Methodenartikel

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

DOI:

10.3791/50310

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4. April 2013

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1Centre for Vascular Research and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales, 2School of Chemistry and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Ein Verfahren zur Montage von Klebstoff und löslichen Gradienten in einer Mikroskopie Kammer für lebende Zellmigration Studien beschrieben. Die gebaute Umwelt verbindet Antifouling Oberflächen und Kleber Tracks mit Lösung Steigungen und ermöglicht somit ein, um die relative Bedeutung von Leitlinien Hinweise zu bestimmen.

Zusammenfassung

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Zellen können zu erfassen und zu höheren Konzentrationen an Klebstoff Zeitgeber wie die Glycoproteine ​​der extrazellulären Matrix und löslichen Cues wie Wachstumsfaktoren migrieren. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur gegenüberliegenden Gradienten aus Klebstoff und löslichen Signale in einem Mikrofluidik-Kammer, die mit lebenden Zellen zu schaffen. Ein Copolymer aus Poly-L-Lysin und Polyethylenglykol (PEG-PLL) wird eingesetzt, um Glasdeckgläser passivieren und verhindern eine unspezifische Adsorption von Biomolekülen und Zellen. Weiter, Mikrokontaktdrucken oder Dip-Pen-Lithographie verwendet werden, um Spuren von Streptavidin an den passivierten Oberflächen zu schaffen, um so Verankerungspunkte für das biotinylierte Peptid Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD) als klebende Cue dienen. Mikrofluidische Vorrichtung wird auf die modifizierte Oberfläche platziert und verwendet, um den Gradienten des Klebstoffs Queues (100% bis 0% RGD RGD) an den Streptavidin Spuren zu erzeugen. Schließlich wird der gleichen mikrofluidischen Vorrichtung verwendet, um einen Gradienten eines chemoattraktiven erfolg erstellenh wie fötalem Rinderserum (FBS), wie die lösliche Cue in der entgegengesetzten Richtung des Gradienten aus Klebstoff Signale.

Einleitung

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Regie Zellwanderung ist eine grundlegende Eigenschaft von vielen Zellen und ist ein wichtiger Aspekt von vielen physiologischen Prozessen, einschließlich der embryonalen Entwicklung, Infektabwehr und Wundheilung. Zusätzlich Zellwanderung spielt auch eine wichtige Rolle bei vielen Krankheiten wie Gefäßerkrankung, Tumorzellenmetastase und chronischen Entzündungen 1,2. Während die klassischen Zuständen der Zellwanderung - Polarisation Vorsprung Erweiterung, Bildung Haftung, Krafterzeugung und hinten Rückzug - in der Regel 3,4 angenommen werden, hat die Aufklärung der raumzeitlichen Mechanismen, durch die Signal-Integration koordiniert wurde schwieriger.

Die extrazelluläre Matrix (ECM) dient als Substrat für die Zelladhäsion und durch inhärente chemische und physikalische 5 6 Vielfalt stellt Richtungshinweise für Zellennavigationsmodus 7,8. Neben diesen Klebstoff Cues 9, lösliche Faktoren 10-12 </ Sup>, wie Chemokine und Wachstumsfaktoren können induzieren gerichteten Zellmigration durch chemoattraktive Rezeptoren und deren stromabwärts motogenic Signalisierung. Derzeit ist es nicht bekannt, ob Eingriff und Signalisierung durch Adhäsionsrezeptoren (dh Integrine) oder chemoattraktive Rezeptoren, wie Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK), dominant sind. Auch ist es nicht bekannt, ob Hierarchien von Rezeptor-Systeme Zelltyp spezifisch sind.

Live-Mikroskopie bietet eine Fülle von Informationen, die nicht zugänglich ist lose Assays und kann mit mikrofluidischen Bauteilen kombiniert werden, um Steigungen von immobilisierten 13,14 und löslichen Cues 15 16 zu generieren. Das hier beschriebene Verfahren verwendet eine Reihe von einfachen und bewährten Schritte zur Oberflächenmodifizierung in Verbindung mit einem handelsüblichen Mikrofluidik-Kammer, eine Abbildungsanordnung Assay für Zellmigration, dass leicht in einer Zelle Biologielaboranten (Abbildung 1) implementiert werden erstellen. Die zusammengebauteMikrofluidikvorrichtung besitzt optische Eigenschaften, die vergleichbar mit Glas und 17 sind die Steigungen der diffundierbare Moleküle sind für mindestens 16 Stunden stabil. Das System kann für Epifluoreszenz-Mikroskopie und fortschrittliche Techniken verwendet werden. Im Gegensatz zu anderen Chemotaxis Setups 18, eignet sich dieses System zum Aufzeichnen langsam wandernden, adhärenten Zellen. Wichtig ist, ist das System modular aufgebaut und leicht ermöglicht die Einführung alternativer Kleber oder lösliche Migration Signale und Prüfung verschiedener Zelltypen.

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Protokoll

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Ein. Passivierung von Deckgläsern mit PLL-PEG-Biotin

Dieser Schritt ist für die Oberfläche zu passivieren, so dass Zellen anhaften und auf spezifische Bereiche auf dem Deckglas, das mit microcontract Drucken (Schritt 2-3a) oder Dip-Pen-Lithographie (Schritt 3b) angelegt werden migrieren. Zur Passivierung ist ein Copolymer aus Poly-L-Lysin (PLL) und Polyethylenglykol (PEG) eingesetzt, bei denen 20% der PEG-Moleküle an Biotin (PLL-PEG-Biotin) gepfropft werden.

  1. Um Deckgläschen (18 mm x 18 mm), tauchen sie in ein Rack in 100% Ethanol reinigen und legen die Zahnstange in einer Ultraschallbehandlung Bad für 30 min. Trocknen Sie die Deckgläschen in der Luft oder unter einem Strom von Stickstoff.
  2. Anschließend beschallen die Deckgläser für 30 min in 1 M NaOH. Danach spülen Sie die Glasoberflächen durch vorsichtiges Eintauchen des Rack in einem Becher mit 1,5 l Milli-Q H 2 O. gefüllt Wiederholen Sie den Spülvorgang dreimal mit frischem Milli-Q H 2 O jeder Zeit. Trocknen Sie die Deckgläschen ineinen Ofen bei 60 ° C.
  3. Die Hälfte der sauberen Deckgläschen einzeln in einer feuchten Kammer, die aus einer 24-Well-Platte teilweise mit H 2 O. gefüllt wird Drop 15 ul PLL-PEG-Biotin (1 mg / ml) in PBS für jedes Deckglas. Nehmen Sie die andere Hälfte der verbleibenden sauber Deckgläschen und sorgfältig Sandwich die PEG-Lösung. Lassen Sie die Deckgläser für 1 Stunde in der feuchten Kammer. Schieben der sandwichartig Deckgläser sanft voneinander weg ohne Kratzen der PEG-beschichteten Oberfläche und spülen sie mit Milli-Q-H 2 O. Das Wasser sollte abrutschen leicht auf der PEG-behandelten Seite. Falls erforderlich, zugewandten lufttrockenem die Deckgläser auf Papierhandtuch mit der behandelten Oberfläche nach oben. Bewahren Sie die Deckgläschen in einem Vakuumexsikkator bis zur weiteren Verwendung.

2. Herstellung von Briefmarken für Mikrokontaktdrucken

Wir beschreiben zwei Prozesse Muster Streptavidin Tracks auf der passivierten Deckgläschen. Das erste, microcontact Druck, typischerweise erfordert die Herstellung eines Silicium-Master von dem ein PDMS-Stempel gegossen wird. In unserem Fall, sind die Muster auf dem PDMS-Stempel 100 um-breite Linien, die um 290 Mitte-zu-Mitte voneinander beabstandet sind mit einer Funktion Höhe von 25 um. Nachfolgend beschreiben wir kurz wie eine geeignete Silicium-Master (Schritt 2.1-2.3) und PDMS-Stempel (Schritt 2.4) herzustellen. Es gibt jedoch mehrere Protokolle für Mikrokontaktdrucken in der Literatur 19-23, die geeignet zum Drucken Proteinmuster auf Deckgläsern sind beschrieben. Masters können auch maßgeschneiderte und gekauft aus kommerziellen Quellen.

  1. Zuerst reinigen Siliziumwafer (4 "Durchmesser) durch Inkubation in Piranhalösung (3:1 v: v von Schwefelsäure und 30% Wasserstoffperoxid). Für 20 min Spülen des Wafers 10 mal gründlich mit MilliQ H 2 O. Trocknen der Wafer in einem Ofen bei 150 ° CO / N.
  2. Spülen der sauberen und getrockneten Siliziumwafers mit 100% Aceton, um 100% Isopropylalkohol gefolgt. NächsteSpin-Coat 2 ml GM1070 SU-8 Fotolack (Gersteltec Sarl) auf den Wafer bei 3.100 Umdrehungen pro Minute für 40 Sek. eine 25 um dicke Schicht. Die Probe wird dann auf einer Heizplatte bei 65 ° C für 5 min gebacken um weitere 5 min bei 95 ° C.
  3. Freilegen SU-8 Photoresist mit UV-Licht für 60 Sekunden unter einer Photomaske mit dem gewünschten Muster (zum Beispiel unter Verwendung eines Quintel Q6000 Maskaligner) und wiederholen der Backvorgang in 2,2 beschreiben. Anschließend wird die Probe durch Eintauchen des Wafers in SU-8 Entwicklers (Gersteltec Sarl) für 4 min, 100% Isopropylalkohol gespült und getrocknet unter Stickstoffstrom entwickelt. Die Fläche des SU-8 Photoresist, die nicht dem UV-Licht ausgesetzt war wird somit entfernt, wodurch die inversen Muster der PDMS-Stempel.
  4. Der nächste Schritt ist es, ein PDMS-Stempel von dem Silizium-Master gegossen. Zuerst wird gründlich gemischt 1 Teil (w / w) des Härtungsmittels mit 10 Teilen Elastomer Prepolymer (Sylgard 184). Um mögliche Luftblasen zu entfernen, entgasen die Mischung in einem Exsikkator an eine Saugleitungfür 1 Stunde. Anschließend gießen PDMS Elastomer auf die Silizium-Master in einer Petrischale bis etwa 1 cm in der Höhe und Heilung der Master-und PDMS-Gemisch in einem Ofen bei 70 ° C für 1 Stunde. Schließlich wird die PDMS-Stempel aus dem Silizium-Master entfernt und auf Maß geschnitten.

3. Patterning Streptavidin oder Adhesive Cues auf Passivated Deckgläschen

Nach Passivierung Deckgläschen werden Proteinmuster mit Mikrokontaktdrucken (Step 3a) oder Dip-Pen-Lithographie (Step 3b) gedruckt. In unserem Fall wird Streptavidin als Linien, die die Grundlage für RGD Gradienten (Schritt 4) bilden gedruckt. Das gleiche Verfahren kann auch zum Bedrucken von Matrixproteinen an Klebemuster erstellen verwendet werden.

Eine alternative Methode zur Mikrokontaktdruck für die Strukturierung von Biomolekülen an Oberflächen ist Dip-Pen-Lithographie. In Dip-Pen-Lithographie ist ein Ausleger verwendet, um ein kleines Volumen der Lösung auf die Oberfläche übertragen. Die Größe der Ausleger, viskosität der Lösung, Kontaktzeit des Auslegers auf der Oberfläche, zu bestimmen Hydrophobie der Oberfläche und Luftfeuchtigkeit in der Druckkammer die Größe der gedruckten Features. Der Vorteil dieser Methode ist, dass verschiedene Muster für jedes Experiment gedruckt werden kann, da es keine Notwendigkeit, Mastern und Stempel herzustellen. Der Nachteil ist, dass es länger dauert, bis ein bestimmtes Muster zu drucken und Dip-Pen-Lithographie erfordert einen Spezialisten Instrument, das nicht sein kann in vielen Labors zur Verfügung. Der Dip-Pen-Lithographie Instrument, das wir verwendet wurde, war die NanoeNabler von Bioforce Nanowissenschaften. Hier druckten wir kleine Punkte, die <10 um im Durchmesser waren, für die wir SPT10 Cantilever verwendet.

3a. Mikrokontaktdrucken (mCP) Technik

  1. Zu reinigen und um das PDMS-Stempel mehrere hydrophile, behandeln des gemusterten Seite der PDMS-Stempel in einer UV-und Ozon (beispielsweise UV-Ozon aus Procleaner Bioforce Nanoscience) für 1,5 Stunden. Alternativ können Sie einen Plasma-Reiniger für eine kürzere Zeit für den gleichen Zweck. Dieser Prozess erzeugt eine oxidierte PDMS Oberfläche 24, die den Druckvorgang verbessert.
  2. Unmittelbar nach der Ozon-oder Plasmabehandlung, Ort und ausgebreitet 10 ul Streptavidin (1 mg / ml in PBS) auf die PDMS-Stempel und lassen für 1 Stunde in einer feuchten Kammer (z. B. eine teilweise gefüllte 6-Well-Platte, siehe Schritt 1.3) . Wenn Bahnen müssen unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar, verwenden Streptavidin, die an ein Fluorophor konjugiert wie Streptavidin-AlexaFluor350 ist.
  3. Entfernen Sie überschüssiges Streptavidin aus dem Stempel mit Seidenpapier und Luft trocknen den Stempel für ca. 1 min. Drücken Sie den Stempel auf die PLL-PEG-Biotin-beschichteten Deckglas.
  4. Wenn fluoreszierenden Streptavidin in Schritt 3.a2 verwendet wurde, überprüfen Sie die Muster mit unter einem Epifluoreszenzmikroskop. Bewahren bedruckten Oberflächen in einem Exsikkator.

3b. Dip Pen Lithography

  1. Zuerst mischen Sie 1 Teil 1 mg / ml Streptavidin oder streptavidin-AlexaFluor350 mit 10 Teilen Glycerin (v / v) und laden Sie 5 ul der Mischung auf dem Ausleger. Dann beginnen die Druckverfahren wie in der Bedienungsanleitung des Dip-Pen-Lithographie Instruments beschrieben. Um die Punktgröße zu verringern etwa 5 um, einzustellen Druckgeschwindigkeit Kontaktzeit des Auslegers auf der Oberfläche oder vertikale Abstand des Auslegers an die Oberfläche. In dem Beispiel in Abbildung 2c gezeigt, wurden Punkte in einer Linie mit Zeile und Spalte Trennung auf 10-15 um gedruckt. Dieser Abstand reicht aus, um Punkte von ineinander übergehen zu verhindern, sondern ermöglicht die Anzeige von mehreren Punkten in einem einzigen Blickfeld mit den meisten Mikroskopeinstellungen.
  2. Bewahren bedruckten Oberflächen in einem Exsikkator.

4. Erstellen Adhesive Farbverläufe auf Streptavidin-pattern Surfaces

Wir erzeugen Klebstoff Gradienten auf Deckgläschen, die mit Streptavidin (Abbildung 3) oder Co beschichtet sind Biotin-RGDntain Streptavidin Muster auf passiviert Deckgläschen (Abbildung 5). Eine Fläche Gradienten erzeugen, verwendeten wir ein handelsübliches Mikrofluidvorrichtung (Slide genannt klebrig-Chemotaxis 3D von Ibidi), die eine stabile Lösung Gradienten durch passive Diffusion erzeugt. Um für Streptavidin Bindungsstellen konkurrieren, beschäftigten wir zwei gegenüberliegenden Gradienten von Biotin-RGD und Biotin, das war nicht konjugiert RGD (siehe Abbildung 1).

  1. Kleben Sie die Streptavidin-beschichteten oder strukturierten Deckgläschen auf die Klebeseite des sticky-Slide Chemotaxis 3D-Gerät. Um sicherzustellen, daß es keine Leckage für mehrere Stunden, werden die Kanten der Vorrichtung mit einer dünnen Schicht aus Vaseline erwärmt und mit einer zweiten Schicht aus einem Gemisch aus 1 Teil bis 1 Teil Vaseline aus Paraffinwachs (w / w) abgedichtet ist.
  2. Füllen Sie den Kanal des Gerätes mit 6 ul PBS in den Kanal. Dann füllen Sie die beiden Reservoire mit 70 ul von 0,03 ug / ul Biotin-4-Fluorescein in PBS und 70 & mu; l von 0,03 ug / ul Biotin-RGD in PBS, jeweils. Inkubieren der Proben bei RT im Dunkeln für 1 Stunde.
  3. Entfernen Sie die Biotin-Lösungen und sorgfältig spülen die Oberfläche, während noch der mikrofluidischen Vorrichtung zweimal mit PBS angebracht. Markieren Sie die Richtung des Klebers Steigung und, wenn nötig, speichern Sie das Gerät mit PBS bei 4 ° C gefüllt für, sondern sicherzustellen, dass das Gerät nicht austrocknen. Falls erforderlich, den Klebstoff zu analysieren Gradienten mit einem Fluoreszenzmikroskop.

5. Kennzeichnung von Zellen mit Farbstoffen für das Live Cell Imaging

Zellen werden mit fluoreszierenden Farbstoffen, die Zellen-Tracking unter dem Fluoreszenzmikroskop unterstützen beschriftet. Gemeinsamen Sonden fluoreszierend sind Organelle Marker, wie Syto 64 Red, die den Zellkern markiert. Dazu werden die Zellen zunächst dreimal mit PBS gewaschen, dann mit 1 uM Syto 64 Rot in Kulturmedien für 45 min inkubiert und schließlich gewaschen noch dreimal mit PBS. Bitte beachten Sie, dass die Zellen sollten nichtgehalten in PBS für lange Zeiträume.

Alternative Farbstoffe für die Zell-Tracking sind CellTracker Serie, die das Zytoplasma Flecken und werden während der Zellwanderung und Teilung erhalten. Transfektion von Zellen mit einem fluoreszierenden Fusionsproteins ist besonders nützlich, um die subzelluläre Verteilungen eines Proteins von Interesse während der Migration aufzuzeichnen. Allerdings fluoreszierende Proteine ​​typischerweise Foto-bleach schneller als organische Farbstoffe, so dass langfristige Beobachtungen nicht möglich sein.

6. Laden der Zellen mit einem löslichen Gradient in der Mikrofluidik Geräte

  1. Fluoreszenzmarkierte Zellen zu zählen und in zwei Rohren mit gleichem Zellzahlen. Waschen und resuspendieren einen Röhre von Zellen mit Medium, das die chemische Lockstoffe wie modifiziertes Eagle low glucose Dulbeccos Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). Waschen und resuspendieren Sie das andere Rohr von Zellen in Medien ohne Lockstoff, dh DMEM mit 0% FBS. Die Endkonzentrationder Zellen in jedem Schlauch sollte 5 x 10 5 Zellen / ml liegen.
  2. Entfernen Sie alle Lösungen aus der Mikrofluidik-Vorrichtung (aus Schritt 4,3) und legen Sie es auf dem Mikroskoptisch (siehe Schritt 7). Leistung 70 ul Zellen (5 × 10 5 Zellen / ml in DMEM 0% FBS) in einem Reservoir und 70 ul von HeLa-Zellen (5 x 10 5 Zellen / ml in 10% FBS DMEM) in eine andere. Locker legen einen Band über den Stauseen um Verdunstung zu vermeiden. Wenn Zellen auf der Oberfläche vorinkubierten sind vor der Bebilderung, ist es ratsam, dass die Zellen in die Vorrichtung in Wachstumsmedium ohne die Gradienten geladen. Die Vorrichtung wird dann auf dem Mikroskoptisch platziert und die Medien ersetzt Gradienten dh Medien DMEM ohne FBS in ein Reservoir und DMEM mit 10% FBS in der anderen.

7. Live Cell Imaging and Data Analysis

  1. Schalten Sie das Mikroskop (Nikon Ti-E) und erwärmen die Bühne mindestens 1 Stunde vor dem Start des Experiments.
  2. Sicherzustellen, dass der Kanal des Mikrofluidic Vorrichtung im Sichtfeld und Zellen sind im Fokus. Wählen Bildaufnahme Parameter wie Belichtungszeiten und fluoreszierenden Filter, Bildsequenz Hellfeld und Fluoreszenz, die Zellen und Spuren erfasst sowie Zeitpunkten und Aufzeichnungslänge (zB alle 15 Minuten für 16 Stunden).
  3. Analysieren von Daten mit den entsprechenden Software wie ImageJ Manuelle Tracking oder Ibidi Chemotaxis und Migration Tool.

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Ergebnisse

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Zelle zu verstehen, wie Wanderungssignale integrieren 25 haben wir ein Verfahren entwickelt, um Bildzellen mit Fluoreszenzmikroskopie dass in einer Umgebung mit konkurrierenden Klebstoff und löslichen Gradienten (Abbildung 1) zu migrieren. Klebstoff Spuren, die fluoreszierende Streptavidin und biotinyliertem RGD enthalten waren, mit Mikrokontaktstruktur gedruckten Spuren und Dip-Pen-Lithographie (Abbildung 2) geschaffen. Erfolgreiche Mikrokontaktdruck wird durch die Linie Pro...

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Diskussion

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Bei diesem Protokoll, verwendeten wir ein handelsübliches Mikrofluidvorrichtung (Slide-klebrigen Chemotaxis 3D von Ibidi), um die Effekte von chemisch modifizierten Oberflächen und chemoattraktive Gradienten auf Zellmigration studieren. Diese mikrofluidischen Einrichtung erfordert keine Strömung, da der Gradient durch Diffusion entlang der Länge des Kanals einstellt. Dies ist wichtig, weil Flow unterschiedlich beeinflussen könnte langsam wandernden Zellen wie Fibroblasten, die stabil fokalen Adhäsionen und sc...

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Offenlegungen

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Wir haben keine kommerziellen Interessen offen zu legen.

Danksagungen

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Die Autoren danken Mittel aus dem Australian Research Council und National Health and Medical Research Council of Australia und auch möchte ich danke Australian National Fabrication Facility für die SU-8-Master für das Mikrokontaktdruck. SHN wird durch das Ministerium für Höhere Bildung Malaysia und Universiti Sains Malaysia unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Deckglas-FärbeanlagenThomas Scientific8542 E40Deckglas Gestell
OfenbinderED 53 Serie
SiliziumwaferSilizium Quest708-007Bor dotiert < 100> Wafer, 4" Durchmesser, 500 μ m, einseitig poliert
GM1070 SU-8 FotolackGersteltec Sarl
SU-8 EntwicklerGersteltec Sarl
Sylgard 184 HärterDow Corning
Sylgard 184 Elastomer-PrepolymerDow Corning
PLL-PEG-Biotin (20%)SuSos AGPLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)1 mg/ ml in PBS
FluoresceinSigma469551 mM in PBS
Streptavidin-AlexaFluor350InvitrogenS-112491 mg/ml in PBS
Biotin-4-fluoresceinInvitrogenB-13700,03 μ g/μ l in PBS
Biotin-RGDGenScriptSC12080,03 mg/ml in PBS
Syto 64 RedInvitrogenS-113461 μ M in PBS
Sticky slide Chemotaxis 3DIbidi80328
200 μ l Greiner gelb abgeschrägte SpitzeGreiner Bio-One739261
VaselineSigma16415
Paraffinwachs, mp 55-57 ° CSigma327204
Nano eNabler 10 μ m CantileverBioForceSPT-S-C-10s,
Image J, SoftwareNational Institute of Healthrsbweb.nih.gov/ij/download.html
Manuelles Tracking-Plugin, Fabrice Cordeliè resrsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
Chemotaxis and MigrationTool Ibidi GmbHwww.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html
, ,

Referenzen

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Schlagwörter

Adhesive GradientSoluble GradientMicrofluidic ChamberPLL PEG PassivationMicrocontact PrintingDip Pen LithographyStreptavidin PatterningBiotinylated RGDFBS GradientLive Cell Imaging

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