Eine genaue, kurze, anspruchsvolle und billige Methode wird beschrieben, dass die Länge der Telomere beurteilt in verschiedenen Geweben und Spezies mit qRT-PCR. Darüber hinaus beschreiben wir einen einfachen Test zur Telomerase-Aktivität als ergänzende Rückgrat Test für die Länge der Telomere zu beurteilen.
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Methodenartikel
Telomere und Telomerase-Aktivität Länge; Ein Yin und Yang der Zellalterung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Telomere sind wiederholenden DNA-Sequenzen an den vorderen Enden der Chromosomen, die unterschiedlich sind in der Länge und im Menschen eine Länge von 15.000 Basenpaaren zu erreichen. Die Telomere dient als bio-Mechanismus des Chromosoms Abrieb bei jeder Zellteilung. Bei einer bestimmten Länge, werden die Telomere zu kurz, um die Replikation, ein Prozess, der auf Chromosom Instabilität oder Zelltod führen können zulassen. Abrieb und Dehnung: Telomere Länge wird durch zwei gegenläufige Mechanismen reguliert. Attrition tritt als jeder Zelle teilt. Im Gegensatz dazu ist Dehnung teilweise moduliert durch die Telomerase, die sich wiederholenden Sequenzen fügt an den Enden der Chromosomen. Auf diese Weise könnte möglicherweise Telomerase Reverse Mechanismus eine alternde und verjüngt die Lebensfähigkeit der Zellen. Dies sind entscheidende Elemente bei der Aufrechterhaltung der Lebensdauer der Zelle und werden verwendet, um die Zellalterung zu beurteilen. In diesem Manuskript beschreiben wir eine genaue, kurze, anspruchsvolle und billige Methode, um die Länge der Telomere in mehrere Gewebe beurteilens und Arten. Dieses Verfahren nutzt zwei zentrale Elemente, die Tandem-Repeat des Telomer-Sequenz und die Empfindlichkeit der qRT-PCR an Differential Kopienzahl der getesteten Proben zu erkennen. Darüber hinaus beschreiben wir einen einfachen Test zur Telomerase-Aktivität als ergänzende Rückgrat Test für die Länge der Telomere zu beurteilen.
Einleitung
Telomere sind wiederholenden DNA Hexamer (TTAGGG) Sequenzen an den Enden der Chromosomen gefunden. In jeder Zelle Replikation werden diese Chromosomen-Enden verkürzt. Wenn sie zu kurz werden, können Chromosomen unterziehen Telomerende Fusionen, anomale Rekombination und Abbau. So reicht die Länge der Telomere Wartung spielt eine wichtige Rolle in Chromosom Stabilität und Zellschutz 38. Telomere Länge Wartung ist auch entscheidend für die Gene in der Nähe der Enden der Chromosomen gefunden, da die DNA-Replikation kann nicht bis zum Ende der Chromosomen 1-2 fortzusetzen. Folglich kann Prävention von Telomerverkürzung verbessern Zelle Stabilität. <....
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Protokoll
1. Telomere Länge Protokoll 19
- DNA-Isolierung
Die meisten DNA Isolierungsverfahren verwendet werden. Unsere Lab zieht Qiagen DNeasy Kit (# 69506) für Blut Quellen. Je nach Quelle der DNA, wie zB bukkal oder anderen Quellen kann eine andere Isolierungsverfahren verwendet werden.
- Primer:
Alle Primer werden an einer Börse Konzentration 100pmoles/μl in PCR-Wasser verdünnt und bei -20 ° C bis zur Verwendung. Arbeiten Bestände Primer werden frisch zubereitet und sind bei 20 ° C gelagert für einen kurzen Zeitraum (ein paar Monate.) Standard-Primer für Telomere ....
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Ergebnisse
Ein Beispiel eines Telomerelänge qRT-PCR-Assay wird in Abbildung 1 gezeigt. Auf der oberen linken Seite, stellen Proben in rot und grün markiert den Standort der getesteten Probanden auf der 96-Well-Platte. Auf der oberen rechten Fensterbereich wird die Verstärkung Kurve demonstriert. Jedes Thema wird durch zwei Tests (Telomere und Single Copy Gen), die dreifach gemacht wird getestet. Aufgrund unterschiedlicher DNA-Kopien in den beiden Assays ausgewählter Individuen erzeugt, erreicht die Anzahl der Zykl.......
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Diskussion
Telomere Länge bietet eine einzigartige zelluläre Marker, um die gestressten und alternden Zelle zu studieren und bietet Einblicke in die Mechanismen des Alterns. Seit seiner Rolle in alternden hatte zunächst vorgeschlagen worden, eine Vielzahl von Studien wurden durchgeführt, über die Länge der Telomere zu altern, Langlebigkeit, altersbedingte Krankheiten, Krebs und Stress. Jahrzehntelang war der Goldstandard der Länge der Telomere Messungen Terminal Restriktionsfragmentanalyse mit Southern-Hybridisierung. Doch vor kur.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Quantitativer Telomerase-Nachweis | Allied Biotech | MT3012 | |
| Qiagen DNeasy Kit | Qiagen | 69506 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master, gebrauchsfertiger Heißstart-Reaktionsmix für die SYBR Green I-basierte Echtzeit-PCR mit dem LightCycler 480 Instrument | Roche Diagnostics 4707516 |
Referenzen
- Blackburn, E. H. Structure and Function of Telomeres. Nature. 350 (6319), 569-573 (1991).
- Gilson, E., Ségal-Bendirdjian, E. The Telomere Story or the Triumph of an Open-Minded. Research. Biochimie. 92 (4), 321-326 (2010).
- Wu, X., Amos, C. I., Zhu, Y., Zhao, H., Grossman, B. H., Shay, J. W.,....
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Nachdrucke und Genehmigungen
