Hochdurchsatz-selektiven 2-Hydroxyl-Acylierung durch Primer-Extension (FORM) analysiert verwendet einen neuartigen chemischen Tastertechnologie, reverse Transkription, Kapillarelektrophorese und Sekundärstrukturvorhersage Software, um die Strukturen der RNAs, die von mehreren hundert bis zu mehreren tausend bestimmen Nukleotide an Einzel-Nukleotid-Auflösung.
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Methodenartikel
RNA Secondary Structure Prediction Mit High-Throughput-SHAPE
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Verständnis der Funktion der RNA in biologischen Prozessen beteiligt erfordert eine gründliche Kenntnis der RNA-Struktur. Zu diesem Zweck wird die Methodik genannt "High-Throughput-selektive 2-Hydroxyl Acylierung durch Primer-Extension analysiert", oder SHAPE ermöglicht Vorhersage von RNA Sekundärstruktur mit Einzel-Nukleotid-Auflösung. Dieser Ansatz nutzt chemische Sondierung Mittel, die Acylierung bevorzugt einzelsträngig oder flexiblen Bereiche der RNA in wässriger Lösung. Seiten der chemischen Modifizierung durch reverse Transkription der RNA modifiziert detektiert und die Produkte dieser Reaktion sind fraktioniert automatisierten Kapillarelektrophorese (CE). Seit Reverse Transkriptase Pausen an diesen RNA Nukleotide durch die Form Reagenzien modifiziert, die resultierende cDNA-Bibliothek indirekt abbildet diese Ribonukleotiden die einzigen im Rahmen der gefalteten RNA gestrandet sind. Mit ShapeFinder Software werden die Elektropherogrammen durch automatisierte CE produziert verarbeitet und in nugonucleotid Reaktivität Tabellen, die sich in Pseudo-Energie-Einschränkungen in der RNAStructure (v5.3) Vorhersage-Algorithmus verwendet wird, umgewandelt. Die zweidimensionalen RNA-Strukturen durch die Kombination FORM Sondieren mit in silico RNA Sekundärstrukturvorhersage erhalten haben, wurde festgestellt, dass viel genauer als Strukturen erhalten mit beiden Methoden allein.
Einleitung
Um die Funktionen der katalytischen und nicht-kodierende RNAs bei der Regulation der Spleißen, Übersetzung, Virusreplikation und Krebs beteiligt zu verstehen, ist eine genaue Kenntnis der RNA-Struktur 1,2 erforderlich. Leider stellt genaue Vorhersage der RNA-Faltung eine gewaltige Herausforderung. Klassische Sondieren Mittel leiden viele Nachteile, wie Toxizität, unvollständige Nucleotidsequenz Abdeckung und / oder den Durchsatz beschränkt auf 100-150 Nukleotide pro Versuch. Unaided Sekundärstruktur Vorhersage-Algorithmen sind ähnlich nachteilig wegen Ungenauigkeiten aufgrund ihrer Unfähigkeit, effektiv unter energetisch ähnlichen Strukturen zu unterscheid....
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Protokoll
Primer-Design und Erweiterung des RNA 3'-Terminus
Um lange RNAs durch High-Throughput-SHAPE analysieren, sollte eine Reihe von Websites, Primer-Hybridisierung so gewählt, dass sie (i) von ~ 300 nt getrennt sind, (ii) sind 20-30 nt Länge, und (iii) dass RNA / werden DNA-Hybride durch Glühen DNA zu diesen Seiten erzeugt eine erwartete Schmelztemperatur> 50 ° C. Darüber hinaus sollte Segmente RNA, die voraussichtlich stark strukturiert werden, vermieden werden, obwohl eine solche Feststellung erfordert eine gewisse Vorkenntnis der RNA-Struktur, die oft nicht verfügbar ist. DNA-Primer, die zu diesen Websites hybridisieren sollte dann entwick....
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Ergebnisse
RNA, die die HIV-1-rev-Response-Element (RRE) und eine 3'-terminale Struktur Kassette 4 aus einem linearisierten Plasmid durch in vitro Transkription hergestellt, wonach es durch Erhitzen, Kühlen, und die Inkubation wurde bei 37 ° gefaltet C in Gegenwart MgCl 2. RNA wurde NMIA belichtet und dann von einem 5'-Ende markierten DNA-Primer hybridisiert das 3'-terminale Struktur Kassette revers transkribiert. Die resultierende Form cDNA-Bibliothek, zusammen mit Steuerungs-und Sequenz.......
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Diskussion
Wir stellen Ihnen hier eine detaillierte Protokoll für High-Throughput-SHAPE, eine Technik, die sekundäre Struktur Bestimmung erlaubt single-nucleotide Auflösung für RNAs jeder Größe. Außerdem Kopplung experimentellen Daten mit SHAPE Sekundärstruktur Vorhersage-Algorithmen ermöglicht Generation von RNA 2D-Modelle mit einem höheren Grad an Genauigkeit, als es mit beiden Methoden allein. Die Kombination von fluoreszenzmarkierten Primern und automatisierte CE bietet erhebliche Vorteile gegenüber dem herkömmlichen Gel-Basis.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
S. Lusvarghi, J. Sztuba-Solinska, KJ Purzycka, JW Rausch und SFJ Le Grice werden durch die Interne Research Program des National Cancer Institute, National Institutes of Health, USA unterstützt.
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Materialien
Vom Benutzer bereitgestellte Materialien
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| N-methylisatoic anhydride (NMIA) | Life technologies | M25 | In wasserfreiem DMSO |
| 1-Methyl-t-nitroisatosäureanhydrid (1M7) | siehe Ref. 22 | ||
| Hochgestellte III Reverse Transkriptase | Life Technologies | 18080044 | 10.000 Einheiten |
| Thermo-Sequenzidase-Zyklus-Sequenzierungskit | Affymetrix | 78500< | |
| RNA von Interesse | 6 pmol pro Reaktion (die Nachweisgrenze wird vom Gerät bestimmt) | ||
| Sätze von vier 5'-markierten Primern (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 und WellRed D1/Licor IR800) | Primer sind komplementär zur RNA und werden in reversen Transkriptions- und Sequenzierungsreaktionen verwendet. Die aufgeführten Fluorophore sind optimal für das Beckman Coulter 8000 CEQ. Primer können gekauft oder im eigenen Haus synthetisiert werden. | ||
| DNA-Matrizen-DNA | wird für Sequenzierungsreaktionen verwendet und muss die Sequenz der zu untersuchenden RNA enthalten - einschließlich einer etwaigen 3'-terminalen Erweiterung, falls vorhanden. Gegebenenfalls ist es oft zweckmäßig, die RNA-Transkriptionsvorlage zu verwenden. | ||
| Buffers | |||
| 10x RNA-Renaturierungspuffer | 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 M KCl, 1 mM EDTA | ||
| 5X RNA-Faltungspuffer | 200 mM Tris-HCl pH 8,0, 25 mM MgCl2, 2,5 mM EDTA, 650 mM KCl. (Dieser Puffer kann je nach Fall (z.B. pH-Wert geändert werden, EDTA, Mg, RNase-Hemmer) | ||
| 2,5X RT-Mix | 4 μ l 5X Puffer, 1 μ l 100 mM DVB-T, 1,5 μ l Wasser,1 μ l 10 mM dNTPs, 0,5 μ l Hochscript III. Beachten Sie, dass der 5X-Puffer und das 100 mM DTT beim Kauf von SuperScript III (Invitrogen) mitgeliefert werden. | ||
| GenomeLab Probenladelösung (Beckman Coulter) | Achtung: Vermeiden Sie mehrere Frost-Tau-Zyklen | ||
| EQUIPMENT | |||
| Kapillarelektrophorese | Beckman | CEQ8000 | |
| Thermocycler | variiert |
Referenzen
- Scott, W. G., Martick, M., Chi, Y. I. Structure and function of regulatory RNA elements: ribozymes that regulate gene expression. Biochim. Biophys. Acta. 1789, 634-641 (2009).
- Moore, P. B., Steitz, T. A. The roles of RNA in the synthesis of protein. Cold Spring Harb. Perspect. Biol.....
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Nachdrucke und Genehmigungen
