使用的非肥胖型糖尿病小鼠胃排空的评估[ Published: March 23, 2013 doi: 10.3791/50301

DOI

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Christopher T. Creedon¹, Pieter-Jan Verhulst¹, Kyoung M. Choi¹, Jessica E. Mason¹, David R. Linden¹, Joseph H. Szurszewski¹, Simon J. Gibbons¹, Gianrico Farrugia¹

¹Enteric Neuroscience Program, Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic

Summary

与一种非侵入性测定胃排空[

Abstract

在小鼠的胃排空研究一直局限于由无法遵循胃排空以来的变化在同一动物的最常用的技术需要杀死动物和死后恢复，用餐^1,2。这种方法可以防止纵向研究，以确定胃排空的变化，随着年龄的增长和疾病的进展。目前常用的^{[13 C]-}辛酸呼气试验对人类³被修改用于在小鼠^4-6和大鼠⁷我们以前表明，这个测试是可靠和胃排空的变化响应于在对药物的反应，以及在糖尿病患者病情恶化^。在这段视频中演示的原理和实际执行这个修改后的测试进行了解释。在以前的研究中，NOD LTJ小鼠，1型糖尿病⁹的典范。这些小鼠的发展一定比例的胃轻瘫的症状，一期糖尿病并发症ES特点是胃排空延迟，无机械性梗阻，胃^10。

本文演示了如何训练的老鼠进行测试，如何准备试验餐，并获得4小时胃排空的数据，如何分析所获得的数据。在本研究中所使用的碳同位素分析仪是适合的空气样品的自动采样从多达12只小鼠在同一时间。这种技术允许的纵向后续胃排空组小鼠与糖尿病或其他长期疾病。

Introduction

这手稿描述的技术和方法上的考虑，在非侵入性测量小鼠胃排空的影响。通过这里描述的协议，研究人员可以可靠和可重复的在胃的排空，由于疾病发展变化，研究药物制剂的影响，对胃排空及胃的排空，以治疗基础疾病或缺陷^{6,8， 11,12。}在以前的出版物中，应用^{13 C}辛酸呼气测试，被证明是一个有用的方法，测量胃排空的人类和动物^3,8。本文详细介绍了必要的程序，以获得可靠的数据，在6〜8个月，有必要对糖尿病小鼠胃排空的纵向研究。遵循这个协议相比此前公布的方法的优点是，研究者可以放心的数据obtained将是可靠和可重复性。此外，这里描述的自动化系统，用于收集和分析的气体样品的动物的数量增加，同时在一项研究中，可以遵循的。总之，本文的目标是要找出保持成瘾的老鼠的测试，得到的结果，减少变异的关键因素。

小鼠体内检测胃排空，禁食过夜，投入透明的塑料试验箱，恒定气流。基线后小老鼠就习惯于管，呼出的¹³ CO ₂级确定和气流相应的调整。接下来，我们测试管理用餐组成的蛋黄混合，用¹³ C-标记的辛酸。因为禁食小鼠和训练，他们一般在2分钟内吃的试验餐。施用的辛酸还没有在胃中吸收，但将会采取在十二指肠d将浏览在肝脏中代谢成¹³ CO _2，这是释放和呼出，从而在周围的空气中的¹³ CO _2的富集。收集空气样品，以确定的时间间隔，并且由碳同位素分析仪分析。在这整个过程的限速步骤是胃的排空和肺排泄的¹³ CO ₂直接对应的标记餐的胃排空。

图1。胃的排空装置的示意图。禁食一夜后，小鼠被放置在透明的商会，使他们能够自由地移动和转动。入口管允许新鲜的和恒定的空气流入和一个出口导致的同位素分析仪测量的^{13 C-12}C比值的呼出一口气。该室也有一个中央端口提供的食物中含有^{[13 C]}辛酸。

Protocol

1。对小鼠的培训和习惯化

1. 分析前，把所有的小鼠在测试室恒定气流的2-4小时，以习惯于他们的测试条件。这将显着降低压力水平，否则可能会导致异常的检测胃排空延迟。治疗小鼠犹如胃排空实验相同的方式运行。准备蛋黄（见下文），没有加入辛酸和饲料0.2克至每一个鼠标。
2. 重复这个过程，直到老鼠足够的训练（一般为2-3倍）。通常很容易将小鼠驯化，只要保持相同的环境条件。

注：非习小鼠的继续走动，约1小时后转移到腔，大便和小便频繁，而习惯于的小鼠迅速解决他们在新的环境和休息悄悄。

没有（TE）：在实验过程中：监控动物的迹象，如过量排尿，排便，缺乏兴趣吃鸡蛋的习惯损失。如果是这样的情况下，考虑在一个空室重新仍属获得胃排空数据的前1-2次。一致性是非常重要的，而做这个实验。每次做的事情完全一样的方式是只有这样，才能得到可靠的和可重复的结果。这包括给予治疗（ 如胰岛素）每天在相同的时间，而不是分离的小鼠的笼子里的队友，除非绝对必要，空腹的老鼠，并在同一时间开始胃排空试验，并以同样的方式处理的小鼠。

2。同位素制备含试餐

1. 开始在50ml falcon试管中称量5克蛋黄。重复这些步骤，每一个实验一天的时间准备一顿一个新的测试。
2. 加入10μl的辛酸与concentr大力功能明显下降，2μL/克到50毫升Falcon管中含有鸡蛋和混合1分钟，用锅铲在猎鹰管。
3. 鸡蛋然后转移到玻璃烧杯中，并加热超过本生灯直到它凝固，其一致性是合适的，以使小球。这通常需要约30秒。

注：蛋黄球重达0.2克每鼠标。这是很重要的，在所有的小鼠中的累积剂量保持恒定。

3。开始实验

1. 一旦训练和准备，对胃的排空，快速的小鼠的金属“网底”禁食架上，以防止coprophagia过夜（12小时）。确保他们有免费的饮用水。由于糖尿病小鼠中使用在目前的实验中，它们不应该被禁食16小时以上。
2. 从胃排空室开始。使用洁净室和盖已风干。此外，任何的分析仪或CO ₂的空气供给管连接腔室应防潮自由水可以由分析仪读出的信号干扰
3. 连接腔室，以提供一个恒定的空气流的入口管。然后将出口管机室。关闭管和打开的气流。

注：应用极少量的凡士林结束时盖盖，使他们容易和安全地密封。这是需要收集所有的小鼠产生的二氧化碳密封。

4。实验步骤

1. 通过衡量每个鼠标启动。体重是衡量其持续良好的健康状况。在适当的腔，然后将每个鼠标。这当然是重要的有空气流入到腔室，在这个时候。
2. 开始测量，使小鼠腔前调整来适应环境的空气。
3. 一旦小鼠出现平静，这可能需要几分钟的时间，每个鼠标室调节空气流量。这可能是不同的各小鼠。通常情况下，空气流被调整在实验开始时，以确保，呼出的CO ₂达到正在使用的任何设备可检测的水平，以确保该水平保持足够低，以确保健康的空气周转。我们使用初始CO _2浓度百万分之1000至1500。
4. 如果有困难的调整，检查是否有漏气现象。然后重复这个过程，每个室，观看新一轮的测量，看是否调整气流已经纠正了CO _2。重要的是要获得稳定的基线，读取之前喂养的小鼠。自校准功能，我们使用一台机器。如果这不是应检查的情况下校准。
5. 当做到这一点，管理的鸡蛋餐第一个鼠标和记录的时间，每个鼠标接收的食物。
6. 我们运行该过程4小时，以获得足够的值，用于装配的¹³ CO ₂富集曲线为每个鼠标。检查对小鼠每30-60分钟，以确保的CO ₂水平仍然是安全的小鼠。
7. 准备新的箱子，里面装有食品年底前的测试，所以老鼠可以吃后立即测试结束。

Representative Results

从三个不同的小鼠设置，典型的数据在图2中所示。从小鼠胃排空正常的黑色图形表示的数据点。它示出的^{13 C]}是表示为每小时的给药剂量的百分比表示为时间的函数的呼出的空气中回收的馏分。蓝色曲线是鼠标加速胃排空的T半值的40分钟，而红色曲线是从小鼠胃排空延迟与一个T的一半价值168分钟。建立在我们的实验室^7，正常非糖尿病NOD小鼠年龄胃半排空时间为9-15周在先前的研究范围从62到131分钟的灰色方块为代表的。然后，数据点是与下面的式^（8）的非线性回归曲线拟合：

Y = ^{B E-CT}

其中，y是的百分比1/2）

计算出的数值积分程序使用反伽玛功能。我们已得到的结果从几千的研究与约10％的生物鼠标内部变异性。

图2。代表的胃排空数据从三个不同的小鼠与正常（黑线），延迟（红色曲线）和加速（蓝色曲线）胃排空。的灰色框突出正常值。在方块中示出的非线性回归曲线的方程。

Discussion

本文所描述的技术允许重复的和非侵入性的， 在体内测量的固体小鼠胃排空的影响。这种系统具有的优点在于，将动物没有在测量室中的限制，，使他们可自由移动和转动。由于这是一个陌生的环境中，这些老鼠仍然需要进行培训和熟悉的试验室，以防止压力的影响胃排空。在一般情况下，我们假定胃排空数据是可靠的，如果连续胃排空试验帧内小鼠之间的变异小于10％。

这份报告是一份更详细的说明我们以前的报告胃排空测量小鼠^8,11,12和系统故障排除的问题，还包括其他信息。的主要变形例是使用LGR同位素分析仪，用于测量气体浓度水平。在本研究中，我们使用的分析仪测量¹² CO 2，13 CO _2，和H _{2 O}的浓度每隔一秒。的多个输入单元中的计算机控制阀自动切换流小鼠室每25秒之间的检测器。因此，12只可同时分析与读数之间的时间间隔5分钟。它必须指出，数据也可以通过以下方式获得手动采样呼出空气的和随后的分析。如果手动采样或使用其他设备，使确定获得读数在约10分钟的时间间隔。我们的系统和频率，样品收集装置的灵敏度，胃排空曲线是更可靠，更容易适应，因此，我们发现，我们用这种改进的方法得到更具有可重复性的数据。

这种技术的主要缺陷发生时，老鼠在规定时间内不能吃的饭，当老鼠失去了他们的习惯室和检测系统时出现技术问题温度。如果吃的饭和损失的习惯，通常不继的关键步骤有定期进行测试的结果。连续3次的测试之后相隔7天或更少，我们的小鼠变得习惯于测试和吃的饭。一旦驯化，获得可靠的数据，如果将小鼠实验的其余部分至少测试一次，每2周。如果由于某种原因，小鼠没有经过测试3个或更多个星期了两期培训班通常会在一周内确保习惯。如果处理的动物的人员改变，那么建议再培训的小鼠和劝阻的强烈香味的肥皂和/或香水的人处理的小鼠，这一点尤为重要。与检测系统的困难往往是由于水平低¹³ CO ₂所产生的像老鼠一样的小动物。该检测器必须被校准和某些检测器的如红外线基础的系统，它是非常小鬼ortant以减少水的含量的样品之前测量到最低限度。

这项技术有一些限制，除非研究者希望研究胃排空更频繁地在相同的鼠标，每3天一次。建议不要快速的鼠标，所以常常和，等定期限制饮食可以改变胃的功能。该技术的修改可以作出测量液体的胃排空的方法，这是一个有用的潜在的应用。

用于测定胃排空，包括显像或测量的时间保留内容的其它方法在固定时间后有显着更多的局限性，它包括的压力的过程中的问题，或者由于需要杀死的动物在每次试验结束。压力包括在测量过程中的试验餐或约束的动物灌胃。呼吸测试的优点是，鼠标自由移动，而不是麻醉或镇静剂以任何方式。

综上所述，在^{13 C-}辛酸呼气试验允许研究疾病的进展与年龄，治疗和这些数据然后可以与其他生理参数的变化，并在同一动物的组织学评价。在其他应用程序，测试也可以让药物可以直接修改胃排空以及调查的发展变化，胃排空由于疾病或其他干预措施的动物治疗的研究。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A source of constant air-supply, flow as well as composition	central air supply in the research facility
130 ml sampling chamber that has air inlet, air outlet, and food administration opening Plastic tubes for air supply	In-house built
Octanoic acid	Cambridge isotope laboratories (Andover, MA)	CLM-293-1
To prepare the egg meal: small beaker 50 ml plastic tube Bunsen burner egg spatula	Any supplier		Try to be consistent with the egg supplier since the nutritional content and palatability of the eggs can affect ingestion and gastric emptying of the meal
Carbon dioxide isotope analyzer	Los Gatos Research Inc. (Mountain View, CA)