir die Verwendung von Chemostate zu untersuchen, wie die Fülle von Tausenden von Biomolekülen - wie Transkripte und Metaboliten - sind koordinativ mit Wachstumsrate geregelt. Zweitens beschreiben wir, wie Chemostate verwendet werden, um eine präzise Schätzung der Wachstumsrate Unterschiede zwischen den verschiedenen Genotypen in nährstoff beschränkt Umgebungen mit Konkurrenzversuchen zu erhalten. Drittens werden wir beschreiben, wie Chemostate kannverwendet werden, um adaptive Evolution der Zellen, die in konstanter nährstoffarmen Umgebungen zu untersuchen. Diese Beispiele veranschaulichen, in welcher Weise Chemostate ermöglichen es Systemebene Untersuchungen von Zellwachstumsregulierung, durch Gen-Umwelt-Interaktionen und adaptive Evolution.

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Protokoll

Das Prinzip der kontinuierlichen Kultivierung mit einem Chemostat können in einer Vielzahl von Ausführungen realisiert werden. In allen Chemostate ist es wesentlich, 1) Verfahren zur Aufrechterhaltung der Sterilität aller Komponenten, 2) eine gut gemischte Kultur, 3) geeignete Belüftung des Kulturgefäßes und 4) einer zuverlässigen Medien Zugabe und Entnahme Kultur. Hier beschreiben wir die Verwendung eines Sixfors Bioreaktor (Infors Inc) als Chemostat mit Methoden, die leicht auf alternative Konfigurationen angepasst werden können.

1. Montage der Chemostat Schiffe

  1. Schalten Sie die Sixfors über den Hauptschalter.
  2. Die Chemostatgefäß, Rührer Montage, und die angeschlossenen Schläuche mit entsalztem (VE) Wasser gründlich abspülen. Überprüfen Sie alle Schläuche und O-Ringe und ersetzen Sie abgenutzte aussehende Stücke.
  3. Sicherzustellen, dass die Antriebswellenstützbasis nach oben gerichtet in das Glasgefäß und die Oberseite der Antriebswelle in ihrem Gehäuse auf der Rühranordnung schnappt. Stellen Sie die stirrer Anordnung in das Glasgefäß Gewährleistung der Unterseite der Antriebswelle in dem Antriebswellenträger gelagert. Verwenden Sie den Haken, um den Rührer Anordnung an der Glasbehälter zu sichern.
  4. Füllen Sie den Behälter mit etwa 300 ml DI-Wasser.
  5. Entfernen Sie die Kappen von einem gelösten Sauerstoff (DO 2)-Sonde und überprüfen Sie den Elektrolytstand durch Abschrauben der unteren Gehäuse und dafür sorgen, dass der Boden Gehäuse ist zur Hälfte mit Elektrolytlösung gefüllt. Rescrew den unteren Mantel und stecken in den Anschluss auf der Chemostatgefäß. Schrauben handfest.
  6. Nehmen Sie eine pH-Sonde und aus seiner Speicherpuffer (3 M KCl). Entfernen Sie den pH-Sonde Kappe und heften sich an ein Fermenter. Mit der Sixfors Steuerbildschirm zu den Fermenter Parametermenü und wählen Sie "Kalibrieren pH". Setzen Sie den pH-Sonde in eine Standard-pH-7-Puffer und Plattenlese als Hoch lesen. Wiederholen Sie mit pH 4-Puffer und Plattenlese als Low lesen. Nehmen Sie den pH-Sonde aus Fermenter, wäscht mit DI-Wasser und führen Sie die Sonde into der Port auf dem Chemostatgefäß. Schrauben handfest.
  7. Legen Sie die Chemostatgefäß im Rack. Hinweis auf dem Schiff, die Fermenter (1-6) der pH-Sonde wurde angeschlossen und kalibriert. Setzen Sie die Kappe auf pH-Sonde der pH-Sonde. Mit Folie abdecken dicht die Spitze der DO 2-Sonde.
  8. Einklappen Folie über die Enden des Schlauchs an den Chemostatgefäß befestigt.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 1,2-1,8 für alle Schiffe.
  10. Sterilisieren der Gefäße durch Autoklavieren sie für 15 Minuten auf einem Flüssigkeitskreislauf.

2. Vorbereiten der Medien

  1. Stellen Sie die Begrenzung Konzentrationsbereich für einen Nährstoff durch den Anbau von Batch-Kulturen in verschiedenen Nährstoffkonzentrationen. Der Nährstoff wird in dem Bereich, wo die Begrenzung der endgültige Zelldichte ist eine lineare Funktion des ursprünglichen Nährstoffkonzentration (Fig. 4). Wählen Sie einen Nährstoffkonzentration auch im Grenzbereich. Beispiele für Standardmedien Zusammensetzung für Studien mit Saccharomyces cerevisiae sind in 7-11 zur Verfügung.
  2. Autoklav eine leere Glasballon, der mit einem Gummistöpsel enthält einen Lufteinlass und Medienunter nach zunächst sicherzustellen, dass das Ende der Medien Schlauch wird in Folie abgedeckt gekappt wird.
  3. In einem separaten Gefäß vorbereitet 10 l Medium.
  4. Bringen Sie einen 500-ml-Filtertasse in einen 100 ml-Flasche Medien. Entfernen Sie die Baumwollfilter mit einer Pinzette in Ethanol sterilisiert und sofort an die Filtration Anschluss befestigen auf dem Medienglasballon.
  5. Befestigen Sie den Medienglasballon mit einer Vakuumquelle und Filtermedien sterilisieren, indem es zu den Filtertopf.
  6. Wenn Filtration von Medien abgeschlossen ist, schließen Sie den Filter Port mit einer Metallklemme.

3. Kalibrieren dO 2 Sonden und Einrichten Chemostat

  1. Nachdem die Chemostat Schiffe wurden autoklaviert und darf Ort das Schiff in die entsprechende Wärmejacke abkühlen. Schließen Sie den Temperaturfühler, pH-Sonde, und DO 2-Sonde. Lassen Sie dieSchiff sitzen mit der Macht für mindestens 6 Stunden, damit die DO 2-Sonden zu polarisieren.
  2. Legen Sie das Ende jeder Abwasserrohr in einen separaten Auffangbehälter. Schließen Sie die Luftversorgung über ein Filter autoklaviert und schalten Sie Luftstrom. Das Wasser in jedes Schiff sollte aus den Abwasserrohren zu fließen, was bedeutet, dass alle Dichtungen korrekt gebildet werden.
  3. Einstellen der Höhe des Abwasserrohres gemäß der gewünschten Arbeitsvolumen (z. B. 300 ml). Wir verwenden ein Herrscher, der mit Rohrplatzierungen an verschiedenen Arbeitsvolumen kalibriert gekennzeichnet ist.
  4. Schließen Sie die Medien auf den Glasballon Chemostatgefäß. Verwenden Ethanol um Rohr zu halten endet so steril wie möglich. Fädeln Sie den Pumpenschlauch durch die Pumpe und offene Klemme. Manuell drücken Sie die Pumpe, bis die Medien beginnt, in der Chemostatgefäß fließen. Lassen Schlauch von der Pumpe, sollten Medien frei in Chemostatgefäß fließen. Wenn die Medien die Abwasserrohr erreicht, bringen Schlauch zu pumpen und zu klemmen.
  5. Starten running das Basisprogramm mit Laufradsatz bis 400 Umdrehungen pro Minute und die Temperatur auf 30 ° C eingestellt
  6. Um das zu tun zwei Sonden kalibrieren, schalten Sie Luftversorgung und wechseln Sie zu Stickstoffgas. Warten Sie mindestens eine Stunde und Rekordmesswert als "Low read". Wechseln Sie wieder zu Luftversorgung (dh haltigen Umgebung Sauerstoffkonzentration), warten Sie mindestens eine weitere Stunde und Plattenmessung als "hohe Lese".
  7. Starten Sie die Datenaufzeichnung mit Iris-Software.

4. Impfung

  1. 70% Ethanol zu verwenden, um die Oberseite des Kulturgefäßes zu sterilisieren.
  2. Schraube auf Behälterdecke und Pipette 1 ml einer Übernachtkultur in die Chemostatgefäß. Ziehen Sie die Schraube.
  3. Geben Sie die Zeit der Impfung in Iris.
  4. Warten Sie etwa 24 Stunden für Kulturen frühen stationären Phase zu erreichen. Wie die Kultur wächst, werden gelösten Sauerstoff und pH-Wert verringern. Im Falle von Glucose-Begrenzungsmittel, wird gelöster Sauerstoff auf ~ 100% im stationären pha zurückse. Für andere Nährstoff Einschränkungen gelöstem Sauerstoff wird in der stationären Phase bleiben <100%.

5. Initiierung von Pumpen und Erreichen Steady State

  1. Das Verdünnungsverhältnis wird durch Dividieren der Flussrate durch die Kulturvolumen berechnet (wie viel Medien in den Behälter pro Stunde fließt). Beispielsweise mit einem Volumen von 300 ml einer Verdünnungsrate von 0,1 bedeutet, daß 30 ml Medium zu der Kultur pro Stunde aufgenommen. Da das System unter Überdruck das gleiche Volumen aus dem Behälter sichergestellt wird, dass die Kultur kontinuierlich verdünnt wird entfernt. Eine Reihe von Verdünnungsraten (D) verwendet, die die maximale Wachstumsrate (μ max) der Zellen, über dem Zellen aus dem Chemostat gewaschen werden, nicht überschreiten werden.
  2. Wählen Pumpeneinstellungen, die die Anzahl der Sekunden, die Pumpe an und aus angeben, um die gewünschte Durchflussmenge zu etablieren. Die Pumpe fördert Medien mit einer Geschwindigkeit von ~ 0,11 ml / sec.
  3. Definieren Sie ein Programm mit dem Sixfors interface, die die Pumptakt, Temperatur und Geschwindigkeit Flügelrad angibt. Starten Sie das Programm.
  4. Leeren Sie den Auffanggefäßen von Flüssigkeit und notieren Sie die Zeit.
  5. Nach mindestens zwei Stunden, mit einem Messzylinder zu messen, wie viel Medien aus dem Gefäß entfernt. Dies wird das Volumen, das in die Chemostatgefäß hinzugefügt wurde gleich. Berechnen Sie die Verdünnungsrate (D = V Abwasser / V Kultur / Zeit). Stellen Pumpeneinstellungen, wenn berechnet Verdünnungsrate nicht gewünschten Verdünnungsrate entsprechen.
  6. Im stationären Zustand ist die Zelldichte in der Chemostat nicht mit der Zeit ändern. Dies kann ohne Stören der Kultur durch Abtasten des Ausfluss gemessen werden. Wir Erreichen stationärer operativ definiert als identisch Zelldichtemessungen, die durch mindestens eine Verdopplung der Population abgetrennt werden. Erreichen stabilen Zustand wird etwa acht Kultur Generationen nach Beginn der Kultur Verdünnung zu nehmen. Im stationären Zustand Zellen wachsen exponentiell (dhE. konstante Wachstumsrate über die Zeit) in nährstofflimitierten Bedingungen. Die Verdopplungszeit der Population (Generationszeit) ist ln (2) / D.
  7. Weiterhin periodisch messen Abwassermenge für die Dauer des Experiments, um sicherzustellen, daß ein konstanter Verdünnungsrate aufrechterhalten wird.

6. Anwendung 1: Studieren wachsenden Zellen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten in Steady-State-Bedingungen

  1. Im stationären Zustand im Chemostat, ist die Wachstumsrate der Population von Zellen, die gleich der Verdünnungsrate. Durch die systematische Veränderung der Verdünnungsrate ist es möglich, Zellen mit unterschiedlichen Raten wachsen. Dies ermöglicht die systematische Untersuchung von physiologischen Parametern, die mit Wachstumsrate einschließlich Zellvolumen, Zellzyklus-Stadium und Stressresistenz variieren. Zusätzlich können stationäre Profile der globalen mRNA, Protein und Metabolitenspiegel in Zellen, die mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten getestet werden. Es gibt zwei Möglichkeiten, um Proben zu erwerben:
  2. Kleine Proben kann passiv sein, obindem das Ende des Rohrs in einem Abwasser 1,5 ml oder 15 ml-Röhrchen enthaltene. Eine Probe von 1-5 ml in wenigen Minuten (in Abhängigkeit von der Durchflussmenge) erhalten werden. Viele physiologische Parameter aus diesen Proben gemessen werden.
  3. Genexpression oder Metaboliten Analysen erfordern größere Proben, die so schnell wie möglich erreicht werden muss. Das Ende des Abwassers Rohr in ein 15 ml konischen Röhrchen. Lösen Sie die Schraube, mit der Metall Ende des Abwasserrohres und sanft nach unten drücken. A ~ 10 ml Probe rasch füllen Sie Ihre Röhre. Beachten Sie, dass das Volumen in der Chemostatgefäß geändert hat. Wenn viele aufeinander folgende Proben entnommen werden, kann es notwendig sein, um die Strömung zu verringern, um ein konstantes Verdünnungsverhältnis zu erhalten.

7. Anwendung 2: Präzise Messung der Unterschiede in den Wachstumsraten zwischen den Genotypen in Controlled Environments mittels Durchflusszytometrie-basierte Assays Wettbewerb

  1. Chemostaten verwendet werden, um die Wirkung der Nährstoffkonzentration genau zu quantifizierenauf Unterschiede in den Wachstumsraten (dh Fitness) zwischen verschiedenen genetischen Hintergründen. Durch Co-Kultivieren Stämme mit verschiedenen fluoreszierenden Proteinen markiert die Änderungsrate der relativen Häufigkeit während des exponentiellen Wachstums bestimmt. Durchführung dieses Tests bei verschiedenen Verdünnungsraten (D) ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen der Nährstoffkonzentration (e) auf Fitness Unterschiede.
  2. Stellen stationären Kulturen der beiden Stämme in separaten Chemostat Gefäße mit identischen Verdünnungsraten und einem Volumen von 300 ml.
  3. Passiv Probe 1 ml aus jedem Gefäß. Spin down Zellen resuspendieren in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und bei 4 ° C Diese Proben enthalten homogenen Zellproben, die Steuerelemente für die nachfolgende Durchflusszytometrie sind.
  4. Setzen Sie den Abwasserrohr von einem Behälter in einen Messzylinder autoklaviert. Lösen Sie die Schraube, mit der Metall Ende des Abwasserrohres und sanft nach unten drücken, um Zellen aus dem Chemostat zu vertreiben. Wanndas Volumen erreicht 150 ml, senden Sie das Metall Ende des Abwasserrohres in seine ursprüngliche Position (300 ml). Wiederholen, mit dem zweiten Behälter, mit einem anderen Messzylinder.
  5. 70% Ethanol zu verwenden, um die Sterilität aufrecht zu erhalten, während das Entfernen Schraube an der Oberseite der Chemostatgefäß. Zeigen Trichter in Öffnung und gießen Sie 150 ml von der anderen Kultur in die Chemostatgefäß. Ziehen Sie die Schraube. Wiederholen, mit dem zweiten Behälter mit dem zweiten Trichter. Jede Chemostatgefäß enthält nun eine Mischung der beiden Stämme.
  6. Besorgen Sie sich eine 1 ml Probe aus jedem Gefäß mit passiven Probenahme alle 2-6 Stunden. Spin down Zellen in PBS resuspendieren und bei 4 ° C Nimmt die Proben für 2-3 Tage sorgfältig Aufzeichnen der Zeit wurde jede Probe gemacht.
  7. Am Ende des Experiments beschallen und verdünnte Proben auf ~ 2 × 10 6 Zellen / ml. Verwendung der Durchflusszytometrie messen den Anteil der beiden Stämme in jeder Probe. Da beide Stämme sind exponentiell wächst, ist die relative Wachstumsrate Unterschieddurch lineare Regression ln (strain1/strain2) gegen die Zeit (in Generationen gemessen) bestimmt. Die Steigung der Regression ist die proportionale Differenz in der Wachstumsrate (dh die Eignung Vorteil) einer Belastung gegenüber dem anderen.
  8. Da die Mischkultur kann einige Zeit, um einen neuen stationären Zustand zu erreichen nimmt, kann frühen Zeitpunkten schlecht auf der Regressions passen. Dieses Problem ist am besten, indem 2-3 Generationen vor Beginn Probenahme oder Entfernen von Punkten, die früh klar Ausreißer verstreichen gelöst. Umgekehrt, wenn ein Stamm dem anderen outcompeted die Daten nicht mehr sinnvoll und diese Punkte sollten ausgeschlossen werden.

8. Anwendung 3: Experimentelle Entwicklung

  1. Experimentelle Entwicklung in Chemostate durchgeführt wählt für Mutanten, die in Fitness im nährstoff begrenzt Umwelt erhöht. Die Auswahl erfolgt in der Regel über Hunderte von Generationen durchgeführt.
  2. Stellen Sie eine Steady-State-Chemostatkultur mit einem Stammvon bekannten Genotyp (und vorzugsweise bekannte Genomsequenz) und eine definierte Nährstoffbeschränkung.
  3. Um ein "Fossilien" der Bevölkerung zu erhalten Anpassung passiv probieren Chemostat alle 2-3 Tage und speichern Sie die Probe in 15% Glycerin bei -80 ° C
  4. Überwachen Sie den Medienspeicher wieder aufzufüllen und mit frischem Medium wie nötig.
  5. Pflegen Sie die exponentiell wachsenden Kultur für mehrere hundert Generationen.
  6. Nach Beendigung des Selektionsplatte eine Probe von Zellen auf festen Agar-Platten. Nach der Zellen zu Kolonien gewachsen, nehmen eine unvoreingenommene Stichprobe von Kolonien mit Zahnstochern und impfen Klone in einzelne Wells einer 96-Well-Platte mit 100 ul Medium. Lassen klonalen Proben über Nacht wachsen, werden 100 ul von 30% Glycerin und Speicher in -80 ° C
  7. Charakterisieren Klone durch Sequenzierung ganzer Genome und die Durchführung phänotypische Tests einschließlich der Beurteilung von Eignung, mit einem gemeinsamen fluoreszenzmarkierten Referenzstamm, wie in Anwendungs ​​2 beschrieben.

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Ergebnisse

Ein Hauptvorteil der Chemostate ist die Fähigkeit, das Wachstum von Zellen experimentell durch Variieren des Verdünnungsrate zu steuern. In der Bäckerhefe, Saccharomyces cerevisiae, die Morphologie einer Zelle ist informativ seiner Phase im Zellzyklus. Populationen mit höheren Wachstumsraten enthalten einen höheren Anteil von aktiv teilenden Zellen, wie durch Messung der Bruchteil unbudded Zellen (5A) bestimmt. Analysen der globalen mRNA-Expression in Chemostatkulturen hat gezeigt, daß die Expression vi...

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Diskussion

Chemostate ermöglichen den Anbau von Mikroben in Wachstumsgesteuerten stationären Bedingungen. Die Zellen wachsen kontinuierlich mit einer konstanten Geschwindigkeit, was zu einem unveränderlichen äußeren Umgebung. Dies steht im Gegensatz zur Batch-Kultur Methoden, bei denen das äußere Umfeld kontinuierlich verändert und die Rate des Zellwachstums wird durch die komplexe Wechselwirkung von Genotyp und Umgebung bestimmt. Somit ist ein Hauptvorteil der Kultivierung von Mikroben in Chemostaten über Batch-Kulturen die Mögli...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von Start-up-Fonds der New York University unterstützt. Wir danken Maitreya Dunham und Matt Brauer, die zunächst die Verwendung von Chemostate Sixfors Bioreaktoren entwickelt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Infors-HT Sixfors ChemostatGeeignete technische Ressourcen, Inc. 
Glasflasche 9,5 lFisher Scientific02-887-1Für Mediengefäß und Schlauch
PinchcockFisher Scientific05-867Für Medienbehälter und
Schlauchstopfen, Größe 12, Grünes NeoprenCole-PalmerEW-62991-42Für Medienbehälter und Schlauch
Gerader VerbindungsstückCole-PalmerEW-30703-02Für Medienbehälter und Schlauch
Allgemein Spezialbinder 4 ZollFisher ScientificNC9557052Für Medienbehälter und
Schlauch, SilikonkautschukKleinteileB000FMWTDEFür Medienbehälter und Schlauch
, Silikon, 3/8 Zoll AußendurchmesserFisher Scientific02-587-1QFür Medienbehälter und Schlauchschläuche
, Silikon, 7/32 Zoll AußendurchmesserFisher Scientific02-587-1EFür Medienbehälter und Schlauche
Rohre, Edelstahl, 3/16 Zoll AußendurchmesserMcMaster-Carr6100K164Für Medienbehälter und Schlauch
, Edelstahl, 3/8 Zoll AußendurchmesserMcMaster-Carr6100K161Für Medienbehälter und
SchlauchhakenverbinderFisher Scientific14-66-18QFür Medienbehälter und
SchlauchratschenklemmeCole-PalmerEW-06403-11Für Medienbehälter und Schlauch
Luer, BuchseCole-PalmerEW-45512-34für Mediengefäß und Schlauch
Luer, AußengewindeCole-PalmerEW-45513-04für Mediengefäß und Schlauch
Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0,2 μ mFisher ScientificMTGR05010Für Medienbehälter und Schläuche
PTFE Acrodisc CR 13 mm Filter, 0,2 μ mFisher ScientificNC9131037für Medienbehälter und Schläuche
Direktablesungs-Durchflussrohr für LuftCole-PalmerEW-32047-77für Stickstoffgas-Setup
Direktablesungs-Durchflussrohr für StickstoffCole-PalmerEW-32048-63für Stickstoffgas-Setup
Gas-Dosierer-Multitube-RahmenCole-PalmerEW-03218-50für Stickstoffgas-Setup
Regler, zweistufiger analytischerAirgasY12-N145D580für Stickstoffgas-Setup-Schlauchadapter
, EdelstahlAirgasY99-26450für Stickstoff-Gas-Setup-Schlauch
männlicher AdapterAirgasWES544für Stickstoff-Gas-Setup
Norprene-SchlauchPlastics57280für Stickstoff-Gas-Setup-Stativbasis
Cole-PalmerEW-03218-58Für
Cole-PalmerEW-03217-92Für Stickstoffgas-Setup-Ballons
10 LFisher Scientific02-963-2AFür die Medienvorbereitung
Steritop Sterile Vakuum-Flaschenaufsatzfilter, 1.000 ml, PES-Membran; für 45 mmHalsgröße Fisher ScientificSCGP-T10-REFür Medienvorbereitung
Medienflasche 100 ml, 45 mm HalsgrößeFisher ScientificFB-800-100für die Medienvorbereitung
Calciumchlorid & Middot; 2H2OFisher ScientificC79-500Medienreagenzien
NatriumchloridFisher ScientificBP358-1Medienreagenzien
Magnesiumsulfat & Middot; 7H2OSigma Aldrich230391Medien Reagenzien
Kaliumphosphat monobasischFisher ScientificAC424205000Medien Reagenzien
AmmoniumsulfatFisher ScientificAC423400010Medien Reagenzien
KaliumchloridSigma AldrichP9541Medien Reagenzien
BorsäureSigma AldrichB6768Medien Reagenzien
Kupfersulfat & Middot; 5H2OSigma Aldrich209198Medien Reagenzien
KaliumiodidSigma Aldrich60400Medien Reagenzien
Eisenchlorid & Middot; 6H2OFisher ScientificI88-100Medien Reagenzien
Mangansulfat & Middot; H2OSigma Aldrich230391Medien Reagenzien
Natriummolybdat & Middot; 2H2OSigma AldrichM7634Medien Reagenzien
Zinksulfat & Middot; 7H2OFisher ScientificZ68-500Medienreagenzien
BiotinFisher ScientificBP232-1Medienreagenzien
CalciumpantothenatFisher ScientificAC24330-1000Medienreagenzien
FolsäureSigma AldrichF7876Medienreagenzien
Inositol (auch bekannt als Myo-Inositol)Fisher ScientificAC12226-1000Medien Reagenzien
Niacin (auch bekannt als Nikotinsäure)Sigma AldrichN4126Medien Reagenzien
p-AminobenzoesäureFisher ScientificAC14621-2500Medien Reagenzien
Pyridoxin HClSigma AldrichP9755Medien Reagenzien
RiboflavinSigma AldrichR4500-25GMedien Reagenzien
Thiamin HClFisher ScientificBP892-100Medienreagenzien
LeucinSigma AldrichL8000-100GMedienreagenzien
UracilSigma AldrichU0750Medienreagenzien
DextroseFisher ScientificDF0155-08-5Medienreagenzien
US Stickstoffgas-Setup-Ventilpatronen

Referenzen

  1. Ingraham, J. L., Maaloe, O., Neidhardt, F. C. Growth of the Bacterial Cell. , Sinauer Associates, Inc. (1983).
  2. Cell Growth: Control of Cell Size. Hall, M. N., Raff, M. C., Thomas, G. , CSHL Press. (2004).
  3. Monod, J. La technique de culture continue, theorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
  4. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science. 112, 715-716 (1950).
  5. Kjeldgaard, N. O., Maaloe, O., Schaechter, M. The transition between different physiological states during balanced growth of Salmonella typhimurium. J. Gen. Microbiol. 19, 607-616 (1958).
  6. Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Control of macromolecular synthesis. , W.A. Benjamin. (1966).
  7. Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional Homeostasis in Batch and Steady-State. Culture of Yeast. Mol. Biol. Cell. 15, 4089-4104 (2004).
  8. Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Mol. Biol. Cell. 21, 198-211 (2010).
  9. Boer, V. M., de Winde, J. H., Pronk, J. T., Piper, M. D. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).
  10. Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 352-367 (2008).
  11. Gresham, D., et al. Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18551-18556 (2010).
  12. Regenberg, B., et al. Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biol. 7, R107(2006).
  13. Castrillo, J. I., et al. Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast. J. Biol. 6, 4(2007).
  14. Cipollina, C., et al. Revisiting the role of yeast Sfp1 in ribosome biogenesis and cell size control: a chemostat study. Microbiology. 154, 337-346 (2008).
  15. Gresham, D., et al. System-level analysis of genes and functions affecting survival during nutrient starvation in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 187, 299-317 (2011).
  16. Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS Biol. 10, e1001325(2012).
  17. Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).
  18. Gresham, D., et al. The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoS Genet. 4, e1000303(2008).
  19. Wenger, J. W., et al. Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency. PLoS Genet. 7, e1002202(2011).
  20. Dunham, M. J., et al. Characteristic genome rearrangements in experimental evolution of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16144-16149 (2002).
  21. Ronen, M., Botstein, D. Transcriptional response of steady-state yeast cultures to transient perturbations in carbon source. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 389-394 (2006).
  22. Kresnowati, M. T. A. P., et al. When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation. Mol. Sys. Biol. 2, 49(2006).
  23. Tu, B. P., Kudlicki, A., Rowicka, M., McKnight, S. L. Logic of the yeast metabolic cycle: temporal compartmentalization of cellular processes. Science. 310, 1152-1158 (2005).
  24. Tzur, A., Kafri, R., LeBleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. Cell Growth and Size Homeostasis in Proliferating Animal Cells. Science. 325, 167-171 (2009).
  25. Conlon, I., Raff, M. Size control in animal development. Cell. 96, 235-244 (1999).
  26. Conlon, I. J., Dunn, G. A., Mudge, A. W., Raff, M. C. Extracellular control of cell size. Nat. Cell Biol. 3, 918-921 (2001).
  27. Fussmann, G. F., Ellner, S. P., Shertzer, K. W., Hairston, N. G. Crossing the hopf bifurcation in a live predator-prey system. Science. 290, 1358-1360 (2000).
  28. Cohen, E. P., Eagle, H. A simplified chemostat for the growth of mammalian cells: characteristics of cell growth in continuous culture. J. Exp. Med. 113, 467-474 (1961).

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Der Einsatz von Chemostate in Microbial Systems Biology
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