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Ein. Fixierung
Fixative sind cancerogen Handschuhe tragen und handhaben die Fixiermittel in einer Abzugshaube. Soweit nicht anders angegeben, sind alle Inkubationen auf Eis durchgeführt und alle Lösungen sollten vor der Verwendung gefiltert werden. Verwenden Elektronenmikroskopie-grade Reagenzien.
Tag 1
- Nach experimentellen Bedingungen (zB virale Injektion, medikamentöse Behandlung), legen Sie die Membran mit organotypischen Schnitten des Hippocampus in einem 60 x 15 mm Polystyrol Petrischale mit eiskaltem 0,1 M Phosphatpuffer (Sorensen Phosphat-Puffer), pH 7,3. Fügen Sie 1 bis 2 ml 0,1 M Phosphatpuffer direkt auf die Scheiben, um sie kalt.
Entscheidender Schritt: Verwenden Sie immer frisch zubereitet Puffer und Fixative. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert des Puffers innerhalb gewünschten Bereich. Ein Scheitern zu tun beschädigen könnten zellulären Strukturen.
- Um die CA1 Unterfeld der Scheibe zu isolieren, verwenden Sie einEinmalskalpell sanft über die Scheibe neben der DG, parallel zur CA1 Zellschicht (Abbildung 1) geschnitten. Dann schneiden Sie die restlichen Scheibe vertikal, um die CA3 Unterfeld und die Subiculum entfernen. Schneiden Sie eine Ecke der Scheibe zur Identifizierung der Oberseite des Gewebes.
HINWEIS: Falls keine virale Lieferung von Protein von Interesse erforderlich ist, das gesamte Gewebeschnitt fixiert, nachdem die Medien mit einem sanften eiskaltem Puffer spülen entfernt wird. Dieses wird dann durch Ausschneiden der CA1 gefolgt.
Entscheidender Schritt: Verfolgen Sie die Oberseite des Gewebes, um für die richtige Schneiden der Gitter später.
- Entfernen Sie vorsichtig das Gewebe aus der Membran unter Verwendung der Rückseite des Skalpells. Verwenden einer Pasteurpipette zu übertragen, um sanft das Gewebe bis zu einer 12-well Platte mit 0,1 M Phosphatpuffer.
- Entfernen Sie den Puffer in der auch von der Platte und 500 & mu, l - 1 ml eiskaltem Fixiermittel (pH 7,3) wie folgt zusammen: 0,1% Pikrinsäure, 1% Paraformaldehyd und 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer. Inkubieren für 2 Stunden bei 4 ° C.
HINWEIS: Pikrinsäure kann explosiv sein, wenn sie trocken. Halten Sie es angefeuchtet mit Wasser in einem Behälter dicht geschlossen halten. An einem trockenen und gut belüfteten Ort aufbewahren.
- Entfernen Sie die Fixiermittel aus dem Brunnen und waschen Proben 3 mal (20 min jeweils) in 0,1 M Phosphatpuffer.
- Inkubieren für 40 min in 1% Tanninsäure (w / v) in 0,1 M Maleinat-Puffer, pH 6,0.
- Spülen Sie zweimal (jeweils 20 min) in Maleatpuffer.
- Inkubieren für 40 min in 1% Uranylacetat (w / v) in Maleatpuffer im Dunkeln. Uranylacetat ist lichtempfindlich und ist radioaktiv. Das Becherglas mit Parafilm beim Auflösen und speichern Sie unbenutzte Puffer im Dunkeln bei 4 ° C.
- Spülen Sie zweimal (jeweils 20 min) in Maleatpuffer.
- Inkubieren für 20 min in 0,5% Platin Chloride (w / v) in Maleatpuffer.
- Spülen Sie zweimal (jeweils 20 min) in Maleatpuffer. Speichern die Proben bei 4 ° C, bis sie zur weiteren Verarbeitung bereit sind.
2. Dehydration und Embedding
Propylenoxid ist krebserregend. Vermeiden Dämpfe durch die Arbeit mit ihm in einer Abzugshaube. Verwenden Sie absolute, 100% reinem Ethanol, die keine Spuren von Wasser enthält. Verdünnen Sie dieses absolute Ethanol zu unterschiedlichen Konzentrationen zur Entwässerung herzustellen.
Tag 2
- Inkubation für 5 min in 50% Ethanol und dann 5 min in 70% Ethanol.
- Inkubieren für 15 min in frisch zubereiteten 1% p-Phenylendiamin (PPD) in 70% Ethanol.
- Spülen dreimal in 70% Ethanol.
- Inkubation für 5 min in 80% Ethanol und dann 5 min in 95% Ethanol.
- Inkubieren in 100% Ethanol zweimal jeweils 5 min.
- Bereiten Glasfläschchen mit Schraubverschluss und stellen Sie sicher, sie sind sauber und komplett trocken. Übertragen Slices Glasfläschchen undbeschriften jedes Fläschchen einfach und klar.
- Inkubation für 5 min in 1:1 Ethanol: Propylenoxid.
- Inkubieren in 100% Propylenoxid zweimal jeweils 5 min.
- Fügen Harz (Epon) zu jedem Fläschchen ein 1:1-Gemisch mit Propylenoxid zu machen. Sanft für 2 Stunden zu mischen. Nicht schütteln die Fläschchen zu rigoros, um Blasen, die mit Einbettung stören könnten.
- Hinzufügen Harz, um ein 3:1-Gemisch mit Propylenoxid, und Mischen für 2 Stunden zu machen.
- Übertragen auf 100% Harz und inkubieren O / N.
Tag 3
- Sandwich-Proben zwischen Streifen aus ACLAR Kunststoff und Heilmittel für 24 Stunden bei 60 ° C.
3. Schneiden und Montage auf Grids
Tag 4
- Geschnitten semidünnen (0,5 um) Abschnitte und Flecken mit 1% Toluidinblau + 1% Borax, um die korrekte Ausrichtung der Proben zu bestimmen.
- Geschnitten Ultradünnschnitten (60 nm) und Halterungen auf Nickel Gitter, ein Abschnitt pro Raster.
4. Immunhistochemie
Alle Puffer und Wasser sollte vor dem Gebrauch gefiltert werden.
Tag 5
- Geben Sie einen Tropfen (~ 50 ul) von 1% Tween-20/phosphate Puffer (T / PB), pH 7,5, auf ein Stück sauberer Parafilm auf einer ebenen Fläche. Vorsichtig holen die Gitter mit sauberen Pinzette durch die Kante und schweben auf dem Puffer, Abschnitt unten, und inkubieren für 10 min bei RT.
- Überschüssiges Flüssigkeit aus dem Gitter durch Anordnen Abschnitt nach oben auf auf Filterpapier und anschließend schwimmen auf 50 mM Glycin in T / PB für 15 min bei RT.
Entscheidender Schritt: Zur Vermeidung übermäßigen "carry-over" von Lösungen aus einer Lösung Tropfen zum nächsten während der Inkubationen, abtropfen überschüssige Flüssigkeit durch leichtes Berühren der Kante des Gitters auf # 1 Filterpapier zwischen jeder Lösung ändern. Außerdem entfernen Lösung zwischen den Armen des EM eingefangenen Forceps Halten des Gitters durch sanftes Dochtwirkung mit einem Faserband aus Filterpapier zwischen den Zangenschenkeln während ensuklingeln die Abschnitte nicht vollständig austrocknen.
- Trocknen des Gitters mit Filterpapier und anschließend schwimmen auf blockierende Lösung, die 2,5% BSA und 2,5% Serum von dem Tier des sekundären Antikörpers in T / PB 30 min bei RT.
- Inkubieren mit primärem Antikörper (in T / PB) bei RT oder O / N bei 4 ° C. Die optimale Zeit und Temperatur der Inkubation sowie Antikörperkonzentration, müssen experimentell bestimmt.
- Waschen Sie das Raster drei Mal (2 min jeweils) mit T / PB.
- Inkubieren mit sekundärem Antikörper (1:20 Anti-Kaninchen oder Anti-Maus gekoppelt bis 10 nm Gold) für 1 Stunde bei RT.
- Dreimal (2 min jeweils) mit T / PB.
- Postfix mit 2% Glutaraldehyd in T / PB für 5 min.
- Dreimal (2 min jeweils) mit T / PB und dann dreimal (2 min jeweils) mit gefiltertem Wasser.
- Inkubieren mit 2% Uranylacetat in Wasser für 10 min.
Während das Gitter Färbung, bereiten Sie einen CO 2-freien Kammer durch placinga Stück Parafilm im Zentrum eines Glases Petrischale. Dann legen 4-6 Pellets von NaOH in der Schale um den Parafilm um CO 2 in der Luft aufnehmen. Halten Sie die oben geschlossen für ein paar Minuten. Verwenden einer Pasteurpipette und schnellen Übertragen eines kleinen Volumens von Bleicitrat Reynold-Lösung des Parafilm im Glas Petrischale. Öffnen Sie die obere gerade genug, um die Pasteurpipette einlegen, um die Wiedereinführung von CO 2 in die Kammer zu minimieren.
HINWEIS: Um Reynolds Bleicitrat Lösung zu machen, kochen 100 ml entionisiertem Wasser in einem Mikrowellenherd und lassen in einem luftdichten Behälter kühl. In einem 50-ml-Messkolben mit Stopfen, mix 1,33 g Bleinitrat, 1,76 g Natriumcitrat und 30 ml des abgekochtes Wasser durch kräftiges Schütteln für 1 min. Dann zeitweise schütteln für 30 min. Zu diesem trübe Lösung, 8 ml 1 M Natronlauge und langsam umzukehren den Kolben ein paar mal. Lösung klar geworden. Wird die Lösung auf 50 ml mit der gekochten water. Bewahren Sie die Lösung dicht geschlossen halten. Wenn Niederschlag erscheint, zu verwerfen und einen neuen ein.
- In drei kleineren Bechern vorzubereiten warm, frisch gekochtes deionisiertem Wasser. Waschen Sie die Uranylacetat durch Eintauchen des Rasters im ersten Becherglas und sanft wirbeln sie herum für 30 sek. Wiederholen Sie diesen Schritt in den beiden anderen Becher.
- Öffnen Sie die Spitze des Glases Petrischale gerade genug, um das Gitter auf der Tropfen Bleicitrat Reynold-Lösung stellen. Falls möglich, tragen eine Maske während diese Weise, um die Atmung zu Bleicitrat vermeiden und um die Bildung von Niederschlag zu verhindern. Inkubieren für 10 min.
- Öffnen Sie die obere gerade genug, um das Gitter zu entfernen. Einatmen der Bleicitrat. Waschen Sie die Grid dreimal durch Eintauchen sequentiell in drei Bechern mit warmen, frisch gekochtes destilliertes Wasser. Lassen Sie das Gitter trocken auf einem Stück Filterpapier, Abschnitt up. Die Probe ist nun bereit für das Elektronenmikroskop.