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Methodenartikel

Metabolische Markierung der neu transkribierten RNA für High Resolution Gene Expression Profiling von RNA Synthese, Verarbeitung und Decay in Zellkultur

27K Ansichten

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DOI:

10.3791/50195

⸱

8. August 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Max von Pettenkofer Institute, 2Department of Medicine, University of Cambridge, 3Institute for Informatics, Ludwig-Maximilians-University Munich

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Zelluläre Gesamt-RNA ein Template für die Untersuchung schlechte kurzfristige Änderungen in der RNA-Synthese und Zerfall sowie die Kinetik der RNA-Prozessierung. Hier beschreiben wir metabolische Markierung der neu transkribierten RNA mit 4-Thiouridin gefolgt von Thiol-spezifische Biotinylierung und Aufreinigung von neu transkribierten RNA ermöglicht, diese Einschränkungen zu überwinden.

Zusammenfassung

Die Entwicklung der gesamten Transkriptom-Microarrays und Sequenzierung der nächsten Generation revolutioniert unser Verständnis der Komplexität der zellulären Genexpression. Zusammen mit einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen beteiligt sind genaue Messungen der zugrundeliegenden Kinetik immer wichtiger. Hier stehen diese leistungsstarken Methoden wesentliche Einschränkungen aufgrund intrinsischen Eigenschaften der Vorlage Proben sie studieren, dh gesamten zellulären RNA. In vielen Fällen Veränderungen in zelluläre Gesamt-RNA entstehen entweder zu langsam oder zu schnell, um die molekularen Mechanismen und deren Kinetik mit ausreichender Auflösung darzustellen. Darüber hinaus werden der Beitrag der Änderungen in der RNA-Synthese, Verarbeitung und Zerfall nicht ohne weiteres unterschieden.

Wir haben vor kurzem entwickelte hochauflösende Genexpressionsanalysen, diese Einschränkungen zu überwinden. Unser Ansatz basiert auf metabolische Markierung der neu transkribierten RNA mit 4-thiouri Basisdine (daher auch als 4SU-Tagging bezeichnet) durch rigorose Reinigung neu transkribiert RNA mit Thiol-spezifische Biotinylierung und Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen gefolgt. Es ist für einen breiten Bereich von Organismen einschließlich Vertebraten, Drosophila und Hefe. Wir haben erfolgreich angewendet 4SU-Tagging, um Echtzeit-Kinetik der Transkriptionsfaktor Aktivitäten zu untersuchen, liefern präzise Messungen der RNA Halbwertszeiten und erhalten neue Einblicke in die Kinetik der RNA-Prozessierung. Schließlich können Computermodelle eingesetzt, um eine integrierte, umfassende Analyse der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu erzeugen.

Einleitung

Gene Expression Profiling ist ein wichtiges Instrument verwendet, um zelluläre Prozesse und die damit verbundenen komplexen Interaktion Netzwerk studieren. Studien zur mRNA waren typischerweise die Methode der Wahl, um grundlegende Einblicke in die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu erhalten. Die Entwicklung der gesamten Transkriptom-Microarrays 1 und, in jüngerer Zeit, der nächsten Generation Sequenzierung von RNA (RNA-seq) 2-4 angeheizt diesen Ansatz. Während diese Technologien revolutioniert unser Verständnis der Komplexität der zellulären Genexpression, stehen sie wesentliche Einschränkungen aufgrund ihrer intrinsischen Eigenschaften der Vorlage Probe, dh gesamten zellulären RNA. Erstens, kurzfristige Veränderungen in Gesamt-RNA Ebenen nicht übereinstimmen Änderungen in Transkriptionsraten, sind aber von Natur aus abhängig von der RNA-Halbwertszeit der jeweiligen Transkripte. Während eine fünffache Induktion eines kurzlebigen Transkript, zB Codierung für einen Transkriptionsfaktor, wird leicht nachweisbar sein in Gesamt-RNAinnerhalb einer Stunde die gleiche Induktion einer langlebigen Transkript, z. B. Codierung für ein metabolisches Enzym, bleiben nahezu unsichtbar. Darüber hinaus, auch eine komplette Abschaltung (> 1.000-fach Down-Regulation) in der Transkription von durchschnittlich Gen mit einer RNA-Halbwertszeit von fünf Stunden nehmen Sie einfach fünf Stunden seines gesamten RNA-Spiegel von nur zweifache verringern . Daher begünstigt Analyse von Gesamt-RNA die Erkennung von Up-Regulation von kurzlebigen Transkripte, von denen viele für Transkriptionsfaktoren und Gene mit regulatorischen Funktionen 5 codieren. Darüber hinaus wird die tatsächliche kinetische Kaskade Regelung verdunkelt und primären Signalwege nicht von sekundären unterschieden werden. Beide wiederum zu erheblichen Verzerrungen in stromabwärts bioinformaticsanalysen führen. Zweitens können Veränderungen in Gesamt-RNA Levels nicht auf Änderungen in der RNA-Synthese oder Zerfall zugeschrieben werden. Messungen der Letztere erfordern Zelle invasive Ansätze, z. B. Blockierung transcriptizur Verwendung von Actinomycin D 6, und erweiterte Überwachung der laufenden RNA Verfall im Laufe der Zeit. Bei einer mittleren mRNA Halbwertszeit in Säugerzellen von 5 - 10 h 5,7, wird mRNA-Spiegel der meisten Gene nur um weniger als das Doppelte nach mehreren Stunden der transkriptionellen Verhaftung verringert. Diese eher kleine Unterschiede führen in grob ungenaue Messungen von mRNA Halbwertszeiten für die meisten zellulären Genen aufgrund der exponentiellen Natur der zugrunde liegenden mathematischen Gleichungen. Schließlich, während RNA-seq der gesamten zellulären RNA ergab, dass etwa die Hälfte unserer Gene unterliegen alternatives Spleißen Veranstaltungen 8, den zugrunde liegenden Kinetik sowie die dynamischen Mechanismen Führung Gewebe-und Kontext-spezifische Regulation der RNA-Prozessierung noch schwer abzuschätzen sind. Darüber hinaus verarbeitet der Beitrag der RNA zu differentiellen Genexpression, insbesondere für nicht-kodierenden RNAs, bleibt zu bestimmen. Insgesamt stellen diese Einschränkungen Haupthindernisse fürbioinformatische kinetische Modellierung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen.

Vor kurzem haben wir eine Methode entwickelt, genannt hochauflösende Genexpressionsanalysen, um diese Probleme zu überwinden 5,7,9. Es basiert auf metabolische Markierung der neu transkribierten RNA unter Verwendung von 4-Thiouridin (4SU-Tagging), ein natürlich vorkommendes Uridinderivat basiert und bietet direkten Zugang zu neu transkribierten Transkripte mit minimaler Störung des Zellwachstums und der Genexpression (siehe Abbildung 1) 5, 10-12. Exposure von eukaryotischen Zellen zu 4SU Ergebnisse in seine schnelle Aufnahme, Phosphorylierung 4SU-Triphosphat und Einbau in neu transkribierten RNA. Nach Isolierung der gesamten zellulären RNA ist die 4SU-markierten RNA-Fraktion Thiol-spezifisch biotinylierte Erzeugen einer Disulfidbrücke zwischen Biotin und den neu transkribierten RNA. 'Total zellulären RNA' kann dann quantitativ in markierte ('neu transkribiert') und unmarkierten ('pre-existin getrennt werdeng ') RNA mit hoher Reinheit unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen. Schließlich wird markierten RNA aus den Perlen durch Hinzufügen eines Reduktionsmittels (z. B. Dithiothreitol) Spalten der Disulfidbrücke und Lösen der neu transkribierten RNA aus den Perlen zurückgewonnen.

Neu transkribiert RNA zeigt die transkriptionelle Aktivität von jedem Gen während des Zeitrahmens 4SU Exposition. 4SU-Tagging in der Zeitskala von Minuten stellt somit eine Momentaufnahme der eukaryotischen Genexpression und eine ideale Vorlage für down-stream bioinformatischen Analysen (z. B. Promotor-Analyse). In Fällen, in denen stationären Bedingungen angenommen werden kann, die Verhältnisse neu transkribiert / total neu transkribiert / unmarkiertem und unmarkierten / Gesamt-RNA liefern nicht-invasiven Zugang zu präzisen RNA Halbwertszeiten 7,13. Darüber hinaus ist es wichtig, dass die neu transkribierten RNA nach nur 5 min von 4SU-Tagging (5 min 4SU-RNA) gereinigt beachten ist jünger als 15 und 60 min 4SU-RNA.Bei der Durchführung sowohl ultra-kurz und zunehmend länger 4SU-Tagging in einem experimentellen Setting mit RNA-seq kombiniert, werden die Kinetik der RNA-Prozessierung bei Nukleotid Auflösung 9 offenbart. Schließlich erlauben Zeitverlauf Analysen neu transkribiert und Gesamt-RNA mit Computermodellen kombiniert eine integrative Analyse der RNA-Synthese und Zerfall 14.

Zusammenfassend kann dieser Ansatz zur direkten Analyse der Dynamik der RNA-Synthese, Verarbeitung und Zersetzung in eukaryotischen Zellen. Es gilt in allen wichtigen Modellorganismen einschließlich Säugetiere, Insekten (Drosophila), Amphibien (Xenopus) und Hefe 5,15,16. Es ist direkt kompatibel mit Microarray-Analyse 5,17, RNA-seq 9,13,14, und gilt in vivo 12,15. Hier haben wir ausführlich die Methodik zu beschriften, zu isolieren und zu reinigen, neu transkribierten RNA in kultivierten Säugetierzellen. Darüber hinaus Potentiometeral Probleme und Fallstricke werden diskutiert.

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Protokoll

1. Metabolische Markierung mit 4-Thiouridin

Machen Sie einen detaillierten Plan des Versuchsaufbaus / schedule, z. B. wenn die 4SU auf Zellkultur hinzufügen und wenn die Proben zu ernten. Plan für mindestens 5 min zwischen jeder Bedingung. Nur behandeln Zellen einer Bedingung zu einer Zeit. Griff max. 3 - 5 Gerichte zu einem bestimmten Zeitpunkt. Griff Zellen möglichst schnell auf Veränderungen der Temperatur und CO 2-Gehalt zu minimieren. Vermeiden, dass die Zellen dem Licht nach 4SU zugesetzt, da dies zu einer Vernetzung der 4SU-markierten RNA an zelluläre Proteine ​​führen kann.

Beginn der Kennzeichnung

  1. Thaw 4-Thiouridin (4SU) kurz vor der Verwendung und Pipette erforderliche Menge an 4SU für jede Bedingung in ein steriles Falcon-Röhrchen.
  2. Nehmen Sie die erforderliche Menge an Zellkulturmedium (5 ml pro 10 cm Schale) von den Gerichten und in den 4SU-haltigen Falcon-Röhrchen und gründlich mischen. Entfernen und entsorgen Sie die restlichen Mittel aus den Gerichten.
  3. Übernehmen 4SU-haltigem Medium zurück zu den Gerichten.

Ende der Etikettierung

  1. Entfernen Zellkulturmedium aus Zellen. 5 ml Trizol zu jeder Platte. Für komplexe Experimente mit mehreren Zeitpunkten oder Bedingungen, wird dieser Schritt am besten durch zwei Personen, ein Entfernen des Mediums, die andere Zugabe Trizol und Ernte des Lysats getan.
  2. Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur für die komplette Zell-Lyse.
  3. Verwenden Sie eine 10 ml Pipette, um die Platte sorgfältig spülen mit dem zusätzlichen Trizol. Dies hilft vollständige Zelllyse und Probe Erholung. Gehen Sie vorsichtig mit Trizol ist extrem gefährlich, wenn immer in Kontakt mit der Haut oder den Augen! Haben Gegenmittel für Phenol Verbrennungen an der Hand (z. B. Polyethylenglykol 300 oder 400 in der industriellen Brennspiritus (70:30)). Übertragen Proben Polypropylenröhrchen. Bitte beachten Sie, dass Standard-Falcon-Röhrchen nicht widerstehen diese hohen g-Kräfte). Die Proben können bei -20 ° C für mindestens einen Monat bis Gesamt-RNA aus der is hergestellt.

2. RNA Vorbereitung mit modifizierten Trizol Protocol

  1. 1 ml Chloroform (0,2 ml pro ml Trizol) und kräftig schütteln für 15 sec. Inkubieren bei Raumtemperatur für 2 - 3 min.
  2. Zentrifuge bei 13.000 × g für 15 min bei 4 ° C.
  3. Übertragen wässrige obere Phase (mit dem RNA) in ein neues 15 ml Polypropylen-Röhrchen.
  4. In der Reaktion ½ Volumen der beiden RNA Niederschlag Puffer und Isopropanol (zB auf 3 ml Überstand 1,5 ml RNA Niederschlag Puffer und 1,5 ml Isopropanol).
  5. Gut mischen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min.
  6. Zentrifuge bei 13.000 × g für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen.
  7. Spin down kurz (5.000 × g für 30 sec) und restliches Isopropanol mit 200 ul Pipette.
  8. In ein gleiches Volumen 75% Ethanol und schütteln, bis das Rohr Pellet löst. Vermeiden Sie brechen sie in viele kleine Stücke, da dies, kann die Entfernung von Rückständenl Ethanol schwierig.
  9. Zentrifuge bei 13.000 × g für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen.
  10. Spin down RNA kurz und entfernen restliche Ethanol mit einer 200 ul Pipette. Wiederholen Sie Schritt und entfernen restliche Ethanol mit einem 20 ul Pipette. Nach diesen beiden Schritten sollten keine weiteren Trocknung der Pellets vorgenommen werden.
  11. In 100 ul H 2 O pro 100 ug erwartet RNA-Ausbeute und gut mischen durch Auf-und Abpipettieren 5-6 mal, um das Lösen der RNA zu unterstützen.
  12. Auflösen und denaturieren RNA durch Erhitzen auf 65 ° C für 10 min (Shaker) und sofort auf Eis stellen.
  13. Messen RNA-Konzentration bei 260 nm mit einem Spektralphotometer NanoDrop, nach den Anweisungen des Herstellers. Diese RNA kann bei -80 ° C für mindestens einen Monat gelagert werden.

3. Thiol-spezifische Biotinylierung von Neu transkribierten RNA

  1. Beginnen Sie mit 60 - 80 ug Gesamt zellulären RNA.
  2. Bilden Kennzeichnung Reaktion. Pipette in der folgendenBestellung (pro ug RNA):
    1. 1 ul 10x Biotinylierung Buffer
    2. 7 ul RNA (mit 1 ug RNA in Nuklease-freiem H 2 O verdünnt)
    3. 2 ul Biotin-HPDP (1 mg / ml DMF)

Fügen Sie immer die Biotin-HPDP letzte und sofort mischen durch Pipettieren. Falls die Biotin ausfällt, kann DMF-Gehalt bis zu einer Endkonzentration von 40% gesteigert werden.

  1. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1,5 h bei Drehung.
  2. Fügen Sie dem gleichen Volumen Chloroform. Gründlich mischen. Inkubieren 2 - 3 Minuten, bis die Phasen zu trennen beginnen und Blasen beginnen zu verschwinden.
  3. Zentrifuge bei 20.000 × g für 5 min bei 4 ° C. Vorsichtig übertragen die obere wässrige Phase in ein neues Röhrchen.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 3.4 und 3.5 einmal. Sie können diesen Schritt in 2 ml Phase Lock Gel Schwere Rohre führen zum Verlust der RNA zu reduzieren.
  5. RNA Niederschlag: Add 1/10 das Volumen von 5 M NaCl und ein gleiches Volumen vonIsopropanol auf die Wasserphase.
  6. Zentrifuge bei 20.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen.
  7. In ein gleiches Volumen 75% Ethanol, Zentrifuge bei 20.000 × g für 10 min bei 4 ° C, Überstand verwerfen.
  8. Spin kurz und entfernen Restethanol mit 200 ul Pipette.
  9. Spin kurz und entfernen restliche Ethanol mit 20 ul Pipette.
  10. Nicht in die RNA zu trocknen. Re-suspend es in 50 - 100 ul H 2 O (~ 1 ul pro 1 ug Eingang RNA). Gut mischen durch Auf-und Abpipettieren 5 - 6 mal.
  11. Prüfen RNA-Qualität durch elektrophoretische Analyse auf RNA-Abbau auszuschließen.

4. Dot-Blot-Analyse von 4SU-Einbau (Optional)

4SU ​​Einarbeitung kann leicht durch Dot-Blot-Analyse von biotinylierten RNA bestimmt werden. Dies ist ein optionaler Schritt, Fehlersuche und Abschätzung der 4SU Einbauraten relativ zu einem biotinylierten DNA-Oligo-Steuerung ermöglicht. Für diesen Test wir rIhr Kommentar zu Verwendung iodoacetyl-Biotin statt Biotin-HPDP für Biotinylierung 4SU-markierte RNA in Schritt 3.2. Dies führt zu einer irreversiblen Biotinylierung 4SU-RNA. Daher Spalte-Methoden (z. B. RNeasy) kann zur Rückgewinnung von viel kleineren Mengen von biotinylierten RNA (z. B. 5 ug) verwendet werden. Während RNA biotinyliert mit Biotin-HPDP eignet sich auch für diesen Assay ist das resultierende Signal schwächer und das Signal-Rausch-Verhältnis schlechter (Abb. 3).

  1. Verfolgen Sie das Protokoll für 4SU-Kennzeichnung und Isolierung von Gesamt-RNA zellulären wie in den Abschnitten 1 und 2 beschrieben.
  2. Biotinylieren 4SU-markierte RNA, wie in Kapitel 3 beschrieben ersetzt Biotin-HPDP mit iodoacetyl-Biotin und führen zwei Chloroformextraktionen vollständig zu entfernen übermäßige iodoacetyl-Biotin-Reste.
  3. Recover biotinylierten RNA durch Isopropanol / Ethanol-Fällung wie beschrieben oder unter Verwendung einer Säule-basierten Ansatz (z. B. RNeasy) bei kleinen Mengen von RNA (<10 pg) Verwendet.
  4. Inkubieren Sie die Zeta Membran in Nuklease-freiem Wasser mit rockigen für 10 min.
  5. Nehmen Sie die Membran aus der Nuklease-freies Wasser und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, indem Membran zwischen zwei saubere Papierhandtücher und fest andrücken. Air-Trocknen der Membran für 5 min in schöner Punkten führen.
  6. Für jede Probe, bereiten 20 ul 200 ng / ul RNA mit eiskaltem Dotblot Bindungspuffer (10 mM NaOH, 1 mM EDTA). Bewerben 5 ul dieser Verdünnung (dh 1 ug RNA) sowie drei weiteren 10-fache Verdünnungen (dh 100, 10 und 1 ng RNA, respectively) zum Zeta Membran durch Pipettieren. Pipettieren durch einen leeren Rack Pipettenspitzen verwendet werden, um gleichmäßig verteilt Abstand zu liefern. Alternativ können Sie einen Dot-Blot gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  7. Anwenden 5 ul der Biotin-markierten DNA-Oligo in Konzentrationen von 20 ng / ul bis 20 pg / ul (dh 100 bis 0,1 ng Oligo) als positive control der Membran durch Pipettieren. Verwenden Sie einen biotinylierten, 4SU-naive Probe als negative Kontrolle.
  8. Luft trocknen die Membran für 5 min.
  9. Inkubieren der Membran für 30 min in 40 ml Blockierungspuffer unter Schütteln.
  10. Inkubieren der Membran mit 10 ml 1:1000 Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase für 15 min (5 ml PBS + 5 ml 20% SDS + 10 ul Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase)
  11. Waschen Membran zweimal in 40 ml PBS + 10% SDS (20 ml PBS + 20 ml 20% SDS) für 5 min.
  12. Waschen Membran zweimal in 40 ml PBS + 1% SDS (38 ml PBS + 2 ml 20% SDS) für 5 min.
  13. Waschen Membran zweimal in 40 ml PBS + 0,1% SDS (40 ml PBS + 200 ul 20% SDS) für 5 min.
  14. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, indem Membran zwischen zwei saubere Papierhandtücher und Druck auf sie fest.
  15. Visualisieren Membran-gebundenen HRP mit ECL den Anweisungen des Herstellers.
  16. Legen Sie die Membran in Folie / Beutel, Luftblasen entfernen und Inkubation für 2 min im Dunkeln.
  17. Expose MembranFilm für 1 - 5 min.

5. Trennung von markierten und unmarkierten RNA unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen

  1. Wärme Waschpuffer (3 ml pro Probe) bis 65 ° C in einem Wasserbad inkubiert.
  2. Bereiten Sie frischen 100 mM Dithiothreitol (DTT) in Nuklease-freiem H 2 O. Tun Sie dies durch Dekantieren 15 - 30 mg DTT Pulver in ein sauberes 50 ml Falcon-Röhrchen auf der ultra-feinen Waage gelegt. Wiegen und fügen erforderliche Menge an Nuklease-freiem H 2 O.
  3. Wärme biotinylierte RNA-Proben auf 65 ° C für 10 min zur Denaturierung und sofort auf Eis stellen.
  4. Platz μMacs Spalten in die magnetische Halterung. Wir empfehlen, nicht mehr als 12 Proben in einer Zeit (6 - 8 Proben sind optimal) zu verarbeiten.
  5. Pre-Abgleichtransistor Miltenyi Säulen mit 1 ml Waschpuffer Raumtemperatur. Dies dauert etwa 15 min.
  6. Inzwischen werden 100 ul Streptavidinbeads zu 50 - 100 ul biotinylierten RNA. Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 min mit der Drehung.
    7. < li> Wenn eine der Spalten nicht eingeleitet hat Ablassen von nun dies kann durch leichten Druck auf die Spitze der Säule mit einem behandschuhten Finger erleichtert werden. Sobald die Strömung hat begonnen die Säulen leicht abfließen kann.
  7. Übernehmen Sie die RNA / Perlen an den Säulen. Verwerfen Sie den Durchfluss durch es sei denn, Sie wollen die unmarkierten RNA-Fraktion (siehe Abschnitt 7) zu erholen.
  8. Waschen dreimal mit 0,9 ml 65 ° C Waschpuffer (1 ml Pipettenspitzen schrumpfen beim Pipettieren Puffer bei 65 ° C).
  9. Dreimal mit 0,9 ml Waschpuffer Raumtemperatur.
  10. Pipette 700 ul Puffer RLT (RNeasy MinElute Cleanup Kit, Qiagen) in neue 2-ml-Röhrchen und legen Sie sie unter den Spalten.
  11. Eluieren neu transkribierten RNA in die RLT-Puffer durch Zugabe von 100 ul 100 mM DTT zu den Spalten.
  12. Führen Sie eine zweite Elution Runde 3 min später in das gleiche Rohr durch das Hinzufügen eines weiteren 100 ul 100 mM DTT.

6. Wiederherstellung der neu transkribierten RNA

NHALT "> mit dem RNeasy MinElute Cleanup (Qiagen) nach Protokoll des Herstellers weiter. Elute in 25 ul Nuklease-freiem H 2 O. Measure RNA-Konzentrationen mit einem Spektralphotometer Nanodrop. Um den Bedarf auftauen und wieder einfrieren RNA vor dem Absenden zu vermeiden es zu einem High-Throughput-Assay, empfehlen wir die Vorbereitung unmittelbar nach dem neu transkribierten RNA cDNA gereinigt wird. Verwenden Sie 2,5 ul der neu transkribierten RNA in 20 ul cDNA-Synthese-Mix für cDNA-Synthese nach den Anweisungen des Herstellers. Führen qRT-PCR-Kontrollen unter Verwendung von 1 : 10 Verdünnungen der cDNA mix Shop RNA bei -80 ° C..

7. Rückgewinnung von unbeschriftet, Unbound RNA (Optional)

Bei der ungebundenen RNA wiederhergestellt werden muss, sammeln und kombinieren die Flow-Through (nach Zugabe der RNA-Streptavidinbeads Lösung für die Spalten) und die erste Wäsche für anschließende Fällung. In der Regel genügt es zur Ausfällung nur 50% des ungebundenen RNA als this enthält> 80% des Ausgangsmaterials.

  1. Fügen Sie dem gleichen Volumen Isopropanol (kein Salz muss hinzugefügt wie der Waschpuffer enthält bereits 1 M NaCl werden).
  2. Zentrifuge bei 20.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen.
  3. In ein gleiches Volumen 75% Ethanol, Zentrifuge bei 20.000 × g für 10 min bei 4 ° C, Überstand verwerfen.
  4. Spin kurz und entfernen Restethanol mit 200 ul Pipette.
  5. Spin kurz und entfernen restliche Ethanol mit 20 ul Pipette.
  6. Nicht in die RNA zu trocknen. Resuspendieren in 100 ul H 2 O. Gut mischen durch Auf-und Abpipettieren 5 - 6 mal. Inkubation bei 65 ° C für 10 min unter Schütteln und übertragen direkt zu Eis.
  7. Prüfen RNA-Qualität durch elektrophoretische Analyse auf RNA-Abbau auszuschließen.

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Ergebnisse

1. Ausgangsmaterial und erwartete Renditen

Nach 1 Std. (hr) von 4SU-Exposition neu transkribierten RNA entspricht etwa 1-4% der gesamten zellulären RNA. Dies wird niedriger sein Wachstum verhaftet Zellen, da sie nicht mehr synthetisieren RNA zur Rechenschaft für das Zellwachstum / Replikation. Als Kennzeichnung für 1 Stunde, empfehlen wir der Testdurchführung mit 60 - 80 ug Gesamt-RNA. Beginnend mit weniger als 30 ug Gesamt-RNA Ergebnisse in kleinen RNA-Pellets, die schwer nach der Biotinylieru...

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Diskussion

Metabolische Markierung von neu transkribierten RNA wesentlich verbessert die Leistung von High-Throughput-Technologien wie Microarrays und RNA-seq durch die Bereitstellung geeigneter Vorlagen, um die biologische Frage von Interesse anzusprechen. Das vorliegende Protokoll umfangreich Optimierung. Es erlaubt> 1000-fache Anreicherung von neu transkribierten RNA und bietet hoch reproduzierbare Ergebnisse.

Der experimentelle Aufbau eines 4SU-Tagging Experiment ist von entscheidender Bedeutung...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Wir möchten Amie Regan für die sorgfältige Durchsicht des Manuskripts danken. Diese Arbeit wurde von NGFN Plus-Grant # 01GS0801, MRC Stipendium Zuschuss G1002523 und NHSBT Zuschuss WP11-05 LD und DFG FR2938/1-1 zu CCF unterstützt

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4-ThiouriidinCarbosynthT4509Bereiten Sie 50 mM Vorrat in sterilem H2O vor, lagern Sie bei -20 μV; C in Aliquoten von 50-500 μ L, nicht verwendetes Reagenz entsorgen, nicht wieder einfrieren.
TrizolInvitrogen15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)WARNUNG - ÄTZEND und GESUNDHEITSGEFÄHRDEND! Sofortiger Zugang zu Phenol-Gegenmittel (PEG-Methanol); Bei 4 °C lagern.
ChloroformSigma372978WARNING - GESUNDHEITSGEFÄHRLICH
IsopropanolSigma650447
Natriumcitrat, nukleasefreiSigmaC85321,6 M Stammlösung mit nukleasefreiem Wasser herstellen.
5M nukleasefreies NaClSigma71386Stammlösung
Nukleasefrei H2OSigmaW4502Herstellung von 1 ml Aliquoten in nukleasefreien Röhrchen.
RNA-Fällungspuffer1,2 M NaCl, 0,8 M Natriumcitrat in nukleasefreiem Wasser. Bereiten Sie sich im Voraus unter streng nukleasefreien Bedingungen vor. Bei Raumtemperatur in 50 ml Falkenröhrchen lagern.
EthanolSigma459844Verwendung mit nukleasefreiem Wasser zur Herstellung von 80% Ethanol, Lagerung bei -20 °C.
1 M nukleasefreies Tris Cl, pH 7,5Lonza51237Stammlösung
500 mM nukleasefreies EDTA, pH 8,0Invitrogen15575-020Stammlösung
10x Biotinylierungspuffer (BB)100mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA in nukleasefreiem Wasser, Aliquote von 1 ml herstellen.
Dimethylformamid (DMF)SigmaD4551
EZ-Link Biotin-HPDPPierce21341Bereiten Sie 1 mg/ml Stammlösung vor, indem Sie 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF auflösen. Durch die sanfte Erwärmung wird die Solubilisierung verbessert. Bei 4 Grad lagern; C in Aliquoten von 1 ml.
Phase Lock Gel Heavy Tuben 2,0 mlEppendorf0032 005.152Optional für den Schritt der Chloroform-Extraktion.
Zeta-MembranBIORAD162-0153
10x Dot-Blot-Bindungspuffer100 mM NaOH, 10 mM EDTA
Biotin-Oligo5'-Biotin, 25 Nukleotide, beliebige
Sequenz NatriumdodecylsulfatFisher BPE9738Für 100 ml 20%ige Stammlösung 20 g SDS auf 80 ml PBS pH 7-8 geben und das Volumen auf 100 ml einstellen. Alle hochprozentigen SDS-Lösungen über 20 °C warm halten die Lösungen sollten leicht ausfallen.
EZ-Link Iodacetyl-LC-BiotinPierce21333Bereiten Sie 1 mg/ml Stammlösung vor, indem Sie 50 mg Iodacetyl-Biotin in 50 ml DMF auflösen. Durch die sanfte Erwärmung wird die Solubilisierung verbessert. Bei 4 Grad lagern; C in Aliquoten von 1 ml. Erzeugt eine irreversible, thiolspezifische Biotinylierung.
Phosphatpuffer KochsalzlösungGibco10010-015
Dot-Blot-Blocking-PufferMischen Sie 20 ml 20% SDS mit 20 ml 1 x PBS pH 7-8 und fügen Sie EDTA bis zur Endkonzentration von 1 mM hinzu.
Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase Vector LaboratoriesSA5004Bei -20 & °C lagern. Mischen Sie 10 ml 20% SDS mit 10 ml 1 x PBS. Addieren Sie 20 μ l Streptavidin-HRP vor der Anwendung.
ECL-ReagenzGE HealthcareRNP2109gemäß den Anweisungen des Herstellers verwenden.
Super RX, X-RA Film, 18x24 cmFujifilm47410 19236
μ Macs Streptavidin KitMiltenyi130-074-101Lagern Sie die Kügelchen bei 4 °C.
Tween 20SigmaP1379
Waschpuffer100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,1% Tween 20 in nukleasefreiem H2O.
Dithiothreitol (DTT)Sigma43817Als 100 mM DTT in nukleasefreiem H2O zubereiten, vor Gebrauch immer frisch zubereiten.
RNeasy MinElute KitQiagen74204Lagern Sie Säulen bei 4 > C, die restlichen Bestandteile des Kits bei Raumtemperatur.
1,5 ml Schraubhülsen aus PolypropylenSarstedt72.692.005Kompatibel mit Dimethylformamid
2,0 ml Röhrchen aus Polypropylen mit SchraubverschlussSarstedt72.694.005Kompatibel mit Dimethylformamid
15 ml RöhrchenBD Falcon352096Kompatibel mit Dimethylformamid
50 ml RöhrchenBD Falcon352070Kompatibel mit Dimethylformamid
Alle Lösungen/Reagenzien sollten bei Raumtemperatur gelagert werden, sofern nicht anders angegeben.
Ausrüstung
UV/VIS-SpektralphotometerThermo ScientificNanoDrop 1000oder gleichwertig. Verwenden Sie eine geringe Lautstärke (1-2 μ l) für Messungen niedriger RNA-Konzentrationen, um übermäßige Probenverluste zu vermeiden.
15-ml-Zentrifugenröhrchen aus PolypropylenVWR International525-0153Im Gegensatz zu Standard-15-ml-Röhrchen vertragen diese bis zu 15.000 × g
HochgeschwindigkeitszentrifugeBeckman CoulterAvanti J-25Oder gleichwertige Geräte, die 13.000× erreichen können; g
HochgeschwindigkeitsrotorBeckman CoulterJLA-16250Oder gleichwertige Ausrüstung, die 13.000× erreichen kann; g
Adapter für 15 ml GefäßeLaborgerä te Beranek356964Oder gleichwertige Ausrüstung, die 13.000× erreichen kann; g
Gekühlte TischzentrifugeEppendorf5430 ROder gleichwertig.
ThermomixerEppendorfThermomixer compactOder gleichwertig.
MagnetständerMiltenyi Biotec130-042-109Ein Ständer fasst 8 μm; Macs-Spalten.
WasserbadGrantSUB Aqua 5oder gleichwertig.
Ultrafeine MensurA& DGR-202oder gleichwertig.
E-Gel iBase Power SystemInvitrogenG6400UKFür RNA-Gele; oder gleichwertig.
E-Gel EX 1% Agarose-FertiggeleInvitrogenG4020-01Für RNA-Gele; oder gleichwertig.

Referenzen

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