Method Article

Mikrofluidik-basierten electrotaxis für On-Demand-Quantitative Analyse von Caenorhabditis elegans 'Locomotion

DOI:

10.3791/50226

⸱

May 2nd, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, McMaster University , 2Department of Mechanical Engineering, McMaster University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine halbautomatische mikroelektromechanischen fluidischen Verfahren zur On-Demand-Fortbewegung in induzieren Caenorhabditis elegans Beschrieben. Diese Methode basiert auf dem Phänomen der neurophysiologischen Reaktion auf Würmer milden elektrischen Feldern ("electrotaxis") in mikrofluidischen Kanälen basiert. Microfluidic electrotaxis dient als schnelle, empfindliche, kostengünstige und skalierbare Technik zum Screening auf Faktoren, die neuronalen Gesundheit.

Abstract

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Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist ein vielseitiges Modell für biomedizinische Forschung wegen seiner Erhaltung der krankheitsbedingten Gene und Signalwege sowie seiner einfachen Anbau. Mehrere C. elegans Erkrankungsmodellen berichtet worden, wie neurodegenerative Erkrankungen wie Parkinson-Krankheit (PD), welche die Degeneration dopaminerger (DA) Neuronen 1 umfasst. Beide Transgene und neurotoxische Chemikalien verwendet worden, um DA Neurodegeneration und damit verbundene Bewegung Defekte in Würmern zu induzieren, so dass für Untersuchungen der Grundlage der Neurodegeneration und Bildschirme für neuroprotektive Gene und Verbindungen 2,3.

Screens in niederen Eukaryoten wie C. elegans stellen ein effizientes und wirtschaftliches Mittel, um Verbindungen und Gene, die neuronale Signalübertragung identifizieren. Herkömmliche Bildschirme sind in der Regel manuell durchgeführt und erzielte durch visuelle Inspektion, folglich sind sie Zeit-consuming und anfällig für menschliche Fehler. Zusätzlich sind die meisten konzentrieren sich auf zellulärer Ebene Analyse unter Ignorierung Fortbewegung, ist das ein besonders wichtiger Parameter für Bewegungsstörungen.

Wir haben einen neuen mikrofluidischen Screening-System (Abbildung 1), die quantifiziert und steuert C entwickelt elegans 'Fortbewegung mit elektrischen Feldes innerhalb Mikrokanäle Reize. Wir haben gezeigt, dass ein Gleichstrom (DC)-Feld kann robust on-demand Fortbewegung in Richtung der Kathode ("electrotaxis") 4 induzieren. Umkehrung des Feldes Polarität der Wurm schnell seine Richtung umzukehren als gut. Wir haben auch gezeigt, dass Defekte in dopaminergen und anderen sensorischen Neuronen den Swimming Antwort 5 ändern. Daher kann Anomalien in neuronalen Signalübertragung ermittelt Fortbewegung als read-out werden. Die Bewegung Antwort kann genau quantifiziert werden mit einer Reihe von Parametern wie Geschwindigkeit Schwimmen, Körper Biegeeigenfrequenz und Wendezeit.

4 Larven. Diese Erkenntnisse führten wir eine neue Mikrofluidikvorrichtung passiv sortieren Würmer nach Alter und Phänotyp 6 entwerfen.

Wir haben auch die Reaktion der Würmer gepulsten DC getestet und Wechselstrom (AC) elektrische Felder. Pulsed DC Felder der verschiedenen Arbeitszyklen effektiv erzeugt electrotaxis sowohl in C. elegans und seinen Cousin C. briggsae 7. In einem anderen Experiment immobilisiert symmetrisch Wechselfelder mit einer Frequenz von 1 Hz bis 3 KHz Würmer in den Kanal 8.

Umsetzung des elektrischen Feldes in einem mikrofluidischen Umgebung ermöglicht eine schnelle und automatisierte Ausführung des electrotaxis Assay. Dieser Ansatz verspricht hohen Durchsatz genetischen und chemischen Faktoren für Bildschirme erleichternbeeinflussen neuronale Funktion und Lebensfähigkeit.

Protocol

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1. Photolithographie für Master Mold Fabrication

  1. Bathe eine 3 Zoll Siliziumwafer in Aceton 30 sec und dann mit Methanol für 30 sek. Spülen Sie mit dH 2 0 Wasser für 5 min.
  2. Trocknen Sie die Oberfläche des Wafers mit einem N2 Blaspistole. Erhitzen des Wafers auf einer heißen Platte bei 140 ° C für 2 min.
  3. Plasma die Oxidation der Oberfläche des Silizium-Wafers (1 min, 50 W).
  4. Spin-Mantel der Oberfläche des Wafers mit 3 ml SU-8 Fotolack 100 (40 sec; 1.750 rpm).
  5. Pre-Bake der beschichtete Wafer auf einer Heizplatte bei 65 ° C für 10 min, dann die Rampe die Temperatur bis zu 95 ° C über 2 min. Halten Sie diese Einstellung für eine zusätzliche 1 Stunde.
  6. Richten Sie ein Photomaske mit dem gewünschten Kanal Design. Freilegen zu 550-600 mJ / cm 2 UV-Licht (350-400 nm) zu widerstehen. Photomasks können in AutoCAD entworfen und gedruckt auf einer Transparenz mit hoher Druckauflösung.
  7. Nachhärten des Wafers auf einer heißen Platte bei 65 ° C für 1 min und 95 ° C für 10 min, Rampen ter Temperatur wie zuvor.
  8. Tauchen Sie den Wafer in SU-8-Entwickler-Lösung für 10-15 min. Überprüfen Sie für die Fertigstellung der Entwicklung durch Spülen mit Isopropanol. Wenn ein weißer Niederschlag erscheint, weiter zu entwickeln. Die Master-Form ist in 2A gezeigt.

2. Soft-Lithographie für Microchannel Fabrication

  1. Mischen 35 ml Polydimethylsiloxan (PDMS) Elastomerbasis mit 3,5 ml PDMS Härtungsmittel.
  2. Setzen Sie den Master hergestellt Form (Muster nach oben) und eine leere Siliziumwafer in Petrischalen mit Alufolie ausgekleidet.
  3. Gießen Sie 20 ml PDMS Prepolymer in die Urform Schale und 15 ml in das zweite Gericht. Beseitigen Sie Lufteinschlüsse unter den Wafern durch leichten Druck auf sie mit einem Einweg-Holz-Applikator.
  4. Titelbild beide Gerichte und beiseite für einen Tag, um zu heilen. Alternativ zur schnelleren Aushärtung entfernen Luftblasen aus dem PDMS mit einem Vakuumentgaseranlage und verlassen dann die Gerichte auf einer Heizplatte bei 80 ° C für 2hr.
  5. Entfernen Sie die Folie und schälen die PDMS von den Wafern.
  6. Verwenden Sie die Harris Uni-Core (2,5 mm), um Flüssigkeit Access Ports an beiden Enden des Kanals zu stanzen. Schneiden Sie den Kanal und leere PDMS in ähnlich große Streifen schneiden.
  7. Legen Sie den Kanal, den Rohling PDMS-Streifen und einen Glasträger (75 × 25 mm 2) in ein Plasma Oxidationsmittel, wahrscheinlich in einem Reinraum befindet. Expose zum Sauerstoff-Plasma für 40 sec bei 40 W Leistung.
  8. Haften die Kanalstück und Objektträger auf gegenüberliegenden Seiten des Rohlings Streifen. Beiseite für 2 Stunden, um die Bindung zu vervollständigen.
  9. Legen Sie die Baugruppe auf einer Heizplatte bei 120 ° C. Befestigen Kunststoffschlauch (Innendurchmesser 1/32 ", Außendurchmesser 3/32"), die jeweils mindestens 6 mm lang, um die ausgestanzten Behältern mit PDMS Prepolymer. Bringen Sie eine fluidische Kunststoff-Stecker auf eine oder beide Röhren Spritze Befestigung ermöglichen, oder verwenden Sie handelsübliche Armaturen.
  10. Lassen Sie das PDMS Sicherung der Schlauch zu heilen. Legen Sie 3 "Längen von 22-Gauge-isoliertem Kupferdraht in each Reservoir, zwischen dem Eingang und dem Rohr-Kanal und sicher mit PDMS Prepolymer. Das fertige Produkt wird in 2B gezeigt.

3. Electrotaxis Experiment

  1. Legen Sie die Mikrokanalstruktur auf der Bühne (vorzugsweise XY-bewegliche) eines Mikroskops mit einer fest montierten Kamera mit einem Monitor verbunden (Abbildung 1).
  2. Schließen Sie das Netzteil oder Ausgang des Verstärkers Drähte an der Mikrokanalstruktur der Elektroden. Eine einfache Gleichstromversorgung nicht ausreichend, wenn nur ein DC-Signal gewünscht wird, sondern ein Verstärker, der mit einem Funktionsgenerator ermöglicht Einsatz von gepulsten DC-und AC-Signale als auch.
  3. Bringen Sie die Mikrokanalstruktur den Ausgang Rohr zu einer Einwegspritze. Tauchen der Mund des Einlaßrohres in M9 physiologischen Puffer und sanft streben Flüssigkeit in dem Kanal durch Anlegen eines Unterdrucks im Inneren der Spritze (entweder manuell oder unter Verwendung einer Spritzenpumpe). Wenn die Ein-und Auslass Rohre sowohl mit M9 gefüllt, ziehen Sie die Spritze from die Röhre. Wert, den beide Rohre auf die gleiche Höhe hydrostatisch angetriebene Strömung zu verhindern.
  4. Anwenden einer Gleichspannung an den Kanal und zu gewährleisten, dass der Widerstand (R = V / I) beträgt etwa 0,6 MOhm (für eine 50 mm lang, 0,3 mm breit und 0,1 mm tief ~ Mikrokanal).
  5. Wenn mit dem Kanal die Integrität erfüllt, befolgen Sie die obigen Schritte, um Würmer aus einer verdünnten Suspension laden in den Kanal.
  6. Trennen Sie die Spritze und hydrostatisch manipulieren die durch Einstellen der Röhrchen relative Höhe. Verwenden Sie diese Methode, um einen Wurm in der Mitte des Kanals zu platzieren und dann legen die beiden Rohre flach auf der gleichen Höhe.
  7. Stellen Sie die Stromversorgung auf die entsprechende Spannung: 4-12 V / cm für L3 Stadium Tiere, 4-10 V / cm für L4s und 2-4 V / cm für junge Erwachsene. Aktivieren Sie das elektrische Signal und damit 1 min von Vorbelichtung für die Schnecke auf dem Gebiet akklimatisieren. Der Wurm sollte beginnen, sich in Richtung der Kathode. Wenn die Minute vergangen ist, verwenden Sie die Kamera, um die Aufnahme zu starten.
  8. Für AC-und Impuls-d DC Experimente, die maximale Reaktion elektrische Feld kann von oben und von Frequenz und Tastverhältnis des Signals angenommen werden kann wie gewünscht moduliert 7, 8.
  9. Als Experiment beendet ist, entfernen Sie alle Flüssigkeit (und Würmer) aus dem Kanal, spülen Sie es mit dH 2 0, und lassen Sie das Gerät auf einer Heizplatte bei 125 ° C zu trocknen.
  10. Auszug Bewegungsapparates Daten von aufgenommenen Videos manuell mit NIH ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) oder benutzerdefinierte MATLAB-basierten Wurm-Tracking-Software.

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Results

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Eine repräsentative Video von einem Wildtyp-young adult Nematoden electrotaxis und ihre Position und Geschwindigkeit Ausgänge von der Schnecke Tracking-Software sind in Ergänzende Video 1 und Abbildung 3 dargestellt. Die Bewegungsanalyse-Software selbst nicht erkennt die Richtung des Feldes Polarität und die Zeit der Umpolung, sondern müssen diese Informationen von der Quelle Video erhalten werden. Dies könnte mit Hilfe eines Audio-oder visuellen Hinweis in der Video-oder aufzuschreiben...

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Discussion

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Unter Ausnutzung der Verhaltens-Phänomen erstmals von Gabel und Kollegen und Gebäude auf dem dielektrophoretischen Manipulation Arbeit von Chuang und Kollegen 11,12 beschrieben, stellt unsere Mikrofluidik-basierten electrotaxis Assay eine einfache, robuste und sensitive Methode, um neuronale Aktivität in Worms mit Bewegung als Sonde einen Ausgang. Die Analyse der Parameter der Bewegung ermöglicht quantitative Vergleich zwischen verschiedenen Genotypen. Die Präzision der Fertigung und Mikrokanalstruktur elektr...

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Disclosures

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Die mikrofluidischen electrotaxis Assay-Technologie ist zum Patent wurde in den Vereinigten Staaten von Amerika und Kanada eingereicht.

Acknowledgements

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Die Autoren bedanken sich bei den Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Canada Research Chairs Programm, Canadian Institutes of Health Research und Ontario Ministerium für Forschung und Innovation durch ihre frühe Forscher Award Programm für die finanzielle Unterstützung bedanken.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonCALEDON Labs1200-1-30
MethanolCALEDON Labs6700-1-30
IsopropanolCALEDON Labs8600-1-40
SU-8Microchem Corp.Y131273SU-8 100
SU-8 EntwicklerMicrochem Corp.
92x16mm PetrischaleSarstedt82.1473.001
Sylgard 184 Silikon Elastomer KitDow CorningEnthält Elastomerbasis und Härter
FunktionsgeneratorTektronix Inc.Modell AFG3022B
VerstärkerTrek Inc.Modell 2210-CE
SpritzenpumpeHarvard Apparatur70-4506Modell 11 ELITE
HeizplatteFisher Scientific11675916QModell HP131725Q
Y020100

References

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