Summary
쥐의 혈당과 Intralipid 만성 주입을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 모델은 기관의 기능과 생리 학적 매개 변수에 대한 영양 과잉의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
영양소의 과도한 수준에 만성 노출은 여러 장기와 조직의 기능에 영향을 미치는 비만과 관련된 여러 합병증의 개발과 제 2 형 당뇨병 등의 대사 증후군에 기여할 것으로 가정합니다. 포도당과 지방산의 과도한 수준은 췌장 베타 세포와 인슐린의 분비에 영향을 미치는하는 메커니즘을 연구하기 위해, 우리는 쥐의 만성 영양 주입 모델을 설립했다. 7 일 회복 기간을 허용; 회전과 케이지에서 자유롭게 이동하는 동물의 수 평형 시스템을 사용하여 펌프에 카테터를 연결하고 주입 절차는 전신 마취하에 우측 경정맥 정맥과 왼쪽 경동맥을 catheterizing으로 구성 포도당 및 / 또는 Intralipid (헤파린 주입하면 약 80 % unsaturated/20 % 포화 지방산의 혼합물을 생성하는 콩 오일 에멀젼) 72 시간 동안. 이 모델은 여러 가지 ADVANTA을 제공합니다약물 화합물을 공동으로 주입 할 수있는 옵션, 그리고식이 모델에 반대 비교적 짧은 시간 프레임 정밀 포도당과 지방산 순환의 목표 수준을 조절 할 수있는 가능성 등 GES. 그것은 장기의 다양한 영양소에 의한 장애의 메커니즘을 검토하고, 이러한 맥락에서 약물의 효과를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
순환 포도당과 지질의 만성 높은 수준을 포함 포도당 항상성의 유지에 연루 여러 장기의 기능을 변경하여 제 2 형 당뇨병의 병인에 기여하는 제안 국한되지 않은, 췌장 베타 세포 (리뷰 1). 만성 고혈당증 따라서 악순환을 만들고 제 2 형 당뇨병 환자에서 혈당 조절의 악화에 기여 첫 번째 장소에서 혈당 상승을 준 베타 세포 결함을 악화하는 glucotoxicity 가설 posits. 마찬가지로, glucolipotoxicity 가설은 주로 제 2 형 당뇨병에서 관찰 포도당과 지질 수준을 수반 상승은, 베타 세포에 해로운 것을 제안한다.
췌장 베타 세포 기능에 만성적으로 높은 영양소의 해로운 효과의 세포 및 분자 메커니즘을 해독하는 understandi의 열쇠입니다제 2 형 당뇨병 1의 병인의 NG. 이를 위해 많은 연구가 랑게르한스의 고립 된 섬이나 클론, 인슐린 분비 세포 라인에 체외에서 만성 영양 과잉 전직 생체의 메커니즘을 조사했다. 배양 세포 나 섬에서 사용되는 지방산의 농도는 거의 생체 2의 베타 세포의 주변에 순환 수준을 일치하지 않기 때문에, 전체 유기체 이러한 모델 시스템에서 얻은 결과의 번역은 특히 복잡합니다. 반면에, 영양 과잉의 질문에 답변 베타 세포 장애의 메커니즘으로 주커 당뇨병 지방간 쥐 3,4, 햄스터 Psammomys obesus 5와 높은 지방 다이어트 -에 의해 예시, 당뇨병의 설치류 모델에서 조사 된 공급 마우스 6. 이 모델은, 그러나, 고유 신진 대사 이상에 의해 특징과 혈액 포도당의 조작에 쉽게 순종하지는 않습니다및 / 또는 더 많은 통제와 적은 만성 설정 지질 수준. 그렇지 않으면 정상 동물의 일 기간에 영양소 수준을 순환 변경할 수 있도록, 우리는 생리적 매개 변수 및 함수에 우리가 단독으로 또는 조합, 지질 및 포도당의 영향을 조사 할 수 정상 쥐의 만성 주입 모델을 개발 7,8.
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Protocol
개요, 7 일 회복 기간을 허용, 회전 및 케이지에서 자유롭게 이동하는 동물의 수 평형 시스템을 사용하여 펌프에 카테터를 연결하는 절차는 전신 마취하에 우측 경정맥 정맥과 왼쪽 경동맥을 catheterizing으로 구성 72 시간 동안 (헤파린 9 주입 할 때 포화 지방산 약 80 % unsaturated/20 %의 혼합물을 생성하는 콩 오일 에멀젼) 포도당 및 / 또는 Intralipid을 주입.
1. 오른쪽 경정맥 정맥과 좌측 경동맥의 Canulation
- 수술기구를 소독. Canulation 튜브는 절차 이전에 액체 살균 에이전트 (2.6 % 글루 타르 알데히드)를 사용하여 콜드 소독해야합니다. 16-24 시간 동안 멸균 용기에 튜브를 담가. 린스 사용하기 전에 글루 타르 알데히드의 모든 흔적을 제거하는 멸균 증류수로 충분히 세척하십시오.
- 계산 쥐 무게약물 복용량 :
Carprofen 5 ㎎ / ㎏ : 희석 1 / 10 = 본체 무게 (g) × 0.001 ML SC (진통제)
0.01 ㎎ / ㎏ Glycopyrrolate : 희석 1 / 10 = BW (G) X 0.0012 ML SC (항콜린) - isoflurane을하고 산소를 사용하여 쥐를 마취.
- 그 배에서 쥐를 놓습니다. 어깨의 기초에 귀 뒤에 영역을 면도. 그 뒷면에있는 쥐를 놓습니다. 앞발로 목 아래의 지역을 면도.
- 클로르헥시딘, 알코올, 요오드와 준비는 수술 부위. 약물을 관리 할 수 있습니다.
- 수술 필드에 쥐를 전송합니다.
- 무균 기술을 사용하여, 오른쪽 경정맥 정맥 헤파린 생리 식염수 5 U로 채워진 1 ML의 주사기에 부착 된 PE-50 canula 함께 왼쪽 경동맥을 canulate. 복구 기간 동안 응고 방지하기 위해 헤파린 생리 식염수 50 U와 canulas을 세척하십시오. 무딘 23G 바늘을 사용합니다. 23G 핀 각 canula를 닫습니다.
- 수술 후, 오프 약 2.5 mm 트림아래 앞니와 장소 먹게되는 canulas을 방지하기 위해 주입 재킷 쥐.
- isoflurane을 대피에 도움이 산소를 (1 L / 10 분 분) 제공합니다.
- 완전히 깨어 때까지 가열 새장에 쥐를 놓습니다.
- 주입 조건 당 하나를 사용하는 네 쥐 (표 1)를 운영하고 있습니다.
2. 수술 후 관리 (카테터의 사후 수술 치료 및 연결)
- 1 일 및 2 일 후 수술에 쥐 무게.
- 1 일 후 수술에 한 번 하루에 2 수술 후 두 번 glycopyrrolate (BW (g) × 0.00048 ML) SC를 관리 할 수 있습니다.
- 필요한 경우 추가 지원 치료를 관리 할 수 있습니다 : 유체 가열 패드, 젖은 다이어트, 산소 치료, 진통제, 항콜린.
- 7 일 후 수술에 주입을위한 유량을 계산하기 위해 쥐를 무게.
- 케이지 그릴 상단 (그림 1)에 장착 밧줄과 회전을 사용하여 주입 시스템에 각 쥐를 연결합니다.
- 혈전을 제거하는 헤파린 생리 식염수 5 U와 canulas을 세척하십시오. 응고 방지하기 위해 헤파린 생리 식염수 50 U와 함께 한 번 더 canulas을 세척하십시오.
- 쥐가 밧줄에 적응하고 주입을 시작하기 전에 적어도 24 시간 동안 회전 할 수 있습니다.
3. 주입
- 각 쥐를 측정 혈당의 동맥에서 혈액의 0.15 ML을 그립니다. 경정맥 canulas를 세척합니다. 각 쥐의 두 canulas의 응고를 방지하기 위해 헤파린 생리 식염수 50 U를 사용합니다.
- 2 % EDTA를 포함하는 0.5 ML 수집 튜브에 혈액 샘플을 전송합니다. 2 분 동안 10,000 rpm으로 원심 분리 -20 ° C.에서 플라즈마를 동결
- 아래의 주입 조건 각각에 대해 두 개의 60 ML 주사기를 채우십시오. 펌프의 뒤쪽 위치에 펌프 및 장소 주사기 2의 전면 위치에 자리 주사기 1.
- Y-커넥터와 멸균 된 CO-EX T22 튜브와 함께 솔루션의 각 쌍에 가입하세요. 하버드 33 주사기를 놓고이중 주사기 펌프.
- 케이지 바닥을 변경하고 케이지 그릴 상단에서 모든 음식을 제거합니다.
- 케이지 그릴 상단에 150 표준 차우의 G와 장소를 무게.
- 케이지 그릴 회전에 주사기를 연결합니다. 라인에서 갇힌 공기를 제거하는 제대로 주사기를 세척하십시오.
- 주입 시스템에 쥐를 연결하기 전에 찍은 체중을 사용하여 주입 유량을 계산합니다. 환율은 ML / H에 포도당 주입 속도 (GIR)을 변환하는 Microsoft Excel 파일로 계산됩니다.
- 제조업체의 설정에 따라 60 ML의 주사기에 대한 흐름 속도를 관리하는 펌프를 설정합니다. 주사기 1 (전면 주사기)를위한 속도와 주사기 2 (뒤 주사기)에 대한 비율을 입력합니다.
- 펌프를 시작합니다.
4. 모니터링
- 펌프를 시작한 후, 아무 회전이나 canulas에서 유출하고 주입 튜브가 꼬여 있지 않은가 없는지 확인합니다. 도 기포가 없는지 확인합니다튜브.
- 주입 3 시간 후 혈당을 모니터링하기 위해 혈액 샘플을 채취. , 24, 10 후 48를 반복 주입의 72 시간. 예방 조치로, 혈당은 주입 후 30, 34, 54, 60 시간 후 모니터링됩니다. 혈당은 휴대용 혈당 모니터를 사용하여 전체 혈액 한 방울을 사용하여 측정 할 수 있습니다. 이 주입 동안 그려 혈액의 양을 제한하기 때문에 크게 변경 혈액량 및 / 또는 혈소판을 방지합니다.
- 주사기 1 비율은 220-250 밀리그램 / DL에서 혈당을 유지하기 위해 혈당 값에 따라 수정됩니다. 유리 지방산은 1 mmol / L로 유지되기 때문에 주사기 2의 비율은 주입 72 시간 동안 변경되지 않습니다
- 주입 조건은 대조군에 대해 수신 볼륨이 실험 동물 (표 1)에 대해 수신 볼륨에 해당하므로 쌍입니다.
- 주입 24 시간 후, 케이지 바닥을 변경하고 케이지 그릴에 남아있는 음식을 무게. 먹지 부분 t를 반환케이지 그릴 O를. 48 시간 후 반복합니다.
- 리필 주사기 매일 같이 주입 72 시간 동안 필요합니다.
- 주입하는 동안 항상 염증이나 불편 함이 없는지 쥐를 관찰합니다. 필요한 경우 적절한 치료를 관리 할 수 있습니다.
5. 후 주입 안락사
- 주입 72 시간 후, 쥐가 케타민을 / xylazine 칵테일 (182 마취제와 11.6 ㎎ / ㎏이 ㎎ / xylazine kg의 0.9 % 염화나트륨과 1:2 희석)의 0.5 ML로 정맥 마취 있습니다.
- 발가락 핀치 반사는 마취의 수준을 확인하는 데 사용됩니다. 추가 마취는 필요에 따라 관리됩니다.
- 쥐가 마취되면 복강 수술 가위로 열립니다. 쥐가 대동맥이나 대정맥에서 주사기 혈액의 15 ML을 그려 exsanguinated 있습니다.
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Representative Results
수술을 시행 한 42 쥐의 일련의 밖으로 5 쥐가 수술 후 기간 동안 손실 된 1 쥐가 86 %의 성공률을 나타내는 주입하는 동안 끊어졌습니다. 결국 주입 된 37 쥐의 평균 체중은 608이었다 ± 5 수술 전 g 및 588 ± 주입 개시 6 개의 G (평균 ± SE, N = 37, P <0.0001로 t-test를 쌍).에게 72 시간 주입 기간 동안 식염수 (SAL) 및 + Intralipid (GLU + IL) 그림 2A와 2B 쇼 혈액 포도당과 지방산 수준은 각각 포도당 :. 다음과 같은 대표적인 결과는 2 주입 그룹 하였다. 디자인으로, 혈당 수치는 정기적으로 측정하고 그림 3과 같이 포도당 주입 속도 (GIR)의 조정에 따라, 주입에 걸쳐 220-250 MG / DL 주위에 유지됩니다. 설치류는 내인성 인슐린 자체를 증가시켜 포도당 주입을 보상하는 강한 능력을 가지고cretion. 따라서, GIR은 상대적으로 정상 상태로 유지되는 혈당 수준에 대한 주입 과정 중에 증가해야합니다. 그럼에도 불구하고, 혈당은 그림 2a에서 볼 주입의 끝으로 감소하는 경향이있다. 동물이 열량 영양소로 주입되기 때문에, 그들은 자발적으로 (그림 4) 자신의 음식 섭취량을 줄입니다.
| 주입 조건 | 주사기 1 (앞 위치) | 주사기 2 (뒤 위치) |
| 1 | 포도당 70 % | 식염 |
| 2 | 식염 | 식염 |
| 3 | 포도당 70 % | Intralipid 20 % + 헤파린 20U/ml |
| 4 | 식염 | Intralipid 20 % % + 헤파린 20U/ml |
표 1. 주입 요법.
그림 1. 장소에 카테터 밧줄, 회전, 평형 팔 쥐를 보여주는 주입 시스템 사진은 케이지 그릴에 장착.
그림 2. . 혈당 수준 (A)와 지방산 (B) 생리 식염수 (SAL)의 주입 또는 6 개월의 Wistar 쥐의 혈당과 Intralipid의 공동 주입 (GLU + IL) 동안 데이터는 평균 ± 3의 SEM입니다 - 각 그룹의 4 동물.
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그림 3. 6 개월의 Wistar 쥐의 혈당과 Intralipid (GLU + IL)의 공동 주입하는 동안 포도당 주입 속도의 조정. 데이터는 4 동물의 ± SEM을 의미합니다.
그림 4. 생리 식염수 (SAL) 또는 포도당과 Intralipid와 공동 주입 주입 6 개월의 Wistar 쥐의 일일 평균 식품 섭취량은 (GLU + IL). 데이터는 평균 ± 표준 각 그룹의 3-4 동물의 SEM합니다. * p <0.01.
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Discussion
이전 연구의 숫자가 우리의 지식 만성 포도당 주입 (예 : 10-15) 또는 설치류의 지질 (예 : 16, 17)을 고용하고 있지만 두 연료의 혼합 투여는 생쥐 18보고되었다. 여기에 제시된 만성 주입 모델은 쥐의 생물학적 기능의 다양한 영양소 과잉에 미치는 영향을 연구하는 여러 가지 이점을 제공합니다. 첫째, 유 전적으로 비만 설치류를 포함하지 않으며, 인간의 일반적인 비만 다원 19이기 때문에, 연구 결과는 따라서 일반 인구에 영양 공급 과잉의 영향에 관련이있을 가능성이 더 높습니다. 둘째,이 모델은 자연과 주입 유량을 변경하여 다른 순환 수준에서 다른 영양소의 효과를 (특히 설탕이나 지방)를 테스트 할 수있는 가능성을 제공합니다. 셋째, 행정의 IV의 경로는 NUTR와 함께 화합물이나 약물의 공동 주입 수의 ients 20. 마지막으로, 실험의 비교적 짧은 기간 (높은 지방 다이어트 유도 모델에 대한 72 시간 대 주 동안) 전임상 연구를위한 비용과 시간이 효과적입니다.
또한이 모델은 몇 가지 단점과 한계가있다. 첫째, 어떤 수술 모델로 무균 수술 고도로 숙련 숙련 된 인력을 필요로합니다. 둘째, 같은 대표 결과에서 언급 한 섹션 동물 주입을 통해 목표 혈당 수준을 유지하기 위해 혈당 수준과 GIR의 조정 빈번한 모니터링이 필요 내인성 인슐린 분비를 증가시켜 포도당 주입을 보상하는 경향이있다. 셋째, 절차는 유전자 변형 동물에 사용하기 위해 필요한 것 마우스, 쉽게 적용 할 수 없습니다. 우리의 경험에서, 경정맥과 경동맥의 기술적 도전 생쥐에서 이러한 작은 동물의 쉬운 접근의 도관은 광주를 배치하는 것입니다주변 혈관의 주입 및 샘플에 대한 gular 카테터. 그러나 이것은 상당히 주입하는 동안 샘플링의 볼륨과 주파수를 제한합니다.
우리 연구실의 초점을 감안할 때, 우리는 췌장 베타 세포 7,8에 glucolipotoxicity의 메커니즘을 연구하기 위해이 모델을 사용하고 있습니다. 그러나 같은 모든 조직과 장기에 영양 과잉의 효과를 연구에 적용하지만, 심장 21, 골격 근육, 22, 및 간 23 일에 국한되지 수 있습니다.
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Disclosures
빈센트 Poitout 공동 창립자이며 Bêtagenex 주식 회사, 상업 서비스로이 문서에서 제시된 주입 모델을 제공하는 계약 연구 기관에서 연구 계약을 받았다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 보건원 (R01DK58096 빈센트 Poitout까지)에 의해 지원되었다. 빈센트 Poitout은 당뇨병과 췌장 베타 세포 기능에있는 캐나다 연구 의자를 보유하고 있습니다. 베이더 Zarrouki 머크와 일라이 릴리에서 박사 후 장학금을 받았다. Ghislaine의 FONTES는 캐나다 당뇨병 협회에서 박사 후 친교에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline 0.9% | BD | JB1324 | |
| Dextrose 70% | McKesson | ||
| Intralipid 20% | Fresenius Kabi | JB6023 | |
| Metricide (Glutaraldehyde 2.6%) | Metrex | 11-1401 | |
| Heparin Sodium 10,000 USP u/ml | PPC | ||
| Carprofen | Metacam | ||
| Glycopyrrolate | Sandoz | ||
| Isoflurane | Abbott | ||
| Chlohexidine 2% | |||
| Alcohol 70% | |||
| Iodine | |||
| PE-50 | BD | 427411 | |
| CO-EX T22 | Instech Solomon | BCOEX-T22 | |
| Connector 22G | Instech Solomon | SC22/15 | |
| Swivel 22G | Instech Solomon | 375/22PS | |
| Y-Connector 22G | Instech Solomon | ||
| Counterbalance and arm | Instech Solomon | CM375BP | |
| 23 G blunted needles | Instech Solomon | LS23 | |
| 23 G canulation pins | Instech Solomon | SP23/12 | |
| Tethers (12 inch) | Lomir | RT12D | |
| Infusion jackets | Lomir | RJ01, RJ02, RJ03, RJ04 | |
| (SM-XL) | |||
| Tether attachment piece | Lomir | RS T1 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| 1 ml syringe | BD | 309602 |
References
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