Mitochondrien-assoziierte ER Membranen (MAMs) und Glycosphingolipid Angereichert Mikrodomänen (GEM): Isolation aus Mäusehirn

Zusammenfassung

Dieser Vorgang zeigt, wie aus dem erwachsenen Gehirn der Maus die Mitochondrien-assoziierte ER Membranen oder MAMs und den Glykosphingolipid angereicherten Mikrodomänen Fraktionen aus MAMs und mitochondrialen Vorbereitungen zu isolieren.

Zusammenfassung

Intrazellulären Organellen sind hochdynamische Strukturen mit unterschiedlicher Form und Zusammensetzung, die Zell-spezifischen intrinsischen und extrinsischen Hinweise ausgesetzt sind. Ihre Membranen werden häufig an definierten Kontaktstellen, die Naben für den Austausch von Signalmolekülen und Membrankomponenten ^1,2,3,4 geworden gegenübergestellt. Die miteinander organellären Membranmikrodomänen, die zwischen dem endoplasmatischen Retikulum (ER) und den Mitochondrien bei der Öffnung des IP3-Ca ^{2 +-Kanal} als den Mitochondrien-ER zugehörigen Membranen oder MAMs ^4,5,6 bekannt sind ausgebildet sind. Das Protein / Lipid-Zusammensetzung und biochemischen Eigenschaften dieser Membran Kontaktstellen wurden ausgiebig insbesondere in Bezug auf ihre Rolle bei der Regulierung der intrazellulären Ca ^{2 + 4,5,6} untersucht. Die ER dient als primären Speicher von intrazellulärem Ca ^{2 +,} und reguliert in diesem Rahmen eine Vielzahl von zellulären Prozessen stromabwärts von Ca ^{2 +-Signalisierung,} inkl.uding posttranslationale Proteinfaltung und Protein maturation7. Mitochondrien, auf der anderen Seite aufrechtzuerhalten Ca ^{2 +-Homöostase} durch Puffern zytosolischen Ca ^{2 +-Konzentration} wodurch die Einleitung Apoptosewege stromabwärts von Ca ^{2 + 4,8} Unwucht. Der dynamische Charakter der MAMs macht sie zu idealen Standorte, um grundlegende zelluläre Mechanismen, einschließlich Ca ^{2 +-Signalisierung} und Regulation der mitochondrialen Ca ^{2 +-Konzentration,} Lipid-Biosynthese und Transport, Energiestoffwechsel und das Überleben der Zelle ^4,9,10,11,12 sezieren. Mehrere Protokolle wurden für die Reinigung dieser Mikrodomänen aus Lebergewebe und kultivierten Zellen ^13,14 beschrieben.

Unter zuvor publizierten Methoden in Betracht, haben wir ein Protokoll für die Isolierung von Mitochondrien und MAMs vom erwachsenen Mäusehirn angepasst. Um dieses Verfahren haben wir eine zusätzliche Reinigungsstufe, nämlich ein Triton X100 Extraktion hinzugefügt, die enables die Isolierung des Glycosphingolipid angereicherten Mikrodomäne (GEM) Bruchteil der MAMs. Diese Zubereitungen GEM teilen sich mehrere Proteinkomponenten mit Caveolae und Lipidflößen, aus der Plasmamembran oder anderen intrazellulären Membranen abgeleitet und vorgeschlagen, als Sammelpunkte für die Bündelung von Rezeptorproteinen und für Protein-Protein-Wechselwirkungen ^4,15 funktionieren.

Protokoll

Das folgende Protokoll ist für die Isolierung und Aufreinigung von MAMs und Edelsteine ​​aus Maushirn bestimmt

Lösungen für die Isolierung von Mitochondrien, MAMs und Edelsteine ​​benötigt

Fraktionierung, um rohes mitochondrialen Präparation zu erhalten:

Lösung A: 0,32 M Saccharose, 1 mM NaHCO _3, 1 mM MgCl _2, 0,5 mM CaCl ₂ + Protease-Inhibitoren (add frisch, je nach Bedarf)

Lösung B: 0,32 M Saccharose, 1 mM NaHCO ₃ + Protease-Inhibitoren (add frisch, je nach Bedarf)

Ergebnisse

Basierend auf unserer Erfahrung mit der Verwendung dieses Protokoll können wir sicher empfehlen es für die Isolierung und Reinigung von MAMs, Edelsteine ​​und mitochondriale Fraktionen aus Mäusehirn. Das Verfahren wie oben in hohem Maße reproduzierbar und konsistent. In Abbildung 1 zeigen wir ein repräsentatives Bild des Weges pure Mitochondrien und MAMs Schicht auf einem Percoll-Gradienten (Schritt 3,4). Eine definierte, milchige Band enthaltenden gereinigten Mitochondrien (Mito-P) segregiert am untere.......

Diskussion

Die Stellen des Kontakts zwischen intrazellulären Membranen oder zwischen Organellen und der Plasmamembran von Zellen repräsentieren dynamischen Signalisierung Plattformen für grundlegende zelluläre Prozesse. Die genaue Charakterisierung ihrer Funktion und Zusammensetzung sowohl unter physiologischen und pathologischen Bedingungen erfordert zuverlässige und reproduzierbare Reinigung Protokolle. Die Verfahren detailliert hier wurden speziell von unserem Labor zur Isolierung und Aufreinigung der MAMs und ihre entsprechend.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenz / Material	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
			REAGENZIEN
			Fraktionierung
Saccharose	Fisher Scientific	S5-500
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S-5761
Magnesiumchlorid, Hexahydrate	Fisher Scientific	BP214-500
Calciumchlorid, Dihydrat	Sigma-Aldrich	C-5080
			MAM
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M9546-250G
Hepes	Fisher Scientific	BP310-500
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378-250G
BSA, Fraktion V, Heat Shock, Lyophilisat	Roche	03-116-964-001
Percoll	GE	17-0891-02
			GEM
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500 ml
Kochsalz	Fisher Scientific	S271-3
Tris Base	Roche	03-118-142-001
HCl	Fisher Scientific	A144S-500
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Fisher Scientific	BP166-500
			Gemeinsam
Protease-Inhibitoren Tablets, Complete EDTA-free	Roche	11-873-580-001
			EQUIPMENT
2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders	Kimble Chase	885300-0002
15 ml Polypropylen Konische Zentrifugenröhrchen, BD Falcon	BD	352097
30 ml Round-Bottom Glass Zentrifugenröhrchen	Kimble Chase	45500-30
15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes	Kimble Chase	45500-15
Ultrazentrifuge Röhren, Ultra-Clear, Thinwall, 14x89 mm	Beckman-Coulter	344059
Parafilm	Cole-Parmer	PM996
Einweg-Flaschen aus Glas Pasteur Pipetten, 9 "	Fisher Scientific	13-678-20C