Überwachung dendritische Zellen mit Migration 19 F / 1 H Magnetic Resonance Imaging

Zusammenfassung

Verfolgung von Zellen mittels MRT hat bemerkenswerte Aufmerksamkeit in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen. Dieses Protokoll beschreibt die Kennzeichnung von dendritischen Zellen mit Fluor ( ¹⁹ F)-reiche Teilchen, die in vivo Anwendung dieser Zellen, und Überwachen des Ausmaßes der Migration in die Lymphknoten mit ¹⁹ F / ¹ H MRI und ¹⁹ F MRS.

Zusammenfassung

Kontinuierliche Fortschritte in der nicht-invasiven bildgebenden Verfahren wie Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) haben stark unsere Fähigkeit, physiologische oder pathologische Prozesse in lebenden Organismen zu studieren verbessert. MRT erweist sich auch ein wertvolles Werkzeug für die Erfassung transplantierten Zellen in vivo sein. Initial Zellmarkierung Strategien für MRI gemacht Verwendung von Kontrastmitteln, die die MR-Relaxationszeiten beeinflussen (T1, T2, T2 *) und führen zu einer Erhöhung (T1) bzw. Abreicherung (T2 *) des Signals in dem markierten Zellen vorhanden sind. T2 * Verstärkungswirkstoffe wie ultrakleine Eisenoxid Agenten (USPIO) wurden eingesetzt, um die Zellwanderung und einige haben auch von der FDA für die klinische Anwendung zugelassen zu studieren. Ein Nachteil von T2 * Mittel ist die Schwierigkeit, das Signal Löschung durch den markierten Zellen von anderen Artefakten wie Blutgerinnsel, Mikro Blutungen oder Luftblasen erzeugt unterscheiden. In diesem Artikel beschreiben wir eine aufstrebende Technik für die Tracking-Zellen in vivo, dasswird zur Kennzeichnung der Zellen mit Fluor ⁽¹⁹ F)-reiche Partikel. Diese Partikel werden durch Emulgieren Perfluorcarbon (PFC)-Verbindungen und dann auf Label-Zellen, die anschließend durch ¹⁹ F MRI abgebildet werden können, erstellt. Wichtige Vorteile von PFC für Handy-Tracking in vivo include (i) das Fehlen von Kohlenstoff-gebundenen F ¹⁹ in vivo, die dann liefert Hintergrund-Bilder und komplette Zelle selectivityand (ii) die Möglichkeit, die Zelle, das durch ¹⁹ F MR-Spektroskopie quantifiziert .

Einleitung

Das Tracking von Zellen in vivo ist ein entscheidender Aspekt in mehreren Bereichen der Biomedizin. Hierzu sind invasive bildgebende Verfahren, die selektiv lokalisiert Zellen über einen längeren Zeitraum kann extrem wertvoll. Vor der Entwicklung von dreidimensionalen Magnetresonanz-Bildgebung (MRI), wurde die Verfolgung der Immun-Zellmigration mikroskopische Analysen oder Gewebeproben beschränkt. Handy-Tracking mit Hilfe von MRI hat immense Aufmerksamkeit in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen, nicht nur für das Studium Immunologen Immunzellen Verhalten in vivo, sondern auch für die klinische und die Stammzell-Forscher. Während Mitte der 90er Jahre, Nanopartikel die ersten Studien auf Eisenoxid ¹ initiiert eine Kaskade von Entwicklungen für die Verfolgung von Zellen mit MRT. Eisenoxid-Partikel verkürzen die MR-Relaxationszeit (T2 *) der markierten Zellen und damit Signal Erschöpfung in MR-Bildern. Eisenoxidteilchen zur Markierung Makrophagen ^2, Oligodendrozyten p eingesetztrogenitors ³ und viele andere Zelltypen. Einige dieser Partikel wurden ebenfalls klinisch von der FDA für die Kennzeichnung zelluläre Impfstoffe in Melanom-Patienten ⁴ genehmigt. Da in vivo oder ex vivo-Markierung von Zellen mit Eisenoxidteilchen stützt sich auf eine Verkürzung der T2 *-Signal, wobei letzteres auch etwa durch in vivo gebracht Anfälligkeit Zusammenhang T2 * Effekte wie Mikro Blutungen Eisenlagerstätten oder Luftblasen es könnte schwierig sein, markierten Zellen in vivo zu identifizieren aus anderen Hintergrund T2 *-Signal Aussterben ^5.

In diesem Artikel beschreiben wir eine Technik für die Verfolgung von dendritischen Zellen (DC) in vivo durch den Einsatz von ¹⁹ F / ¹ H Magnetresonanz-Tomographie (MRT). Diese Zelle Tracking-Technologie wurde erst im Jahr 2005 eingeführt, ^6, mehrere Jahre nach der ersten erkannte Anwendungen für ¹⁹ F in MRI worden war ⁷ gemeldet. Ein wichtiger ADVAntage von ¹⁹ F auf Eisenoxidpartikels Zellmarkierung ist die geringe biologische Auftreten von ¹⁹ F in Gewebe, das macht es möglich, Zellen sehr selektiv zu verfolgen im Grunde mit Hintergrund-Bilder. Weiterhin ist es möglich, die ¹⁹ F MR-Signal von den transplantierten markierten Zellen überlagern mit anatomischen Bilder von herkömmlichen 1H MRI erhalten. ¹⁹ F / ¹ H MRI ist daher wesentlich, die für Studien, Zellmigration in vivo. Zellen, die mit dieser Methode untersucht werden mit ¹⁹ F-reiche Partikel bezeichnet. Synthetisch abgeleitet perfluorierte Kohlenwasserstoffe (FKW), die hauptsächlich aus Kohlenstoff und Fluor-Atome werden häufig verwendet, um die Teilchen herzustellen. Diese Verbindungen sind nicht wasserlöslich und müssen vor der Applikation in vitro oder in vivo emulgiert werden. Die übliche Größe der Teilchen, die PFC von anderen Gruppen wurden für Arbeitnehmer in vivo ¹⁹ F-MRT Tracking Experimenteim Bereich zwischen 100 nm und 245 nm ^6,8-10. Wir haben jedoch gezeigt, dass die Effizienz bei der Markierung von dendritischen Zellen mit Perfluor-15-Krone-5-Ether (PFCE) Teilchen mit zunehmender Teilchengröße (> 560 nm). ¹¹

Protokoll

Alle tierischen Verfahren müssen von der lokalen institutionellen Tierschutz Ausschuss vor der Ausführung genehmigt werden. Während der MR-Messungen ein angemessenes Niveau der Anästhesie und physiologischen Überwachung (Körpertemperatur, Atemfrequenz) sind unabdingbare Voraussetzungen.

1. Erzeugung von Maus-Knochenmark-abgeleiteten dendritischen Zellen

1. Auszug Knochenmarkzellen aus C57BL / 6 Mäusen wie zuvor ¹² beschrieben. Dieses Protokoll stammt bis 1992 ¹³ und wurde ursprünglich von der Gruppe von Ralph M. Steinman (1943-2011), der Entdecker der dendritischen Zelle ¹⁴ beschrieben.
2. Kurz gesagt, extrahieren Schien-und Wadenbein bald nach opfern Mäusen. Arbeiten unter dem Laminarströmungshaube (eine Verkeimung zu verhindern), spülen Sie das Knochenmark in einer kleinen Petrischale mit wash Medium (5% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin und 1% HEPES in RPMI) ^12.
3. Übertragen Sie die Zellsuspension durch eine Zelle strainer (100 um Maschenweite, Nylon) in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen, um Knochen und übrig gebliebene Gewebe zu entfernen. Nach mehreren Waschschritten und einer Lyse Schritt ¹² zählen die lebensfähigen Zellen mit Trypanblau und einer Zählkammer.
4. Resuspendieren Knochenmarkszellen in einer Konzentration von 400.000 Zellen ml ^-1 in Kulturmedium (RPMI mit 10% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin 1% HEPES und 1% L-Glutamin), enthaltend 75 ng ml ^-1 des Maus Granulozyten Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (MGM-CSF) aus Überständen von 293FT HEK-Zellen mit einer Maus GMCSF transfiziert erhalten. Übertragen 10 ml Zellsuspension (4 x 10 ⁶ Zellen) in Petrischalen (100 mm x 20 mm) und Inkubation in einem CO _2-Inkubator (37 ° C, 5% CO _2). Am Tag 3 aufzufüllen alte Medium mit 10 ml frischem Medium (Ende halten Konzentration mGM-CSF bei 75 ng ml ^-1). Am Tag 6, entfernen 10 ml altes Medium und fülltmit 10 ml frischem Medium (MGM-CSF Endkonzentration = 75 ng ml ^-1). Am Tag 8, entfernen 10 ml altes Medium und füllt mit 10 ml frischem Medium (MGM-CSF Endkonzentration = 150 ng ml ^-1).
5. Am Tag 10, reifen die differenzierte DC mit 1 ug ml ^-1 Lipopolysaccharid (LPS) für 24 Stunden.

2. Markierung von dendritischen Zellen mit ¹⁹ F-reiche Partikel

1. Während der 24 Stunden Reifung Schritt (1.5), die DC-Label mit 1 mM fluorreichen Perfluor-15-Krone-5-Ether (PFCE) Teilchen (500-560 nm) auch für 24 Stunden. Bereiten großen Fluor-markierten Partikel durch Emulgieren PFCE in Pluronic F-68 (Gesamtvolumen 2,5 ml) unter Verwendung eines Zell-störenden Titansonotrode und unter Verwendung eines kontinuierlichen Puls-Programm (100% Amplitude, Leistung = 250 W) 60 s lang.
2. Nach den oben Inkubationsschritte Ernte der reifen und Fluor-markierten DC mit einem Gewebekulturzelllinien Schaber, Überführung in einen 50-ml-Zentrifugenröhrchen und Zentrifugebei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur gerührt.
3. Um abwaschen alle übrig gebliebenen Partikel und abgestorbene Zellen, lassen geernteten Zellen auf Poly-L-Lysin-Gerichte zu halten. Um diesen Schritt vorzubereiten, Mantel Petrischalen mit Poly-L-Lysin (1 mg ml ^-1) bei 37 ° C für 1 Stunde, danach abwaschen des ungebundenen Poly-L-Lysin mit PBS.
4. Inkubieren über geernteten Zellen auf Poly-L-Lysin-beschichteten Platten in serumfreiem Medium und lassen sich an Zellen (1 h bei 37 ° C, 5% CO _2).
5. Waschen Sie die mittel-bis nicht-haftenden Zellen verbleibenden Partikel und abgestorbene Zellen zu verwerfen und dreimal mit vorgewärmten (37 ° C) PBS.
6. Ernte adhärenten Zellen durch Trypsin-EDTA-Behandlung (0,25% Trypsin-EDTA, 3 min Inkubation bei 37 ° C).
7. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt waschen, suspendieren die erforderliche Menge an reifen DC in serumfreiem sterile PBS.
8. Um festzustellen, ob die Zellen wurden erfolgreich markiert, ist es empfehlenswert, die physicoche überprüfenmische Eigenschaften der Zellen mittels Durchflusszytometrie (FACS). Die seitliche Streulicht (SSC) sollte eine erhöhte Granularität in diesen Zellen zu offenbaren, wie zuvor ¹¹ beschrieben. Es sollte auch bedacht werden, dass Fibroblasten könnte die DC Kulturen verunreinigen und könnte auch nehmen die ¹⁹ F-Teilchen in parallel. Deshalb ist die DC Reinheit zu beurteilen (durch Messung der Anteil der CD11c ⁺ CD11b ⁺ Zellen mit FACS) vor in vivo-Anwendung werden.

3. In vivo-Anwendung von ¹⁹ F-markierten dendritischen Zellen

1. Verwalten DC ^{(6. Oktober} - ^{7. Oktober)} in einem Volumen von 50 - 100 ul intrakutan in die Hinterbeine einer C57BL / 6 Maus durch Positionieren der Maus in einem Halter und sorgfältig Einsetzen einer Nadel 26 G ½ in die oberen Schichten der Haut vor der Anwendung (Verwendung 0,5 ml Tuberkulin Spritzen mit fest angeschlossene Nadeln Totvolumen zu minimieren). Um eine zu gewährleistenn entsprechenden intrakutan Anwendung ist es wichtig, dass der eingeführte Teil der Nadel teilweise sichtbar unter der Haut. Wenn die Nadel ist nicht mehr sichtbar, hat die Nadel eingeführt worden zu tief in die Hautschichten. Für das ungeübte einzelnen könnte die intrakutanen Anwendung unter Narkose durchgeführt werden.
2. Bild in den Extremitäten in vivo Fluor ⁽¹⁹ F) / Proton ⁽¹ H) MRI (siehe nächster Abschnitt) 21 h nach der Injektion.

4. In Vivo ¹⁹ F / ¹ H Magnetic Resonance Imaging

Die detaillierte Anleitung für die Einrichtung der MR-Scans beziehen sich auf einen Bruker MR-Scanner mit der Steuerungs-Software Paravison (Version 5.1). Bezeichnungen, Hersteller-spezifische Funktionen und Optionen sind kursiv hervorgehoben. Für andere MR-Scannern können diese Schritte müssen nach der Hersteller-Richtlinien angepasst werden.

1. Vereinbaren Sie Zugang zu einem dediziertenKleintier-MR-Scanner. Für eine ausreichende Bildqualität, ein System mit einer Magnetfeldstärke von 9,4 Tesla oder mehr und maßgeschneiderte Hochfrequenzspulen (z. B. ¹ H / ¹⁹ F Dual-Band abstimmbaren HF-Spule, 35 mm Innendurchmesser, 50 mm Länge, schnelle Biomed, Würzburg, Deutschland) werden empfohlen.
2. Vor MRI, bereiten Sie das Setup des MRI-Scanners für Anästhesie und physiologischen Überwachung. Stellen Sie sicher, dass die Atemmaske des Tieres Bett / Halter an der Isofluran-System angeschlossen ist und dass der Temperaturfühler und die Atmung Pad zu einem entfernten Tier-Monitoring-System (z. B. Modell 1025, SA Instruments Inc., New York, USA) verbunden. Letztere dient dazu, das Tier Vitalparameter wie Körpertemperatur und Atmung zu überwachen.
3. Anesthetize Mäuse durch Inhalation Narkose mit einer Maus Kammer, die mit einem Isofluran-System. Stellen Sie den Durchfluss für Luft-und O ₂ bei 0,2 L min ^-1 und 0,1 L min ^-1 bzw.und 3% Isofluran (bereinigt von einem Verdampfer) für ca. 2 min, bis das erforderliche Niveau der Narkose erreicht ist (keine Antwort folgende toe Prise). Optimale Flussraten je nach Setup verwendet wird. Seien Sie sich bewusst, dass hohe Strömungsgeschwindigkeiten kann zu Austrocknung führen. Eine sorgfältige Überwachung der Tiere "Bedingungen ist jederzeit erforderlich, wie oben erwähnt.
4. Positionieren Sie den Mauszeiger auf die Maus anfällig Bett / Inhaber der Kleintier MR Scanner (Abbildung 1).
5. Während man den Durchfluss für Luft-und O ₂ konstant, passen Sie die Isofluran Verdampfer auf 0,8-1,5%, bis eine optimale Atmung erreicht ist. Eine Atemfrequenz von 50 - 70 Atemzüge pro min empfohlen.
6. Halten Sie die Körpertemperatur auf 36-37 ° C während des Experiments durch die Verwendung eines warmen Wasser (oder alternativ Warmluft) Kreislauf-System.
7. Halten Sie die Augen der Maus feucht mit sterilem Auge Schmier Salbe während der Messung.
8. Nach dem Befestigen des Tieresauf dem Imaging-Halter und die Anbindung an das Monitoring-System, bewegen Sie den Halter in der Mitte des ¹ H / ¹⁹ F HF-Spule (das ist im Isozentrum des Tieres Scanner Magneten positioniert).
9. Die Position der Maus, so dass das Knie in das Isozentrum des Magneten liegt, entweder mit einem automatisierten Verfahren (zB unter Verwendung eines Lasers mit einer Positionierung motorbetriebenen Tierhalter kombiniert) oder durch manuelle Berechnung des Abstandes der Halter bewegt werden muss in den Magneten zu erreichen Isozentrums.
10. Zur Bestätigung der korrekten Positionierung des Tieres in den Scanner und die spätere Planung des Bildscheibe Geometrie (dh Größe, Position und Rotation im Raum), erwerben scout Bilder in drei Standard-Orientierungen (axial, koronal, sagittal) mit schnellen und Bild mit niedriger Auflösung Erwerb Methoden (zB TriPilot Protokoll, das einen FLASH-Pulssequenz verwendet).
11. Stimmen Sie die HF-Spule auf die ¹ H-Resonanzfrequenz (zB. 400,1 MHz für 9,4 T) und dem ¹⁹ F Resonanzfrequenz (zB 376,3 MHz für 9,4 T) und passen Sie die Impedanz der Spule 50 Ohm mit dem Tuning-Monitor des Tieres MR-Scanner. Tuning und Matching ist notwendig, um die optimalen Bedingungen für die Übertragung und Empfang zu erzielen.
12. Führen Sie die erforderlichen Einstellungen, einschließlich automatisches System Shim zur Feinabstimmung der Homogenität des Magnetfeldes (zB ADJ_SHIM), Netzfrequenz Anpassungen an die RF der Larmorfrequenz der Maus (zB ADJ_SF) und Referenz-Verstärkung einzustellen, um die HF-Amplitude einstellen ( zB ADJ_REFG). Alle diese Einstellungen sind wichtig, um die statischen und variablen magnetischen Feldern (B _0, B ₁₎ in der Region von Interesse machen so homogen wie möglich.
13. Erwerben Sie einen zweiten Satz von scout Bilder (wie oben) entlang der drei orthogonalen Orientierungen, nach dem Einstellen das Sichtfeld (FOV), so dass beide unteren Gliedmaßen are sichtbar von Becken bis Fuß (LxBxH = 50x25x25 mm). Diese Bilder dienen dazu, die Orientierungen der endgültige 3D ¹ H / ¹⁹ F-Scans planen.
14. Richten Sie eine TurboRARE 3D Protokoll für ¹ H-Scan: TR / TE = 1500/53 ms, FOV = 50x25x25 mm, Matrix = 400x200x200, RARE Factor = 16 (. Zykluszeit ca. 60 min). Stellen FOV mit Hilfe der scout Bilder, starten Sie den Scan (Ampel).
15. Einlegen eines einzelnen Impulses FID-Sequenz mit TR von mindestens 1000 msec. Öffnen Sie Bearbeiten Scan und stellen Kern bis ¹⁹ F. Verwenden Sie die manuelle Gain-Einstellungen, indem Sie das automatische Bezugsverstärkung im Edit-Methode der Toolbox.
16. Messung starten ohne Aufzeichnung von Daten, um eine MR-Signal in Echtzeit mit APS (go Setup) anzuzeigen. Wenn die ¹⁹ F spektrale Signal innerhalb der Akquisition Fenster ist zu niedrig, fügen Sie mehr Durchschnitte Methode bearbeiten und / oder modulieren die Pulsabschwächers (TX0 oder SP0 Schieberegler), bis eine signal ist deutlich sichtbar. Stellen Sie die Grundfrequenz, um Mitte des ^19. F spektralen Peak bei 0 Hz in den Erwerb Fenster. Bewerben Grundfrequenz und drücken Sie STOP. Beachten Sie, dass die Isofluran als Anästhesie kann einen Hintergrund zu erzeugen. 9.4 Tesla MRI die chemische Verschiebung zwischen den ¹⁹ F-enthaltenden Teilchen und Isofluran etwa 1.800 Hz liegt. Stellen Sie sicher, dass die Anregung Bandbreite kleiner als 3.600 Hz ist die spannende Isofluran zusammen mit den ¹⁹ F-markierten Zellen oder Partikel zu vermeiden. Die Grundfrequenz ist richtig auf dem Signal von der ¹⁹ F-markierten Zellen erzeugt eingestellt werden. Alternativ könnte eine andere Methode der Anästhesie verwendet, wie der Experimentator sieht fit werden.
17. Clone (Duplizieren) die TurboRARE 3D-Protokoll aus dem vorherigen ¹ H-Scan. Zur Methode und deaktivieren Sie die automatische Referenz Verstärkung (wie oben) bearbeiten. Set ¹⁹ F Kern von Scan bearbeiten. Ändern Sie die Matrix 128x64x64und der RARE-Faktor auf mindestens 40 (bis zu 64). Für einen TR / TE 1000/6 ms und 64 beträgt, ist die Scan-Zeit ca. 70 min. Stellen Sie den Empfänger Gewinn auf 101 (Toolbox) und starten Sie den Scan ohne weitere Anpassungen mit GOP (go-Pipeline).
18. Wenn die Scans fertig sind einfahren Maus Halter aus dem MR-Scanner. Trennen Sie die Maus vorsichtig aus der Halterung. Wenn die Maus nicht für ex vivo-Analyse (zB Histologie oder Spektroskopie, siehe unten) geopfert direkt nach der MR-Messungen, genau beobachten, bis sie vollständig aus der Narkose erholt hat. Regulierung der Körpertemperatur durch die Narkose beeinflusst wird, so bei der Wiederherstellung, legen Sie die Maus in einem separaten Käfig, an einem warmen Temperatur-geregelte Pad platziert wird. Sobald die Maus vollständig aus der Narkose erholt, sie wieder in ihre Haltekäfig und dem Tier Raum.
19. Um die ¹⁹ Bilder F ¹ H Bilder überlagern, verwenden Sie das Menü Ansicht option auf der gleichen Software (Paravison). Die Unterlage Funktion kann unter Korrelation gefunden werden. Speichern Sie die Unterlage, laden Sie das neue Bild und markieren Sie die ¹⁹ F-Schicht durch die Definition eine neue Farbe aus der Nachschlagetabelle. Um zwischen den ¹⁹ F-und ¹ H-Scans diskriminieren, ändern Sie den Schwellenwert für die gewählte Farbe (geschnitten Nachschlagetabelle), so dass die ¹⁹ F-Signal wird die gewählte Farbe und den Hintergrund ¹ H Bild haben wird in Graustufen bleiben. Andere Nachbearbeitung Programme (zB ImageJ) stehen zur Verfügung, um die ¹ H / ¹⁹ F Bild-Overlays erstellen.
20. Sollte ein in vivo Quantifizierung der ¹⁹ F-Signal notwendig sein, folgen eine einfache quantitative Protokoll wie zuvor beschrieben ^15,16. Kurz gesagt, kann die Quantifizierung, indem ein Verweis Rohr mit einer bekannten Konzentration von PFCE-Emulsion innerhalb des FOV neben der Maus durchgeführt werden. Nach dem Erwerb der MR-Bilder, QuanTIFY der Intensitäten der Signale unter Verwendung von ¹⁹ F-Region of Interest (ROI)-Analyse und zu vergleichen, um die in vitro Eichkurve wie in Fig. 2 gezeigt.

5. Lymphknoten Magnetic Resonance Spectroscopy (MRS)

1. Nach Einbußen bei der Maus, entfernen Sie die Popliteallymphknoten und in einem kleinen 5 mm NMR-Röhrchen und 100 ul von 2% PFA.
2. Installieren eines ¹⁹ F-Spektroskopie Spule (zB eine Ringspule), die eine Öffnung von mindestens 5 mm zur Aufnahme der NMR-Röhrchen mit den Lymphknoten ist.
3. Legen Sie das NMR-Röhrchen im Inneren der Spule und bewegen Sie die Spule in die Isozentrums des Magneten.
4. Stimmen Sie die HF-Spule auf die ¹⁹ F Resonanzfrequenz (zB 376,3 MHz für 9,4 T) und passen Sie die Impedanz der Spule 50 Ohm mit dem Tuning-Monitor des Tieres MR-Scanner. Tuning und Matching ist notwendig, um die optimalen Bedingungen für die Übertragung und Signalverarbeitung erreichenEmpfang.
5. Stellen Sie alle Parameter innerhalb der Shim Unterlegmaß Toolbox auf 0 und drücken anzuwenden. Normalerweise ist es nicht erforderlich, Trimm-Verfahren anzuwenden, da das Volumen der Probe ist relativ klein. Wenn eine ausreichende ¹⁹ F-Signal verfügbar ist, können automatisierte Verfahren zur Shim, Netzfrequenz und Empfänger Gewinn wie oben beschrieben angewendet werden.
6. Einlegen eines einzelnen Impulses FID-Sequenz mit TR von mindestens 1000 msec. Öffnen Sie bearbeiten Scan und stellen Sie den Kern auf ¹⁹ F. Verwenden Sie die manuelle Gain-Einstellungen, indem Sie das automatische Bezugsverstärkung im Edit-Methode der Toolbox. Stellen Sie die Anzahl der Mittelwerte zu 1.
7. Starten Sie die Sequenz mit APS. Wenn die ¹⁹ F spektrale Signal innerhalb der Akquisition Fenster ist zu niedrig, fügen Sie mehr Durchschnitte Methode bearbeiten und / oder modulieren die Pulsabschwächers (TX0 oder SP0 Schieberegler), bis ein Signal ist deutlich sichtbar. Stellen Sie die Grundfrequenz, so dass die ¹⁹ F speMittelamerika Peak in der Mitte des Erfassungsfensters bei 0 Hz und gelten Grundfrequenz. Stellen Sie die Pulsabschwächers erneut, um das Signal, bis 90 ° Anregung erreichen zu maximieren. Wenn das Signal mit maximaler Presse Stop ist.
8. Stellen Sie die Durchschnittswerte im Edit-Methode zwischen 64 und 256 (oder mehr, falls erforderlich, je nach Signal) und starten Sie die Übernahme mit GOP. Das erfasste Signal korreliert linear mit der Anzahl der Mittelwerte. Während Quantifizierung im Hinterkopf behalten, dass das erfasste Signal an einem durchschnittlichen normalisiert werden muss. Darüber hinaus ist ein Kalibriernormal einer bekannten Konzentration oder eine Eichkurve notwendig, die Anzahl von Zellen aus dem normierten Signal F ¹⁹ (2) zu berechnen.
9. Sobald der Scan abgeschlossen ist, entfernen Sie die Probe, legen Sie die nächste Probe und fahren Sie mit Schritt 5.3.

Ergebnisse

Achtzehn bis 21 Stunden nach Anwendung intrakutanen, ¹⁹ F-markierten dendritischen Zellen (DC) in die Drainage Popliteallymphknoten migrieren. Die Bewegung der DC über die Lymphbahnen in die Drainage politeal Lymphknoten können durch Überlagerung der ¹ H anatomische Bilder mit den ¹⁹ F DC Bilder (2A) geschätzt. Wir haben bereits über die Migration dieser Zellen in vivo, sowie die Auswirkungen der ¹⁹ F-Partikelgröße auf DC Immunbiologie, einschließlich...

Diskussion

Diese Methode der Verwendung von ¹⁹ F / ¹ H MRI, um die Bewegung von DC in den Lymphknoten folgen die Möglichkeit gibt, die Wanderungsbewegungen von Immunzellen in vivo zu untersuchen. Dendritische Zellen sind hervorragende Beispiele für die Migration schnell Immunzellen, die in der Lage, durch dreidimensionale Strukturen dicht ohne Einhaltung spezifische Substrate ¹⁷ zu manövrieren sind. Obwohl die geringe räumliche Auflösung (um-Bereich) der beschriebenen Technik ist nicht ver...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
REAGENTS
C57BL/6 Mäuse	Charles River, Berlin
RPMI	Gibco	21875-091
FBS Superior	Biochrom AG	S 0615
HEPES	Gibco-Invitrogen	15630-056
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
L-Glutamin	Gibco	25030-024
Dulbecco's PBS	Sigma Aldrich	D8662
PFA	Santa Cruz	sc-281692
Perfluoro-15-crown-5-ether	ChemPur	391-1996
Pluronic F-68	Sigma Aldrich	P5556
Petrischalen (35 x 10 mm)	VWR, Deutschland	391-1996
27 ½ G Spritzen	VWR, Deutschland	612-0151
Zellsiebe aus Nylon (100 μ m mesh)	VWR, Deutschland	734-0004
NMR-Röhrchen	VWR, Deutschland	634-0461<
Dissektionswerkzeuge	FST
CO2 Inkubator	Binder
Kleintier MRT-System	Bruker Biospin		9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision Erfassungs- und Verarbeitungssoftware
1H/19F HF-Spule mit doppelt abstimmbarem Volumen	Rapid Biomed, Wü rzburg, Deutschland		35 mm Innendurchmesser, 50 mm Länge
19F Spektroskopiespule	hauseigene		Tune/Match-Schleifenspule, 4 Windungen, Innendurchmesser 5 mm, 10 mm lang, zwei Kondensatoren zum Stimmen und Anpassen
Isofluran-Inhalationssystem	Fö hr Medical Instruments GmbH
Tierüberwachungssystem Modell 1025	SA Instruments Inc., New York, USA