1. Microchip Fabrication
Der erste Schritt besteht darin, zu erstellen oder kaufen Sie Ihre Mikrokanalstruktur. Es gibt viele Optionen für die Mikrochip-Material.
Eines der am häufigsten gewählten Materialien Poly (dimethylsiloxan) (PDMS). Es gibt viele Publikationen über Richtungen für PDMS Herstellung durch Softlithographie 16,17,18.
Sobald das PDMS Kanal hergestellt ist, gibt es mehrere Oberflächenbehandlungen seiner natürlichen Hydrophobie umzukehren. Oxygenierte Plasmabehandlung ist eine weit verbreitete Möglichkeit.
Zhou, Ellis und Voelcker (2009) geben einen Überblick über Oberflächenbehandlungen und wie sie Einfluss auf PDMS. Diese Ergebnisse sind für Wasser aber, und Blut hat unterschiedliche Eigenschaften. Eine Studie über, was das bedeutet, Oberflächenbehandlung für Blut wurde von Pitts et al. (2012a) getan worden.
Für die hier vorgestellten Ergebnisse, Mikrochip Oberflächen und die Glasplatten waren siegebunden wurden sowohl Sauerstoff-Plasma für 45 Sekunden belichtet und dann fest zusammen, was zu einer dauerhaften Bindung gedrückt.
2. Blut Vorbereitung
- Sammeln von Blutproben von einer akkreditierten Einrichtung. Zum Beispiel Schweineblut mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) als Antikoagulanz verwendet werden. 1 g EDTA mit 4 ml Wasser, und fügen Sie dann die Lösung auf 1 l Vollblut, vorsichtiges Mischen 10x.
Beim Abholen Blutproben, damit sie langsam auf RT. Blutproben sollten frisch und idealerweise nutzten den Tag, sie gesammelt, um die rheologischen Eigenschaften des Blutes zu erhalten sind.
Die Proben können gekühlt werden einmal bei RT, jedoch Vollblut ohne gerinnungshemmende unbrauchbar wird nach Kühlung. Abhängig von der Antikoagulans kann RBCs gekühlt aufbewahrt für bis zu 42 Tage, und Vollblut gekühlt gehalten für 35 Tage, aber Kontamination wäre in einem nicht-m möglichedizinische Anlage 21.
Außerdem darauf achten, der Erhebungsmethode mit Rindern oder Schweinen Proben, und keine Verunreinigungen durch Knochenmark.
- Zentrifuge die Blutproben 3x bei 3.000 UpM für je 10 min. Nach der ersten Zentrifugation, entfernen Sie das Plasma und Buffy-Coat, verwerfen. Es ist in der Regel am einfachsten, das Plasma zunächst entfernen und dann verwerfen oder für künftige Verwendung aufbewahren, dann die Buffy-Coat allein zu entfernen.
Führen Sie die Pipette langsam, um so nicht mischen Leukozytenmanschette zurück ins Blut. Nach dem Entfernen des Buffy-Coat, fügen Sie etwa 20 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) und vorsichtig mischen, zentrifugieren. Wiederholen letzten Schritt. Nach der dritten Zentrifugation, entfernen Sie die restlichen PBS und Buffy-Coat, verwerfen.
Es ist auch möglich, die nativen Plasma anstelle von PBS zu verwenden, wenn Sie die Aggregation des Blutes behalten möchten. Achten Sie darauf, sich nicht zu vermischen keine Buffy-Coat oder weißBlutzellen in das Plasma.
- Nehmen gereinigt roten Blutkörperchen (Erythrozyten) und setzt in PBS oder Plasma bei gewünschten Konzentrationen (Hämatokrit). Überprüfen Sie mit einem Hämatokrit Mikrozentrifuge (CritSpin FisherSci, USA).
Blut bei 10 bis 20% Hämatokrit sollten leichter sichtbar als 40 oder 50% (physiologischen Hämatokrit). In der Mikrozirkulation, das Blut ist in der Regel die Hälfte der Hämatokrit des Makro-Kreislauf, so H = 20 15 ist ausreichend.
- In fluoreszierender Tracer-Partikel in der gewünschten Konzentration in den Blutproben. Eine allgemeine Regel ist zu 10 Teilchen in einer Korrelation Fenster, die vor der Zeit berechnet werden kann.
Beispielsweise werden 30 ul Teilchen zu 1 ml Blut Lösung für die Set-up in dem Video dargestellt worden. Alternativ können die RBCs selbst fluoreszierend markiert werden.
- Darüber hinaus stellen Sie eine Kalibrierung mit Wasser und Grippeorescing Teilchen. Es wird notwendig sein, das System mit einer Newtonschen Lösung kalibrieren.
Wenn zum Beispiel unter Verwendung eines 10X-Objektiv mit einem Kanal in der Größenordnung von 100 um eine geeignete Konzentration 300 ul Teilchen mit 15 ml destilliertem Wasser gemischt. Eine weitere Möglichkeit ist Glycerin mit destilliertem Wasser auf eine Viskosität von 3Cp, die näher an der Makro Blut Viskosität verdünnt verwenden.
3. μPIV Messungen
- Lasersicherheit: Prüfen Sie die Temperatur und Luftfeuchtigkeit. Tragen Sie geeignete Laser-Schutzbrille. Schließen Sie die Laser-Vorhang oder schalten Sie den Laser-Schild an der Tür Labor auf den Menschen nicht davor geschützt ausgesetzt zu verhindern.
- Verfahren mit Davis-Software ist in dem Video zu sehen. Nähere Informationen finden Sie in der Bedienungsanleitung eines bestimmten Systems.
- Vor der Einnahme von Daten, muss die Kamera Skala kalibriert mit einem Mikrometer werden.
- Um die Einhaltung des Systems zu reduzieren, verwenden Sie den kürzesten Schlauch eind der kleinste starren Spritze möglich, wie in 15 oder 50 ul Hamilton gasdichte Spritze. Um das Auslaufen von Blut oder Lufteinlass in das System zu reduzieren, versiegeln Sie den Schlauch auf die Spritze und auf den Chip. Dies kann mit Leim, PDMS oder Vaseline (darauf achten, daß das Blut verunreinigen) durchgeführt werden.
Um die Mikro-Spritze mit Wasser mit Tracer-Partikel geschnürt füllen verwenden Rückfluss Methode, weil das Volumen der Mikro-Spritze ist in der Regel viel kleiner als das Volumen zu füllen.
Unsere Rückfluss Verfahren besteht die Mikro-Spritze und der Kanal zusammen füllen über den Ausgang des Kanals unter Verwendung eines sekundären Kunststoffspritze. Dafür zuerst die Mikro-Kolben der Spritze, dann drücken Sie die Flüssigkeit mit der klassischen Kunststoffspritze an dem Ausgang des Kanals, lassen Sie die Flüssigkeit ausfließen der Mikro-Spritze, bis alle Mikrobläschen sind aus dem Mikro-Spritze, Schlauch oder Chip, endlich den Kolben zurück und ziehen Sie die Kunststoff-Spritze. Das Vorhandensein or Fehlen von Mikrobläschen kann mit einem Mikroskop überprüft werden.
- Richten Sie die Spritzenpumpe auf horizontale Rohr zu erreichen. Programmieren Sie die Spritzenpumpe auf die gewünschte Durchflussmenge.
Seien Sie sich der möglichen Auswirkungen vergänglich, wie der "Flaschenhals-Effekt", für starre System oder die Einhaltung des Systems, die die tatsächliche Durchflussmenge ändern. Charakteristische Zeiten eines Systems in Abhängigkeit von den Materialien und Abmessungen des Systems bestimmt werden. (Kapitel 2, S. 77-81, Tabeling, 2005)
- Zeigen Mikrochip auf Mikroskoptisches und starten Sie die Pumpe. Verwenden Sie das Wasser mit Partikeln, um das System in der Mitte Geschwindigkeitsprofil kalibrieren und kalibrieren dT (die Zeit zwischen gepulsten Bilder).
Die Partikel sollten zwischen 5 und 10 Pixeln zwischen den Rahmen für eine gute Korrelation 11 zu bewegen. Bei der Kalibrierung, vorsichtig sein, um in der Mitte des Kanals zu messen. Der Fokus Flugzeug in der Mitte hat die höchsteGeschwindigkeit 8.
Wenn Sie einen runden Kanal, achten Schatteneffekte.
Eine Probe wird in Bild 2 dargestellt ist, unter Verwendung eines gepulsten Kamera, während das obere Bild ist der erste Impuls und der unteren Bild ist der zweite Impuls. Es kann in der Figur, dass die hellsten Punkte (fluoreszierende Partikel) die in-Fokus sind zu sehen.
- OPTIONAL: Durch die Daten in unterschiedlichen Höhen ein 3D Geschwindigkeitsprofil kann durch Zugabe der verschiedenen Vektoren in einem einzigen Bild rekonstruiert werden. Das Video zeigt eine Routine, die für die Automatisierung des Prozesses entwickelt.
- Bei der Aufnahme von Daten mit dem Blut füllen Spritze mit der gewünschten Menge an Blut in dem gleichen Verfahren wie dem Wasser. Programmieren Sie die Spritzenpumpe auf die gewünschte Durchflussmenge und nehmen die gewünschten Daten. Ein Beispiel für RAW-Bilder erhaltene Abbildung 2 dargestellt. Seien Sie vorsichtig mit RBC Sedimentation sowie. Nachfüllen der Spritze jeden Lauf oder jedeandere Sicht verringert sich die Ansiedlung der RBC.
- Nach der Übernahme von Bildern wird Kreuzkorrelation auf die Bildpaare durchgeführt, um Geschwindigkeitsvektorfelder zwischen den Bildern zu erhalten. Es ist wichtig, gute Bilder zu haben, um eine gute Korrelation aufweisen. Vor Korrelation können Pre-Processing durchgeführt, um Hintergrundgeräusche zu entfernen.
Kreuzkorrelation zwischen den Fenstern in den benachbarten Bildern, die in Form und Größe, um die Korrelation beeinflussen variiert werden kann getan. Nach Kreuzkorrelation können Bild-Nachbearbeitung getan, um fehlerhafte Vektoren oder Ausreißer zu entfernen.
Eine detaillierte Beschreibung der verschiedenen verfügbaren Optionen und deren Genauigkeiten in Pitts et al. (2012b), wo die beste Verarbeitung für Blut gefunden wurde, um die Methode der "Bild überlappen" mit Fenstern in der Länge erweitert werden und ausgerichtet mit dem Strom . Diese Vorgänge können manuell in einem Programm erfolgen wie MATLAB oder innerhalb der Software mit Ihrem System. Die Software ist nicht wichtig, ist die Mathematik hinter den Operationen immer wichtiger und jede Operation kann für die Richtigkeit der Endgeschwindigkeit Profil beeinflussen.
Die resultierenden Vektoren können im Raum über den Kanal gemittelt werden, um momentane Geschwindigkeit Profile zu erhalten, und dann gemittelt wieder in der Zeit, eine durchschnittliche, repräsentativ Geschwindigkeitsprofil zu erhalten. Kloosterman et al. (2011) eine Erklärung des Fehlers in μPIV Messungen, bei denen die Schärfentiefe groß ist. Die Diskussionen über die Fehler der Datenverarbeitung präsentiert hier in Pitts et al. (2012b) für die gepulste Messungen und Chayer et al. (2012) für die High-Speed-Messungen gefunden werden.
Beispiele Geschwindigkeitsprofile sind in den 3 und 4 dargestellt. Abbildung 3 zeigt eine einzelne Geschwindigkeitsprofil für die Mittellinie einer 10 ul / h Strom von RBC bei H = 10 in einem 140 um breiten Kanal.
Zelt "> Diese einzelnen Profils durch Mittelung der korrelierten Vektoren über den Kanal, um ein Geschwindigkeitsprofil zu erzielen, und dann im zeitlichen Mittel um eine repräsentative Messung zu erhalten. In diesem Fall 100 Paare in der Zeit über das Sichtfeld wurden gemittelt.
Ein Beispiel für die 3D rekonstruierten Profil für eine Wasser Kalibrierstromleitung in einer 100 um im Quadrat Kanal mit einem programmierten Flussrate von 30 ul / h genommen wird in Abbildung 4 gefunden. In Abbildung 4 sind die Profile bei 1 um-Intervallen gemessen.
- OPTIONAL: In der abgebildeten Set-up mit hoher Geschwindigkeit Bilder können zu den gleichen Bedingungen durch Umschalten Kameras (und Datenerfassungssysteme) entnommen werden. Dies kann nützlich sein für die Visualisierung des zellfreien Schicht in den Kanal, und zur Quantifizierung der Aggregation. Die Analyse der Daten ist etwas anders (Chayer et al., 2012).
Beispiele von weißem Licht Bilder mit und ohne RBC Aggregation presented in Abbildung 5 bei H = 20. Die Top-Bilder zeigt H = 20 in PBS, die die Fähigkeit des RBC entfernt zu aggregieren, um 1 ul / hr. Das untere Bild ist H = 20 in nativen Plasma bei 0,5 ul / hr. Im unteren Bild ist die Aggregation sichtbar.
- Fahren Sie das System in einer sicheren Weise, wenn Messungen abgeschlossen sind. Verwenden Sie die richtigen Laser Sicherheitsverfahren bis Laserleistung Quelle vollständig heruntergefahren ist.