Methodenartikel

Eine Methode zur High Fidelity optogenetische Kontrolle der Einzelpyramidenzellen In-vivo-

DOI:

10.3791/50291

⸱

2. September 2013

 ,  , 
1Institute for Behavioral Genetics, University of Colorado Boulder, 2Department of Psychology and Neuroscience, University of Colorado Boulder

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die jüngste Entwicklung der Neurowissenschaften Tools, die Genetik und Optik zu kombinieren, die als "Optogenetik", ermöglicht die Kontrolle über die neuronalen Schaltkreis-Aktivität mit einem beispiellosen Maß an räumlicher und zeitlicher Auflösung. Hier bieten wir ein Protokoll für die Integration von In-vivo-Aufnahme mit optogenetischen Manipulation von genetisch definierte Untergruppen von präfrontalen kortikalen und subicular Pyramidenzellen.

Zusammenfassung

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Optogenetische Methoden als ein mächtiges Werkzeug für die Aufklärung neuronalen Schaltkreis-Aktivität eine vielfältige Reihe von Verhaltensweisen in einem breiten Spektrum von Arten zugrunde liegenden entstanden. Optogenetischen Werkzeuge mikrobiellen Ursprungs bestehen aus lichtempfindlichen Membranproteine, die in der Lage, neuronale Aktivität ingenetically definierten Zelltypen über verhaltensrelevanten Zeitskalen zu aktivieren (zB Channelrhodopsin-2, ChR2) oder Stille (zB Halorhodopsin, NpHR) sind. Wir haben zuerst einen einfachen Ansatz für Adeno-assoziierten Virus-vermittelte Lieferung von ChR2 und NpHR Transgenen auf die Rücken subiculum und prälimbischen Region des präfrontalen Kortex bei Ratten nachweisen. Da ChR2 und NpHR genetisch anzielbare, beschreiben wir die Verwendung dieser Technik, um die elektrische Aktivität von spezifischen Populationen von Neuronen (dh Pyramidenzellen) in heterogenen Gewebe mit hoher zeitlicher Genauigkeit eingebettet steuern. Wir beschreiben hier die Hardware, kundenspezifische SoftwareBenutzerschnittstelle, und Verfahren, die für die gleichzeitige Lichtabgabe und elektrische Aufnahme von transduzierten Pyramidenzellen in einem in-vivo-narkotisierten Vorbereitung zu ermöglichen. Diese lichtreaktions Werkzeuge bieten die Möglichkeit zum Identifizieren der kausalen Beiträge verschiedener Zelltypen, um die Informationsverarbeitung und Verhalten.

Einleitung

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Die Fähigkeit, einen bestimmten Zelltyp innerhalb eines neuronalen Schaltkreis in einem zeitlich präzise Mode aktivieren oder zum Schweigen zu bringen ist entscheidend für das Verständnis, wie neuronale Schaltkreise verarbeiten verschiedene Arten von Informationen Emotion und Kognition zugrunde liegen. Experimentelle Kontrolle über intakte neuronale Aktivität hat loss-/gain-of-function Werkzeuge (z. B. elektrische Stimulation, pharmakologische Modulation, Läsion), die keine beschäftigte die selektiv zur Bekämpfung spezifischer Populationen von Neuronen, entweder auf einem zeitlichen oder räumlichen Skala erforderlich. Direkt Bewältigung dieser technischen Herausforderungen ist die Entwicklung und Anwendung von genetisch codierbar lichtempfindlichen Werkzeuge Neurowissenschaftlern ermöglicht, die elektrische Aktivität des ausgewählten Zelltypen während der gut definierten Verhaltens Ereignisse. Viele dieser lichtempfindlichen Proteine ​​sind mikrobiellen Ursprungs, mit dem Licht-gesteuerten Kationenkanal, Channelrhodopsin-2 (ChR2) 1, und der lichtgetriebenen Chloridpumpe, halorhodopsin (NpHR) 2,3, weit verbreitet.

Ein großer Vorteil der Optogenetik ist die Fähigkeit, genetisch zielspezifische Zellpopulationen in heterogenen Hirnregionen und die Technik wurde erfolgreich in einer Reihe von Modellorganismen (wirbellose Tiere zu nicht-menschlichen Primaten) 6.4 angewendet. Es wurden viele optogenetische transgenen Tieren erzeugt und sind im Handel erhältlich 7,8 jedoch Schaffung transgener Linien können arbeitsintensiv und kostspielig ist. Hier beschreiben wir ein Protokoll für viral vermittelte Abgabe von ChR2 und NpHR Gene unter der CaMKIIα Promotor in Ratten prelimbic Cortex und Rücken subiculum Verwendung eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (AAV)-Vektor. Im Vorderhirn ist CaMKIIα Ausdruck exklusiv für glutamatergen Pyramidenzellen 9. AAV ist üblicherweise für die Grundlagenforschung aufgrund seiner relativen Einfachheit der Herstellung und das Fehlen von Pathogenität sowie verwendete starke und persiStent Transgen-Expression, die mit diesen Vektoren 10 erreicht wurde. Zusätzlich beschreiben wir die Schritte und Hardware für die gleichzeitige Aufnahme und Lichtabgabe bei narkotisierten Kopf fest Ratten.

Protokoll

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1. Virus-und Lagervorbereitung

  1. Die Verwendung von replikationsinkompetent AAV-Vektoren für die Bereitstellung von Opsin-Gene auf Gehirn von Nagetieren ist für Biosafety Level 1 (BSL-1) zugelassen und erfordert einen angemessenen Schutz und Umgang mit Verfahren wie in der US-Regierung Publikation, in Mikrobiologie und biologische Sicherheit Biomedical Laboratories, an skizzierten die Centers for Disease Control Website bei ( http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm ).
  2. Um wiederholte Frost-Tau-Zyklen, Pipetten Virus aus Herstellers Fläschchen in kleineren Arbeits Aliquots in der Klasse II Biosicherheitswerkbank und an einem -80 ° C Gefrierschrank vermeiden.
  3. Vor stereotaktische Injektion, ermöglichen ein Aliquot auf Eis aufgetaut und dann kurz Spin-Down mit einer Tischzentrifuge.
  4. Langsam Verfüllung einer Hamilton-Glasspritze und Nadel mit einer kleinen Menge Silikonöl oder Mineralöl.Stellen Sie sicher, gibt es keine sichtbaren Luftblasen in der Spritze Barrel. Legen Sie die Spritze in einen Mikroinjektor Pumpe und befestigen Sie die Pumpe direkt auf die vertikale stereotaktischen Arm (dh stereotaktischen Manipulator).
  5. Senken Sie den stereotaktischen Arm, bis die Spitze der Nadel den Boden des Virus aliquoten Rohr berührt. Verwenden Sie den Regler für die Mikroinjektor Pumpe, um das gewünschte Volumen an Virus (1,5 ul für eine 1 ul Injektion) zurücktreten.
  6. Alle Materialien und Oberflächen, die in Kontakt mit dem Virus zu kommen, sollte mit einem Desinfektionsmittel wie Chlor Bleichmittel (10%) dekontaminiert werden.

2. Chirurgie und Virus Injection

  1. Betäuben Tier mit einem Gemisch aus Ketamin (Ratte, 125 mg / kg, ip) - Xylazin (Ratte, 10 mg / kg, ip) Cocktail. Um die Wirksamkeit der Narkose zu messen, prüfen, ob ein Reflex auf einer Zehe Prise und geben zusätzliche Dosen von Ketamin, wenn nötig. Mit Standard-aseptischen Operationsmethoden, legen Tier in einen stereotaktischen Apparat (David Kopf InInstrumente).
  2. Machen Sie einen Mittelschnitt durch die Haut auf der Oberseite des Tierschädel mit kleinen chirurgischen Schere oder Skalpell. Trennen Sie vorsichtig Bindegewebe und reinigen Sie die Oberseite des Schädels mit einer kleinen Knochenschaber.
  3. Stellen Sie sicher, dass der Kopf des Tieres Ebene, so dass die z-Koordinaten für Bregma und Lambda gleich sind. Bestimmen Sie die Koordinaten für die stereotaktische Zielgehirnbereich aus einer Hirnatlas wie The Rat Brain in Stereotaktische Koordinaten (George Paxinos und Charles Watson, Academic Press, 2007) oder Gehirn der Maus in Stereotaktische Koordinaten (BJ Keith Franklin und George Paxinos, Academic Press , 2007). Markieren Sie die Stelle der Injektion soll mit einem chirurgischen Stift.
  4. Vorsichtig dünn die Schädel über dem Zielgebiet mit einer Handbohrmaschine und aufhören, wenn der Bohrer den Boden des Schädels erreicht. Mit ein Paar extra feinen Pinzette, entfernen Sie die Knochen ausgedünnt, um die Dura freizulegen.
  5. Positionieren Sie die Spritzennadel über das Ziel sindein und senken Sie die Nadel bis zum dura berührt und diesen Punkt zu berechnen, die z-Koordinate. Ganz langsam senken Sie die Injektionsnadel in das Gehirn, bis die richtige Position erreicht ist z. In diesem Protokoll prälimbischen Bereich des medialen präfrontalen Kortex (2,7 mm anterior zum Bregma, ± 0,5 mm lateral zur Mittellinie und -2.2 mm von Dura) oder der Rücken subiculum (-6.0 mm anterior zum Bregma, 3,0 mm lateral ± zur Mittellinie bzw. -2,0 mm von Dura) in einem erwachsenen Sprague Dawley Ratten (ca. 275 g) ausgerichtet.
  6. Injizieren Virus bei einer Rate von 0,1 ul / min. Nachdem die Injektion abgeschlossen ist 10 Minuten warten, bevor Zurückziehen der Nadel, um einen Rückfluß des Virus auf der Gehirnoberfläche zu vermeiden.
  7. Verwenden Sie eine Naht nähen mit Kanüle, um die Haut zu versiegeln und Antibiotika gelten für die Wunde.
  8. Der Zeitverlauf der ChR2 NpHR und funktionelle Expression von AAV-Vektoren in Abhängigkeit von der Versuchsplanung und virale Titer variieren. Für dieses Experiment in vivo Aufnahmen wurden 18-21 Tage nach der Injektion durchgeführt.

3. Licht Lieferung und In-vivo-Erfassung von ChR2 oder NpHR-exprimierenden Neuronen

  1. Bringen Sie eine Wolframelektrode (~ 1-1,5 MOhm, Mikrosonden) auf eine Glaskapillare (Fisher Scientific) mit Superkleber.
  2. Verwenden Sie eine Faser Stripping Tool (Thorlabs), um das blanke Ende eines Multimode-Lichtwellenleiter (200 um Kerndurchmesser, Thorlabs) und sauber Faserspitze mit Ethanol aus. Sehr leicht punkten Faserspitze mit einem keilförmigen Diamantmesser (Thorlabs) und entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Faser (zB mit feinen Pinzette). Die Faser sollte leicht in die Partitur zu spalten.
  3. Verbinden des FC Ende der Faser an den PC-Anschluss an den Ausgangsanschluss eines 200 mW einzelnen Diodenlaser ( www.Lumiphy.com ) mit der gewünschten Wellenlänge. Stellen Sie sicher, dass geeignete Schutzbrille wird zu allen Zeiten bei der Arbeit mit Lasern getragen.
  4. Messen Sie die laser Intensität an der Spitze der optischen Faser mit einem optischen Leistungsmesser ( www.Lumiphy.com ). Für die in vivo-Aufnahmen kann die Lichtintensität so wenig wie 20 bis 100 mW / mm 2 zuverlässig wecken ChR2-oder NpHR-vermittelte Aktivierung oder Silencing bzw. neuronaler Aktivität.
  5. Setzen Sie das optische Faser in die Kapillare. Positionieren Sie die Faserspitze etwa 500 um über der Spitze der Wolframelektrode und binden einen dünnen Faden zweimal an wenigen Stellen in der Nähe der Spitze, so dass die Elektrode und die Faser gerade sind. Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen der Spitze der Elektrode und dem nächsten Knoten ist lang genug zum Einsetzen an die Zielregion.
  6. Bereiten Sie das Tier wie in den Schritten 2.1 und 2.2. Verwenden Sie die Anfangs Kraniotomie als Leitfaden für eine neue, saubere kleine Fenster in den Schädel für die Positionierung des Optrode (machen www.Lumiphy.com ). Machen Sie einen kleinen Schnitt an der dura mit einer feinen Nadel.
  7. Die Optrode vorsichtig absenken durch den Schädel und Fenster in das Gehirn auf die transduzierten Region mit einem Mikromanipulator (Narishige). Dann vorab die Optrode langsam in 10-50 um Schritte, bis die Entstehung eines auf Licht reagierenden Zelle.
  8. Eine kundenspezifische Software-Benutzerschnittstelle (Neurolux Pro www.Lumiphy.com ) in LabVIEW (National Instruments) geschrieben wird verwendet, um die einzelnen Diodenlaser zu steuern und zu visualisieren und aufzeichnen laufenden neuronalen Aktivität. Aufgezeichneten Signale werden mit einem EXAMP-20K (Kation Scientific) Verstärker Bandpass gefiltert (0,3-8 kHz) und National Instruments Analog-Digital-Karte (NI USB-6009) eingefangen. Die Neurolux Pro Benutzeroberfläche ermöglicht die Wahl der Analogeingänge (wählen Sie zwei Kanäle für die neuronale und TTL-Signal) und Digitalausgang. Der Benutzer kann die Abtastrate (20 kHz), die Baseline-Phase (Pre-Licht) und Post-Lichtperiode zu definieren. Der Benutzer kann die TTL-Laser stimulati definierenauf Impulsbreite, Frequenz und Stimulationsdauer (wenn Frequenz 20 Hz und Stimulationsdauer beträgt 500 ms, 10 Laserpulse mit definierter Impulsbreite geliefert werden). Der Benutzer kann auch Dauerlicht Lieferung wählen (z. B. Abbildung 1). Für wiederholte Aufnahmen kann der Benutzer auch die Anzahl der Pulszüge, und das Intervall zwischen den Zügen zu definieren. Daten können mit oder ohne Aufzeichnung auf der Festplatte erfasst werden.
  9. Nach der Aufnahme werden die Tiere mit der Ketamin / Xylazin betäubt und Cocktail transkardial mit physiologischer Kochsalzlösung und Paraformaldehyd (4%), um Optrode Platzierung und Opsin-Expression zu verifizieren durchblutet.

Ergebnisse

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Abbildung 1 zeigt einen Screenshot der kundenspezifische Software (Neurolux Pro) in LabVIEW-Umgebung entwickelt (National Instruments) für die gleichzeitige Aufzeichnung von neuronaler Aktivität und Steuerung von Lichtimpuls-Parameter (dh Impulsfrequenz, Impulsbreite, Stimulationsdauer). Das Software-Programm sendet ein Befehlssignal zu einem digitalen Erfassungseinrichtung, die TTL-Impulse für die Kontrolle über die einzelnen Diodenlaser erzeugt. Zusätzlich werden die Software-Programm zeigt und speichert die aufgezeichneten neuronalen Aktivität und TTL-Signale geliefert. Diese Signale werden durch die Erfassungseinrichtung bei einer definierten Abtastrate (z. B. 20 kHz) digitalisiert. Zeichneten Signale werden als ein zweidimensionales Array mit doppelter Genauigkeit in einer Binärdatei gespeichert.

Figur 2 zeigt die individuelle Optrode bestehend aus einer Wolframelektrode mit einer optischen Faser befestigt ist. Eine optische Faser wird an der Elektrode unter Verwendung dünner Faden an drei festenPunkten. Falls erforderlich, können Super-Klebstoff verwendet werden, um ihnen zu haften. Allerdings vermeiden dauerhaftes Fixieren der optischen Faser an die Elektrode, denn obwohl die Elektrode mehrmals Lichtübertragung durch die Faser wieder verwendet werden bei wiederholtem Gebrauch verschlechtern und sollten gespalten und gereinigt oder mit jedem Einsetzen in das Gehirn zu ersetzen.

Linke Platten aus Abbildung 3 zeigen Fluoreszenzbilder der verstärkten gelb fluoreszierendes Protein, Anzeichen für eine tatsächliche und ChR2 NpHR Ausdruck. Diese Fotografien zeigen repräsentative NpHR Ausdruck in Rattenrücken subiculum (3A) und ChR2 Ausdruck in prälimbischen Kortex (3B). Viral-Expression wurde vor allem auf die Rücken subiculum und prälimbischen Kortex beschränkt (z. B. einige Fluoreszenz in Gyrus dentatus (Abbildung 3A, links)). Es wurden auch die Spuren der Elektrode (dünne Spur, Pfeilkopf) und Glasfaser (dicke Spur, Pfeil) beobachtet.

Abbildung 4 zeigt, dass ChR2 induziert zeitlich präzise Spick in Ratten prälimbischen Kortex. 4A ist ein Beispiel Spur von ChR2 ausgelöste Aktionspotentiale in Reaktion auf 20 Hz Lieferung von 10 ms blauen Lichtimpulse Ratte prälimbischen Cortex. Raster Grundstück (4B) zeigt ChR2-induzierte Aktivierung in sechs Vertreter Neuronen. Alle aufgezeichneten Neuronen zeigte Licht-evozierte Spicken mit perfekter Treue. Im Gegensatz zu ChR2, NpHR schnell und reversibel spontane Aktivität in vivo in Ratten prälimbischen Kortex (rechts von Abbildung 4) zum Schweigen gebracht. 4C ist ein Beispiel zeigt, dass eine kontinuierliche Spur 532 nm Beleuchtung (10 s) der prälimbischen Kortex exprimieren NpHR unter der CaMKllα Promoter beseitigt spontane Single-Unit-Aktivität in vivo. Beachten Sie, dass die komplette Silencing prälimbischen Pyramidenzellaktivität ist zeit gesperrt, um die 10 Sek. Dauerlicht Lieferung. Niedriger Raster Grundstück (4D) zeigt NpHR-induzierten Silencing in sechs Vertreter Neuronen. Sowohl in vivo-Aufnahmen sind typisch für diejenigen von erwachsenen Sprague-Dawley-Ratten erhalten, in dem AAV-vermittelte Abgabe von mikrobiellen Opsin Gene trat 18-21 Tage vor.

Figur 5 zeigt das Ergebnis der wiederholte ChR2 Stimulation einer Ratte prelimbic Pyramidenzelle. Blaue Lichtimpuls (10 ms) wurde bei 20 Hz für 5 sec (100 Impulse gesamt) ausgeliefert. Spannung Spuren des Lichts hervorgerufenen Spick wurden immer wieder alle 2 Minuten während einer 2 Stunden Aufnahme-Session (61 Wiederholungen insgesamt) erworben. Selbst bei der Verwendung dieses wiederholende Stimulationsprotokoll, ChR2 induzierte stabile und robuste Spick in Reaktion auf die Lichtabgabe.

6 und 7 zeigen die Ergebnisse der NpHR-induzierte Photoinhibition und ChR2-driven Photoaktivierung von Ratte subicular Neuronenaktivität. Wie es der Fall in prelimbic Hirnrinde waren NpHR und ChR2 Lage,vermitteln die lichtinduzierte zeit gesperrt Hemmung und Aktivierung der Opsin-transduzierte subicular Neuronen mit hoher Reproduzierbarkeit.

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Fig. 1 ist. Screenshot der Neurolux Pro-Software-Schnittstelle für die gleichzeitige Lichtabgabe und elektrophysiologische Aufnahme. Abgebildet Trace zeigt NpHR induzierten Silencing der spontanen Aktivität der Ratte prälimbischen Pyramidenzellen als Reaktion auf 10 Sek. Dauer 532 nm Lichtabgabe. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

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2. Hohe Leistungs Bild von benutzerdefinierten Optrode. Eine optische Faser wird in Glaskapillare mit einer Wolframelektrode angebracht ist und mit der Elektrode mittels Faden fixiert. Der Abstand von Mitte zu Mitte zw.een die Elektrodenspitze und der Faserspitze ist etwa 500 um.

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3. Viral-Expression und Optrode Platzierung. (Links) Fotos zeigen repräsentative NpHR Ausdruck in Rücken subiculum (A) und ChR2 Ausdruck in prälimbischen Kortex (B). (Rechts) Schematische, die den Ort, wo jedes Foto aufgenommen wurde darstellt. Die Pfeilspitze und Pfeil in jeder Photographie zeigen den Ort der Wolframelektrode und der optischen Faser auf. SUB: subiculum, DG: Gyrus dentatus, PL:. Prälimbischen Kortex Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

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Abbildung 4. In vivo elektrophysiologischen Ableitungen von ChR2 oder NpHR-transduzierte Ratte prelimbic Kortex. (A) Beispiel Spur von ChR2 ausgelöste Aktionspotentiale in Reaktion auf die Lieferung von 20 Hz Blau (473 nm) Lichtpulse (10 ms, blauer Balken). (B) Raster Diagramm, ChR2-induzierte Spick in sechs Vertreter Neuronen. Jede Aktivität wird als Punkt aufgetragen. (C) Beispiel Spur von NpHR-induzierte Unterdrückung der spontanen Aktivität im Dauer Grün (532 nm) Lichtbeleuchtung (10 sec, grüner Balken). (D) Raster Diagramm, NpHR-induzierten Silencing in sechs Vertreter Neuronen. Jede Einheit Aktivität wird als Punkt dargestellt. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

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5. Repetitive 20 Hz ChR2 getriebenen Spick einer Ratte prälimbischen Pyramidenzelle in vivo. (A) Spannung Spuren der Licht-evozierte Spickzu den Zeitpunkten 0, 30, 60, 90 übernommen, 120 min nach Beginn der Aufzeichnungen. (B) Diagramm, Raster alle 61 Wiederholungen (2 min inter-trial-Intervall, 120 min Gesamt) der lichtinduzierten Aktivierung. Jede Einheit Aktivität wird als Punkt dargestellt. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

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Abbildung 6. In vivo elektrophysiologischen Ableitungen aus NpHR-transduzierte Rattenrücken subiculum. (A) Beispiel-Trace zeigt, dass 10 Sek. Dauer 532 nm Beleuchtung (grüner Balken) der Rücken subiculum ausdrücken NpHR beseitigt spontane Aktivität. (B) Durchschnittswellenformen der beiden aufgezeichneten Einheiten aus der obigen Spur. Die Amplitudenschwelle zum Identifizieren zwei unterschiedlichen Neuronen verwendet. (C) Raster Grundstück mit fünf Wiederholungens NpHR induzierten Silencing dieser Einheiten. Jede Aktivität wird als Punkt aufgetragen.

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Abbildung 7. Repetitive 20 Hz CR2-driven Spick einer Ratte Rücken subicular Neuron in vivo. (A) Spannungs Spuren des Lichts hervorgerufene Spiking zu den Zeitpunkten 0, 30, 60 übernommen, 90, 120 min nach Beginn der Aufzeichnungen. Einschub: Platzen typische Aktivität dieser Zelle. (B) Diagramm, Raster alle 61 Wiederholungen (2 min inter-trial-Intervall, 120 min Gesamt) der lichtinduzierten Aktivierung. Jede Einheit Aktivität wird als Punkt dargestellt. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Diskussion

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Eine Vielzahl von Techniken sind für genetisch-Targeting mikrobiellen Opsin-Gene auf diskrete Hirnregionen bei Nagetieren zur Verfügung. Virale Gentransfer eine relativ kostengünstige und schnelle Ansatz für die Vermittlung und ChR2 NpHR Ausdruck mit Zelltyp-Spezifität. AAV-Vektor-Systeme sind eine häufige Wahl für den Einsatz in optogenetische Experimente aufgrund der hohen Produktions Titer, die während der Lagerung, seinen Mangel an Pathogenität, und seine Fähigkeit, langfristige Genexpression 10 zu erzeugen stabil bleiben. Viele der Opsin-Konstrukte mit Zelltyp-spezifische Promotoren sind in einer Vielzahl von AAV-Serotypen von Vektor-Kerneinrichtungen wie der Universität von Pennsylvania (im Handel erhältlich http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore ) oder der Universität of North Carolina in Chapel Hill ( http://genetherapy.unc.edu ). Ein Nachteil bei der AAV-Technologie ist diebegrenzte Verpackungskapazität (~ 4,7 kb), die eine Beschränkung der Transgen-Kassette Größe, die für die zellspezifische Targeting eingesetzt werden können platziert. Als Alternative, lentivirale Vektoren, die eine größere Verpackungskapazität haben, können Opsin Targeting unter der Kontrolle von Promotorsequenzen größer aufzunehmen.

Die Verwendung eines Optrode ermöglicht eine zuverlässige Erkennung von elektrophysiologischen Signalen in Kombination mit zeitlich präzise Licht Lieferung. Wie oben beschrieben, jedoch ausreichende Sorgfalt bei der Konstruktion erforderlich ist. Da die optische Faser gespalten ist zerbrechlich, kann binden den Faden zu fest bewirken, dass die Faser zu brechen. Obwohl der Optrode für mehrere Aufnahmen benutzt werden, sollte die Elektrode und die optische Faser vor dem Einsetzen gereinigt werden (oder manuell, im Fall der optischen Faser blanke Ende gespalten), da die Impedanz der Elektrode und der Qualität des abgegebenen Lichts wird abgebaut bei wiederholter Anwendung.

Während electrophysiological Aufnahmen ist es wichtig, dass der Optrode langsam vorgeschoben werden. Das hier verwendete Optrode hat etwa 350 um Dicke (Wolfram-Elektrode: 125 um; Kern der Glasfaser: 200 um) und schnelle Absenken könnte die Bewegung von Hirngewebe führen. Lichtinduzierte Artefakte könnte auch mit besonderem Aufnahme-und Lichtabgabe-Set-ups 11-12 betrachtet werden. Obwohl wir fanden keinen lichtinduzierten Artefakt in unserer experimentellen Zustand können Aufnahmen außerhalb der transduzierten Gehirnbereich potentiell als Kontrolle für Licht Artefakte verwendet werden. Eine weitere Überlegung bei der Aufnahme ist die erforderliche Lichtintensität zur Beobachtung von Veränderungen in ChR2-oder-exprimierenden Neuronen NpHR, vor allem für Langzeitaufnahmen. Starke Laserintensität und langLaserBeleuchtung kann in der Gewebeschädigung und / oder eine verminderte Reaktion auf nachfolgende gelieferten Licht 12-13 führen. Für Verhaltensexperimente für ELIMINIERU die Verwendung eines viralen Vektors Steuer erforderlichg eine Wirkung aufgrund der Wärme von der Faser geliefert. Bei vielen der im Handel erhältlichen optogenetischen Konstrukte sind komplementäre Steuerkonstrukte, in denen das Opsin-Gen-Sequenz entfernt wurde.

Man beachte, dass gentechnisch ChR2-Varianten mit verbesserten Eigenschaften und die Kinetik wurden zusammen mit anderen Silencing opsins, die für bestimmte experimentelle Fragestellungen 14-15 besser geeignet sein können, entwickelt werden. Zum Beispiel kann eine neue Variante ChR2 durch gezielte Mutagenese etabliert, die als "cheta" können High-Fidelity-Spiking-Neuronen bei Frequenzen (bis zu mindestens 200 Hz) oberhalb der ursprünglichen ChR2 14 anzutreiben.

Die Kombination von in vivo Lichtabgabe und gleichzeitige Aufnahme von neuronalen Antworten ist ein entscheidender Schritt bei der Schaffung kausalen Beziehungen zwischen gemusterten Aktivität in genetisch gezielt Zellpopulationen und entsprechende Zeit-locked Verhaltens Veranstaltungen. Die Verfahren und hardware hier skizzierte einen einfachen Ansatz für die Umsetzung Optogenetik für in vivo-Kopf-Aufnahmen in festen Nagetiere.

Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde vom National Institute on Drug Abuse (NIDA) Zuschuss R01 DA24040 (DCC), University of Colorado Innovative Seed Grant (DCC) und NIDA Ausbildungsförderung T32 DA017637 (MVB) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Spritze Hamilton7653-0110 μ l
Abnehmbare NadelHamilton7803-0331 Gauge, abgeschrägte
Spitze MikroinjektorpumpeWorld Precision InstrumentsUMP3
PumpensteuerungWorld Precision InstrumentsSYS-MICRO4
SilikonölAlfa AesarA12728
LaserschutzbrilleKentekKMT-4501
Multimode-GlasfaserThorlabsBFL37-200200 μ m Durchmesser Kern, 0,37 NA
FaserabisolierwerkzeugThorlabsT12S21für 200 μ m Durchmesser Kern Multimode Faser
Optisches LeistungsmessgerätLumiphy LLCa href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com
PhotodetektorNewport818-SL/DB
Blauer Laser (445-473 nm, 100-200 mW)Lumiphy LLCa href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com gekoppelt an ein 200 μ m Multimode-Faser mit FC/PC-Adapter
Green Laser (532 nm, 100-200 mW)Lumiphy LLCa href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.comgekoppelt an ein 200 μ m Multimode-Faser mit FC/PC-Adapter
Wolfram/FaseroptrodeLumiphy LLCa href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.comLumitrode
Glas KapillarrohrFisher Scientific22-362-566
Hydraulischer MikromanipulatorNarishigeMO-22
VerstärkerKation ScientificExAmp-20K
DatenerfassungsgerätNational InstrumentsNI USB-6009
Nagetier-Kopfstütze für AufnahmenLumiphy LLCa href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com
Stereotaktische Einheit für KleintiereDavid Kopf InstrumentsModell 963
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Referenzen

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  1. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  2. Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution. PLoS One. 2 (3), e299(2007).
  3. Zhang, F., Wang, L. P., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
  4. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  5. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
  6. Han, X. Optogenetics in the nonhuman primate. Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).
  7. Zhao, S., Ting, J. T., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  8. Madisen, L., Mao, T., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing. Nat Neurosci. 15 (5), 793-802 (2012).
  9. Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, eg Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system. Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).
  10. McCown, T. J. Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS. Curr Gene Ther. 5 (3), 333-338 (2005).
  11. Cardin, J. A., Carlen, M., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).
  12. Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).
  13. Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice. J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).
  14. Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).
  15. Chow, B. Y., Han, X., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).

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Schlagwörter

Channelrhodopsin 2Halorhodopsinvirale Vektortransferstereotaktische InjektionGlasfaserelektrodesimultane AufzeichnungIn vivo ElektrophysiologieLichtapplikation

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