Summary
Un protocole d'infusions chroniques de glucose et Intralipide chez le rat est décrite. Ce modèle peut être utilisé pour étudier l'impact de l'excès de nutriments sur la fonction des organes et des paramètres physiologiques.
Abstract
L'exposition chronique à des niveaux excessifs de nutriments est postulé pour affecter le fonctionnement de plusieurs organes et de tissus et de contribuer au développement des nombreuses complications liées à l'obésité et le syndrome métabolique, y compris le diabète de type 2. Pour étudier les mécanismes par lesquels des niveaux excessifs de glucose et d'acides gras affectent le pancréas des cellules bêta et la sécrétion d'insuline, nous avons établi un modèle de perfusion nutritive chronique chez le rat. La procédure consiste en la pose de cathéters la veine jugulaire droite et l'artère carotide gauche sous anesthésie générale, qui permet une période de récupération de 7 jours, reliant les cathéters de pompes utilisant un pivot et un système de contrepoids qui permet à l'animal de se déplacer librement dans la cage, et infusant glucose et / ou de l'Intralipid (une émulsion d'huile de soja qui génère un mélange d'environ 80% unsaturated/20% d'acides gras saturés quand infusé avec de l'héparine) pendant 72 heures. Ce modèle offre plusieurs avanges, y compris la possibilité de moduler finement les niveaux cibles de glucose et d'acides gras circulants, l'option de co-insuffler composés pharmacologiques, et le laps de temps relativement court, par opposition aux modèles alimentaires. Il peut être utilisé pour examiner les mécanismes du dysfonctionnement des nutriments induite par une variété d'organes et de tester l'efficacité des médicaments dans ce contexte.
Introduction
Niveaux chroniquement élevés de glucose et de lipides dans la circulation ont été proposées pour contribuer à la pathogenèse du diabète de type 2 en modifiant la fonction de plusieurs organes impliqués dans le maintien de l'homéostasie du glucose, y compris, mais sans s'y limiter, le pancréas des cellules bêta (revue en 1). Les dépôts d'hypothèse de glucotoxicité que l'hyperglycémie chronique aggrave le défaut des cellules bêta qui a donné lieu à une hyperglycémie, en premier lieu, créant ainsi un cercle vicieux et de contribuer à la détérioration du contrôle de la glycémie chez 2 patients diabétiques de type. De même, l'hypothèse de glucolipotoxicité propose que des élévations concomitantes de la glycémie et des lipides, comme souvent observées dans le diabète de type 2, sont préjudiciables à la cellule beta.
Décrypter les mécanismes cellulaires et moléculaires des effets délétères de nutriments chroniquement élevés sur la fonction des cellules bêta du pancréas est la clé de la understanding de la pathogénie du diabète de type 2 1. À cette fin, un grand nombre d'études ont examiné les mécanismes d'excès de nutriments ex vivo chronique dans les îlots de Langerhans isolés ou in vitro dans des lignées de cellules sécrétrices d'insuline clonales. Cependant, la traduction des résultats obtenus dans ces systèmes modèles pour l'ensemble de l'organisme est complexe, notamment parce que les concentrations d'acides gras utilisés dans des cellules en culture ou îlots correspondent rarement les taux circulants dans le voisinage des cellules bêta in vivo 2. D'autre part, les mécanismes de défaillance des cellules bêta en réponse à un excès de nutriments ont été examinés dans des modèles rongeurs de diabète, comme en témoigne le rat Zucker Diabetic Fatty 3,4, la gerbille Psammomys obesus 5 et le régime riche en gras- Fed souris 6. Ces modèles, cependant, sont caractérisées par des anomalies métaboliques intrinsèques et ne sont pas facilement prêter à des manipulations de glucose dans le sanget / ou les niveaux de lipides dans un cadre plus contrôlée et moins chronique. Pour être en mesure de modifier les taux circulants de nutriments dans un délai de jours chez les animaux normaux par ailleurs, nous avons développé un modèle de perfusion chronique chez les rats normaux qui nous permet d'examiner les effets des lipides et du glucose, seul ou en combinaison, sur les paramètres et les fonctions physiologiques 7,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vue d'ensemble: La procédure consiste en la pose de cathéters la veine jugulaire droite et l'artère carotide gauche sous anesthésie générale, qui permet une période de récupération de 7 jours, reliant les cathéters de pompes utilisant un pivot et un système de contrepoids qui permet à l'animal de se déplacer librement dans la cage; et infuser le glucose et / ou de l'Intralipid (une émulsion d'huile de soja qui génère un mélange d'environ 80% unsaturated/20% d'acides gras saturés avec de l'héparine lorsque infusé 9) pendant 72 heures.
1. Canulation de la veine jugulaire droite et l'artère carotide gauche
- Stériliser les instruments chirurgicaux. tube de canulation doit également être stérilisé à froid en utilisant un agent de stérilisation liquide (2,6% de glutaraldéhyde) avant la procédure. Plonger le tube dans un contenant stérilisé à l'autoclave pour 16-24 heures. Rincez et rincer abondamment avec de l'eau distillée stérile pour éliminer toutes les traces de glutaraldéhyde avant utilisation.
- Peser le rat pour calculerdosages de médicaments:
Carprofen 5 mg / kg: dilution 1/10 = poids corporel (g) x 0,001 ml SC (analgésique)
Glycopyrrolate 0,01 mg / kg: dilution 1/10 = BW (g) X 0,0012 ml SC (anticholinergique) - Anesthésier le rat en utilisant l'isoflurane et de l'oxygène.
- Placez le rat sur son estomac. Raser la zone derrière les oreilles à la base des épaulements. Posez le rat sur son dos. Rasez la région sous le cou aux pattes avant.
- Préparation du site chirurgical à la chlorhexidine, de l'alcool, et de l'iode. Administrer des médicaments.
- Transférez le rat dans le domaine chirurgical.
- En utilisant une technique aseptique, canulate la veine jugulaire droite et l'artère carotide gauche avec un PE-50 canule attachée à une seringue de 1 ml remplie avec 5 U de sérum physiologique hépariné. Rincer les canules avec 50 U de sérum physiologique hépariné pour éviter la coagulation au cours de la période de récupération. Utiliser des aiguilles 23G émoussés. Fermez chaque canule avec une épingle 23G.
- Après la chirurgie, couper environ 2,5 mm de laincisives du bas et placez le rat dans une veste de perfusion pour éviter les canules d'être mangé.
- Fournir de l'oxygène (1 L / min pendant 10 minutes) pour aider à évacuer l'isoflurane.
- Placez le rat dans une cage chauffée jusqu'à ce qu'elle soit complètement réveillé.
- Exploiter quatre rats pour utiliser un par état de perfusion (tableau 1).
2. Soins post-opératoire (traitement post-chirurgical et de la connexion des cathéters)
- Peser les rats le jour 1 et le jour 2 post-chirurgie.
- Administrer glycopyrrolate (BW (g) x 0,00048 ml) SC deux fois le 1er jour post-opératoire et une fois sur 2 jours après l'intervention chirurgicale.
- Traitements de soutien supplémentaires peuvent être administrés si nécessaire: fluides, tapis de chauffage, l'alimentation humide, l'oxygénothérapie, les analgésiques, les anticholinergiques.
- Au jour 7 post-chirurgie, peser les rats pour calculer les débits de perfusion.
- Connectez chaque rat à un système de perfusion à l'aide d'une attache et pivotante montée sur un sommet de la grille de la cage (figure 1).
- Rincer les canules avec 5 U de sérum physiologique hépariné pour enlever les caillots. Rincer les canules une fois de plus avec 50 U de sérum physiologique hépariné pour empêcher la coagulation.
- Laisser les rats s'acclimater à la longe et pivotent pendant au moins 24 heures avant le début de la perfusion.
3. Infusion
- Dessiner 0,15 ml de sang de la carotide de chaque glycémie chez le rat et la mesure. Rincer les canules jugulaires. Utilisez 50 U de sérum physiologique hépariné pour empêcher la coagulation dans les deux canules de chaque rat.
- Transférer l'échantillon de sang pour un tube collecteur de 0,5 ml contenant 2% d'EDTA. Centrifuger à 10000 rpm pendant 2 min et congeler le plasma à -20 ° C.
- Remplir deux seringues de 60 ml de chacune des conditions de perfusion répertoriées ci-dessous. Lieu seringue 1 sur la position avant de la pompe et des seringues 2 place sur la position arrière de la pompe.
- Rejoignez chaque paire de solutions avec raccords en Y et les tubes de T22 CO-EX qui a été stérilisé. Placez les seringues sur une Harvard 33Pompe à deux seringues.
- Changez le fond de la cage et enlevez tous les aliments de la grille du haut de la cage.
- Pesez 150 g de norme chow et le placer sur la grille du haut de la cage.
- Branchez les seringues à l'émerillon sur le gril de la cage. Rincer les seringues correctement pour éliminer l'air emprisonné dans les lignes.
- Calculer les débits de perfusion en utilisant le poids du corps qui a été prise avant de connecter le rat dans le système de perfusion. Les taux sont calculés avec un fichier Microsoft Excel qui convertit le débit de perfusion de glucose (GIR) en ml / h.
- Régler la pompe pour administrer des débits de 60 ml seringues selon les réglages du fabricant. Entrez le taux de seringue 1 (seringue avant) et le taux de seringue 2 (arrière seringue).
- Démarrer la pompe.
4. Surveillance
- Après le démarrage de la pompe, vérifier qu'il n'y a pas de fuite de la rotule ou des canules et que le tube de perfusion n'est pas tordu. Vérifiez également qu'il n'y a pas de bulles d'airla tubulure.
- Après 3 heures de perfusion, prélever un échantillon de sang pour contrôler la glycémie. Répétez après 6, 24, 48, et 72 heures de perfusion. Par mesure de précaution, la glycémie est également surveillée après 30, 34, 54, et 60 h de la perfusion. La glycémie peut être mesurée à l'aide d'une goutte de sang total à l'aide d'un moniteur de glucose portable. Cela limite la quantité de sang prélevé pendant la perfusion et évite donc modifier sensiblement le volume sanguin et / ou de l'hématocrite.
- Le taux de seringue 1 est modifiée en fonction des valeurs de glycémie à maintenir la glycémie à 220-250 mg / dl. Le taux de seringue 2 ne change pas au cours de la perfusion de 72 heures parce que les acides gras libres sont maintenus à 1 mmol / L.
- conditions liées à la perfusion sont jumelés afin que le volume reçu pour les animaux témoins est équivalent au volume reçu pour les animaux de laboratoire (tableau 1).
- Après 24 heures de perfusion, changer le fond de la cage et peser les aliments restant dans la grille de la cage. Retourner la partie non consommée to la grille de la cage. Répétez après 48 h.
- seringues de recharge jour au besoin au cours de l'heure 72 de la perfusion.
- Au cours de la perfusion, toujours observer le rat pour détecter tout signe d'inflammation ou d'inconfort. Administrer les soins appropriés si nécessaire.
5. Euthanasie post-perfusion
- Après 72 heures de perfusion, les rats sont anesthésiés par voie intraveineuse avec 0,5 ml d'un cocktail kétamine / xylazine (182 mg / kg de kétamine et de 11,6 mg / kg de xylazine dilué 1:2 avec du NaCl à 0,9%).
- Le réflexe toe-pincement est utilisé pour vérifier le niveau de l'anesthésie. Anesthésique est administré supplémentaires au besoin.
- Lorsque le rat est anesthésié, la cavité abdominale est ouverte avec des ciseaux chirurgicaux. Le rat est saigné par tirage de 10 à 15 ml de sang dans une seringue à partir de l'aorte ou la veine cave.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sur une série de 42 rats qui ont subi une chirurgie, 5 rats ont été perdus au cours de la période post-opératoire et 1 rat ont été perdues pendant la perfusion, soit un taux de réussite global de 86%. Le poids corporel moyen des 37 rats qui ont finalement été infusés était de 608 ± 5 g avant la chirurgie et 588 ± 6 g au début de la perfusion (moyenne ± SE, n = 37, p <0,0001 par test t apparié). Les résultats représentatifs suivants ont été obtenus en 2 groupes de perfusion:. Saline (SAL) et de glucose + Intralipide (GLU + IL) Figures 2A et 2B montrent la glycémie et les niveaux d'acides gras, respectivement, au cours de la période de perfusion de 72 h. De par leur conception, les niveaux de glucose sont maintenues autour de 220-250 mg / dl tout au long de la perfusion, basée sur des mesures et des ajustements de la vitesse de perfusion du glucose (GIR), comme le montre la figure 3 réguliers. Les rongeurs ont une forte capacité de compenser l'injection de glucose en augmentant l'insuline endogène soidiscrétion. Par conséquent, le RIF doit être augmenté au cours de la perfusion pour les niveaux de glucose dans le sang doit être maintenu à un état d'équilibre relatif. Néanmoins, le taux de glucose dans le sang ont tendance à diminuer vers la fin de la perfusion, comme on le voit sur la figure 2A. Puisque les animaux sont infusées avec des nutriments caloriques, ils diminuent spontanément leur ration alimentaire (Figure 4).
| Infusion Etat | Seringue 1 (position avant) | Seringue 2 (position arrière) |
| 1 | Dextrose 70% | Saline |
| 2 | Saline | Saline |
| 3 | Dextrose 70% | Intralipid 20% + héparine 20U/ml |
| 4 | Saline | Intralipid 20%% + héparine 20U/ml |
Tableau 1. régimes de perfusion.
Figure 1. Photographie du système de perfusion montrant le rat avec les cathéters en place et l'attache, la rotation et le bras de contrepoids monté sur la grille de la cage.
Figure 2. . Taux plasmatiques de glucose (A) et les acides gras libres (B) pendant la perfusion de solution saline (SAL) ou co-perfusion de glucose et Intralipide (GLU + IL) en 6 mois rats Wistar données sont des moyennes ± SEM de 3 - 4 animaux dans chaque groupe.
Figure 3 "src =" / files/ftp_upload/50267/50267fig3.jpg "/>
Figure 3. Le réglage de la vitesse de perfusion du glucose au cours de la co-perfusion de glucose et Intralipide (GLU + IL) en 6 mois rats Wistar. Les données sont des moyennes ± SEM de 4 animaux.
Figure 4. Ration alimentaire quotidienne moyenne de 6 mois rats Wistar infusé avec du sérum physiologique (SAL) ou co-infusé avec du glucose et Intralipide (GLU + IL). Données sont des moyennes ± SEM de 3-4 animaux dans chaque groupe. ** P <0,01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bien qu'un certain nombre d'études antérieures ont employé des perfusions de glucose chroniques (par exemple 10-15) ou des lipides (par exemple 16,17) chez les rongeurs, à notre connaissance la perfusion combinée de ces deux carburants n'a été signalée chez les souris 18. Le modèle de perfusion chronique présentée ici offre plusieurs avantages à étudier les effets sur les excès de nutriments sur une variété de fonctions biologiques chez les rats. D'abord, il ne s'agit pas des rongeurs génétiquement obèses, et puisque l'obésité commune chez l'homme est polygénique 19, les résultats sont donc plus susceptibles d'être pertinentes aux effets de la surproduction des éléments nutritifs dans la population générale. Deuxièmement, ce modèle offre la possibilité de tester les effets de différents nutriments (en particulier les sucres ou de graisses) à différents niveaux de circulation, en changeant leur nature et le débit de perfusion. Troisièmement, la voie IV d'administration permet la co-infusion de composés ou de médicaments avec le Nutrients 20. Enfin, le laps de temps relativement court de l'expérience (72 h vs semaines riches en matières grasses modèles induits par le régime) est le coût en temps et en efficacité pour les études précliniques.
Ce modèle a aussi quelques inconvénients et limitations. D'abord, comme tout modèle chirurgical est exige un personnel hautement formés et qualifiés en chirurgie aseptique. Deuxièmement, comme mentionné dans les résultats représentatifs section les animaux ont tendance à compenser la perfusion de glucose en augmentant la sécrétion endogène d'insuline, ce qui nécessite une surveillance fréquente de niveaux de glucose dans le sang et les ajustements de la GIR pour maintenir les niveaux de glycémie cibles tout au long de la perfusion. Troisièmement, la procédure n'est pas facilement applicable à des souris, qui seraient nécessaires en vue de l'utiliser sur des animaux génétiquement modifiés. Dans notre expérience, le cathétérisme des deux veine jugulaire et l'artère carotide chez les souris dans un défi technique et l'approche plus facile dans ces petits animaux est de placer un jucathéter gular pour la perfusion et de l'échantillon à partir d'un vaisseau périphérique. Mais ce qui limite considérablement le volume et la fréquence de l'échantillonnage au cours de la perfusion.
Compte tenu de l'objectif de notre laboratoire, nous avons utilisé ce modèle pour étudier les mécanismes de glucolipotoxicité dans le pancréas de cellules bêta 7,8. Toutefois, il peut être appliqué pour étudier les effets de l'excès de nutriments dans les tissus et organes tels que, mais sans s'y limiter, le coeur 21, le muscle squelettique, 22, 23 et le foie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vincent Poitout est co-fondateur de et a reçu des contrats de recherche de Bêtagenex Inc., une organisation de recherche sous contrat qui offre le modèle de perfusion présentée dans cet article comme un service commercial.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (R01DK58096 à Vincent Poitout). Vincent Poitout titulaire de la Chaire de recherche du Canada sur le diabète et la fonction des cellules bêta du pancréas. Bader Zarrouki reçu des bourses post-doctorales de Merck et Eli Lilly. Fontés Ghislaine a été soutenu par une bourse post-doctorale de l'Association canadienne du diabète.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline 0.9% | BD | JB1324 | |
| Dextrose 70% | McKesson | ||
| Intralipid 20% | Fresenius Kabi | JB6023 | |
| Metricide (Glutaraldehyde 2.6%) | Metrex | 11-1401 | |
| Heparin Sodium 10,000 USP u/ml | PPC | ||
| Carprofen | Metacam | ||
| Glycopyrrolate | Sandoz | ||
| Isoflurane | Abbott | ||
| Chlohexidine 2% | |||
| Alcohol 70% | |||
| Iodine | |||
| PE-50 | BD | 427411 | |
| CO-EX T22 | Instech Solomon | BCOEX-T22 | |
| Connector 22G | Instech Solomon | SC22/15 | |
| Swivel 22G | Instech Solomon | 375/22PS | |
| Y-Connector 22G | Instech Solomon | ||
| Counterbalance and arm | Instech Solomon | CM375BP | |
| 23 G blunted needles | Instech Solomon | LS23 | |
| 23 G canulation pins | Instech Solomon | SP23/12 | |
| Tethers (12 inch) | Lomir | RT12D | |
| Infusion jackets | Lomir | RJ01, RJ02, RJ03, RJ04 | |
| (SM-XL) | |||
| Tether attachment piece | Lomir | RS T1 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| 1 ml syringe | BD | 309602 |
References
- Poitout, V., Robertson, R. P. Glucolipotoxicity: fuel excess and beta-cell dysfunction. Endocr. Rev. 29, 351-366 (2008).
- Poitout, V., et al.
- Unger, R. H. Minireview: weapons of lean body mass destruction: the role of ectopic lipids in the metabolic syndrome. Endocrinology. 144, 5159-5165 (2003).
- Harmon, J. S., Gleason, C. E., Tanaka, Y., Poitout, V., Robertson, R. P. Antecedent hyperglycemia, not hyperlipidemia, is associated with increased islet triacylglycerol content and decreased insulin gene mRNA level in Zucker diabetic fatty rats. Diabetes. 50, 2481-2486 (2001).
- Bachar, E., Ariav, Y., Cerasi, E., Kaiser, N., Leibowitz, G. Neuronal nitric oxide synthase protects the pancreatic beta cell from glucolipotoxicity-induced endoplasmic reticulum stress and apoptosis. Diabetologia. 53, 2177-2187 (2010).
- Peyot, M. L., et al. Beta-cell failure in diet-induced obese mice stratified according to body weight gain: secretory dysfunction and altered islet lipid metabolism without steatosis or reduced beta-cell mass. Diabetes. 59, 2178-2187 (2010).
- Hagman, D. K., et al. Cyclical and alternating infusions of glucose and intralipid in rats inhibit insulin gene expression and Pdx-1 binding in islets. Diabetes. 57, 424-431 (2008).
- Fontes, G., et al. Glucolipotoxicity age-dependently impairs beta cell function in rats despite a marked increase in beta cell mass. Diabetologia. 53, 2369-2379 (2010).
- Stein, D. T., et al. Essentiality of circulating fatty acids for glucose-stimulated insulin secretion in the fasted rat. J. Clin. Invest. 97, 2728-2735 (1996).
- Leahy, J. L., Cooper, H. E., Weir, G. C. Impaired insulin secretion associated with near normoglycemia. Study in normal rats with 96-h in vivo glucose infusions. Diabetes. 36, 459-464 (1987).
- Hager, S. R., Jochen, A. L., Kalkhoff, R. K. Insulin resistance in normal rats infused with glucose for 72 h. The American Journal of Physiology. 260, 353-362 (1991).
- Laybutt, D. R., Chisholm, D. J., Kraegen, E. W. Specific adaptations in muscle and adipose tissue in response to chronic systemic glucose oversupply in rats. The American Journal of Physiology. 273, E1-E9 (1997).
- Jonas, J. C., et al. High glucose stimulates early response gene c-Myc expression in rat pancreatic beta cells. The Journal of Biological Chemistry. 276, 35375-35381 (2001).
- Tang, C., et al. Glucose-induced beta cell dysfunction in vivo in rats: link between oxidative stress and endoplasmic reticulum stress. Diabetologia. 55, 1366-1379 (2012).
- Alonso, L. C., et al. Glucose infusion in mice: a new model to induce beta-cell replication. Diabetes. 56, 1792-1801 (2007).
- Magnan, C., Gilbert, M., Kahn, B. B. Chronic free fatty acid infusion in rats results in insulin resistance but no alteration in insulin-responsive glucose transporter levels in skeletal muscle. Lipids. 31, 1141-1149 (1996).
- Goh, T. T., et al. Lipid-induced beta-cell dysfunction in vivo in models of progressive beta-cell failure. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 292, 549-560 (2007).
- Pascoe, J., et al. Free fatty acids block glucose-induced beta-cell proliferation in mice by inducing cell cycle inhibitors p16 and p18. Diabetes. 61, 632-641 (2012).
- Bell, C. G., Walley, A. J., Froguel, P.
- Fontes, G., Hagman, D. K., Latour, M. G., Semache, M., Poitout, V. Lack of preservation of insulin gene expression by a glucagon-like peptide 1 agonist or a dipeptidyl peptidase 4 inhibitor in an in vivo model of glucolipotoxicity. Diabetes Res. Clin. Pract. 87, 322-328 (2010).
- Crawford, P. A., Schaffer, J. E. Metabolic stress in the myocardium: Adaptations of gene expression. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. , (2012).
- Kewalramani, G., Bilan, P. J., Klip, A. Muscle insulin resistance: assault by lipids, cytokines and local macrophages. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab Care. 13, 382-390 (2010).
- Cusi, K. Role of obesity and lipotoxicity in the development of nonalcoholic steatohepatitis: pathophysiology and clinical implications. Gastroenterology. 142, 711-725 (2012).
