Large Scale Non gezielte Metabolomic Profiling von Serum von Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Zusammenfassung

Die nicht-gezielte Erstellung von Metabolitenprofilen durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in Verbindung mit Massenspektrometrie (UPLC-MS) ist eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung des Stoffwechsels. In diesem Artikel wird ein typischer Arbeitsablauf für die Erstellung von nicht-zielgerichteten Metabolitenprofilen von Serum beschrieben, einschließlich Probenorganisation und -vorbereitung, Datenerfassung, Datenanalyse, Qualitätskontrolle und Metabolitenidentifizierung.

Zusammenfassung

Die nicht-gezielte Erstellung von Metabolitenprofilen durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in Verbindung mit Massenspektrometrie (UPLC-MS) ist eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung des Stoffwechsels. Der Ansatz bietet eine unvoreingenommene und tiefgehende Analyse, die die Entwicklung diagnostischer Tests und neuartiger Therapien ermöglichen und unser Verständnis von Krankheitsprozessen verbessern kann. Die inhärente chemische Vielfalt des Metaboloms stellt erhebliche analytische Herausforderungen dar, und es gibt keinen einzigen experimentellen Ansatz, der alle Metaboliten nachweisen kann. Darüber hinaus erfordert die biologische Variation des individuellen Stoffwechsels und die Abhängigkeit des Stoffwechsels von Umweltfaktoren große Stichprobenzahlen, um die für eine aussagekräftige biologische Interpretation erforderliche statistische Aussagekraft zu erreichen. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, skizziert dieses Tutorial einen analytischen Arbeitsablauf für die groß angelegte nicht-zielgerichtete Metabolitenprofilierung von Serum mittels UPLC-MS. Das Verfahren umfasst Richtlinien für die Probenorganisation und -vorbereitung, die Datenerfassung, die Qualitätskontrolle und die Identifizierung von Metaboliten und wird eine zuverlässige Datenerfassung für große Experimente ermöglichen und einen Ausgangspunkt für Laboratorien bieten, die noch keine Erfahrung mit der Erstellung von nicht-zielgerichteten Metabolitenprofilen durch UPLC-MS haben.

Einleitung

Der Begriff "Metabolomik" kann viele Dinge umfassen. Zum Beispiel kann ein Metabolomik-Experiment mit einer Vielzahl von analytischen Plattformen wie NMR und sowohl Gas- und/oder Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit Massenspektrometrie durchgeführt werden. Darüber hinaus können Metabolomik-Experimente gezielt oder nicht zielgerichtet oder in einer Kombination aus beidem durchgeführt werden. Ein gezieltes Metabolomik-Experiment beinhaltet die gerichtete Analyse einer Gruppe von Molekülen, die für die vorliegende biologische Fragestellung wichtig sind (z. B. ermöglichen kleine Moleküle, die am TCA-Zyklus beteiligt sind, eine genaue Quantifizierung d....

Protokoll

1. Organisation von Beispielen

1. Um eine Plattenkarte für die Probenvorbereitung in einer Tabelle zu erstellen, geben Sie in der ersten Spalte eine Probenliste in der Reihenfolge des Ladens ein. Geben Sie in einer zweiten Spalte die Positionen der 96-Well-Platten mit der korrekten Nomenklatur für Ihre Autosampler-Software ein.
2. Bewahren Sie eine Vertiefung in jeder Platte für QC-Proben auf.
3. Wenn Ihr LC-Autosampler mit zwei Platten gleichzeitig umgehen kann, teilen Sie die Probenliste in Chargen von 190 auf und speichern Sie diese Informationen in einem zweiten Arbeitsblatt.
4. Verwenden Sie in jedem dieser Stapel die Zufallsfunktion....

Ergebnisse

Die grundlegenden analytischen Schritte eines nicht-zielgerichteten Metabolitenprofiling-Experiments mittels UPLC-MS sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Rohdaten jeder Probe können als Basissignal-Chromatogramm visualisiert werden. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel eines Basissignal-Chromatogramms einer Serumprobe, analysiert mit dem Gradientenoption (a) aus dem Tutorial. Nach der statistischen Analyse, wie oben beschrieben, wird die Identifizierung aller statistisch signifikanten molekula.......

Diskussion

Dieses Tutorial soll als Ausgangspunkt für die Durchführung groß angelegter nicht-zielgerichteter Metaboliten-Profilierung mittels UPLC-MS dienen. Der Arbeitsablauf konzentriert sich auf Metaboliten, die mit einem wässrigen Methanollösungsmittel extrahiert, auf einer C8- oder C18-UPLC-Säule zurückgehalten und als positive Ionen nachgewiesen werden können. In der Situation, in der es keine vorgegebene Verzerrung gegenüber einer bestimmten Metabolitenklasse gibt und eine Hypothese zur Erstellung eines globalen Profils gewü.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
96-Well-Platten - 500 μ l Wells	VWR	40002-020	Diese werden für die Probenvorbereitung
verwendet 96 Well Plattenmatten	VWR	89026-514	Diese werden für die Probenvorbereitung
verwendet 96 Well Platten - 350 μ l Brunnen	Waters Corporation	WAT058943	Diese werden für die Probeninjektion
96 Well Plattenmatten	Waters Corporation	186000857	Diese werden für die Probeninjektion verwendet
96 Well Platten Heißsiegel	Waters Corporation	186002789	Diese können für die Probeninjektion oder Langzeitlagerung verwendet werden
96 Well Platte Heißsiegel	Waters Corporation	186002786
Methanol in LC-MS-Qualität	Fluka	34966
Acetonitril in LC-MS-Qualität	Fluka	34967
LC-MS-Qualität aater	Fluka	39253
Ameisensäure in LC-MS-Qualität	Fluka	56302
Elektronische Mehrkanalpipette	VWR	89000-674
Pipettenspitzen	Eclipse (gekauft über Light Labs)	B-5061/B-4061
Kühlzentrifuge - Allegra X-12R	Beckman Coulter	N/A - Kontakt Beckman Coulter
Acquity Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) System	Waters Corporation	N/A - Kontakt Waters Corporation
UPLC C8 Säule (Gradientenoption a)	Waters Corporation	186002876
UplC T3 Säule (Gradientenoption b)	Wasser Corporation	186003536
Xevo G2 Q-TOF Massenspektrometer	Waters Corporation	N/A - Kontakt Waters Corporation

verwendet