Analyse der embryonalen Zebrafisch-Larven-und Skelett Muskelfasern aus Dissoziierte Vorbereitungen

Zusammenfassung

Zebrafische sind ein Schwellensystem zur Modellierung menschlichen Erkrankungen der Skelettmuskulatur. Wir beschreiben eine schnelle und effiziente Methode, um Skelettmuskel Muskelfasern aus embryonalen Zebrafisch-Larven und zu isolieren. Dieses Verfahren ergibt eine hohe Dichte myofiber Vorbereitung für Untersuchung von einzelnen Skelettmuskelfasermorphologie, Protein subzelluläre Lokalisierung und Muskelphysiologie.

Zusammenfassung

Der Zebrafisch hat sich als ein wertvolles Modellsystem für die Erforschung der Skelettmuskelfunktion und für das Studium der menschlichen Muskelerkrankungen sein. Trotz der vielen Vorteile, die durch in vivo-Analyse von Skelettmuskel im Zebrafisch angeboten, die Visualisierung der komplexen und fein strukturierten Protein Milieu für die Muskelfunktion verantwortlich, insbesondere im gesamten Embryos, kann problematisch sein. Dieses Hindernis ergibt sich aus der geringen Größe des Zebrafisch-Skelettmuskel (60 um) und der noch geringeren Größe des Sarkomers. Hier beschreiben wir und zeigen, eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung von Skelett Muskelfasern von Zebrafisch-Embryonen und Larven. Wir berücksichtigen auch Protokolle, die Postvorbereitungstechniken für die Analyse von Muskel-Aufbau und Funktion zu veranschaulichen. Insbesondere haben wir ausführlich die anschließende immunzytochemische Lokalisation von Skelettmuskelproteine ​​und die qualitative Analyse der Calcium-Freisetzung stimuliert via Live-Zelle Kalzium-Imaging. Insgesamt ist dieses VideoArtikel bietet eine unkomplizierte und effiziente Methode für die Isolierung und Charakterisierung von Zebrafisch-Skelett-Muskelfasern, eine Technik, die eine Leitung für unzählige nachfolgende Studien der Muskelstruktur und-Funktion bietet.

Einleitung

Die Skelettmuskulatur ist ein hoch spezialisiertes Gewebe für die Erzeugung der für die Motilität notwendig Kontraktionskräfte verantwortlich. Die Kontraktion wird durch einen Prozess wie Erregung und Kontraktion (EG) Kupplung, die elektrische Signale an Calcium-Freisetzung aus intrazellulären Speichern ^1,2 wandelt bekannt initiiert. Intrazelluläre Calcium-Freisetzung aktiviert die Sarkomer zu verkürzen und zu erzeugen Kraft. Die vielen spezifischen Komponenten der molekularen Maschinen für die Vermittlung der neuromuskulären Synapse Getriebe ³ EG-Kupplung ^4,5, und Aktin-Myosin-abhängigen Kontraktionen ⁶ verantwortlich weit....

Protokoll

1. Herstellung von Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser (Dauer: 1 h)

Deckbeschichtung ermöglicht eine schnelle Einschwingzeit myofiber und Haftung. Dies kann während der Dissoziationsstufe der myofiber Trennung (Schritt 2 unten) durchgeführt werden.

1. Schneiden und Parafilm auf dem Boden einer 60 mm Petrischale (alle Marken).
2. Zeigen Mikroskop Deckglas rutscht (12 mm Durchmesser) auf Parafilm in einer 60-mm-Gewebekulturschale oder sie einzeln in einzelnen Wells der 24-Well-Platten.

Anmerkung 1: Diese kleine, runde Deckgläser helfen, myofiber Zahlen konzentrieren und reduzieren überschüs....

Ergebnisse

Fluoreszenz-Immunmarkierung von Muskelfasern (Fig. 2)

Bilder, die erwarteten Fluoreszenzmarkierungsmuster von Muskelfasern immun nach erfolgreicher Isolierung und Beschichtung. Die Muskelfasern wurden mit entweder Anti-Ryanodin-Rezeptor (1:100) (2A) oder anti-α-Actinin (1:100) (2B) Antikörpern markiert worden sind, und zeigen die Immunfärbung der Triade und der Z-Bande auf. Sekundäre Antikörper waren Alexa Fluor 555 (1:500). Bilder,.......

Diskussion

Zebrafische sind ein leistungsfähiges Wirbeltier-Modellsystem für die Untersuchung der Muskelentwicklung und Funktion in vivo ^25,27,28. Sie haben auch gezeigt, als ein wertvolles Gut für die Modellierung menschlichen Muskelerkrankungen ^14,15,20,29. Während große Schritte unternommen wurden, um die Nutzung und Anwendung der Zebrafisch für die Untersuchung der Muskelfunktion und Muskelerkrankungen voranzubringen, gibt es eine ständige kritische Notwendigkeit, Werkzeuge, die mehr in die Tiefe.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
24-Well-Kulturplatte	Corning	3524
10x PBS	Invitrogen Gibco	70011
CO2 Unabhängiges Medium	Invitrogen Gibco	18045
Kollagenase Typ II	Worthington Biochemisches	LS004186	Los 41H12764
Kollagenase Typ IV	Worthington Biochemisches	L5004188
8% Paraformaldehyd	Elektronenmikroskopie Sciences	157-8
Methanol	Sigma	322415
Triton X-100	Sigma	X100
BSA	Sigma	A2153
Schafserum	Sigma	S3772
Ziegenserum	Sigma	G9023
Glasdeckgläser	Fischerbrand	12-545-82 12CIR-1D
Poly-L-Lysin	Sigma	P4707
Pronase	Sigma	P5147
40 μ m Filter	BD Biosciences	352340
70 μ m Filter	BD Biosciences	352350
Prolong Gold Antifading-Reagenz	Invitrogen	P36931
Anti-Α-Actinin Antikörper	Sigma	A5044
Anti-RYR Antikörper	Abcam	34C
Alexa Fluor Antikörper	Invitrogen	A-21425
TWEEN 20	Sigma	P1379
60 mm Petrischale	Fischerbrand	0875713A
Poly-L-Ornithin	Sigma	P4957
Objektträger	Fischerbrand	12-550-15
Koffein	Sigma	C0750