Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

In vivo Messung der Maus Pulmonary Endothelial Surface Layer

14.5K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/50322

⸱

22. Februar 2013

 ,  , 
1Division of Pulmonary Sciences and Critical Care Medicine, University of Colorado School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die endotheliale Glykokalyx / endothelial Oberflächenschicht ist ideal studiert mit Intravitalmikroskopie. Intravitalmikroskopie ist technisch anspruchsvoll in einem sich bewegenden Organ wie der Lunge. Wir zeigen, wie die gleichzeitige Hellfeld und Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um Endotheloberfläche Schichtdicke in einem frei beweglichen abzuschätzen In vivo Maus Lunge.

Zusammenfassung

Die endotheliale Glykokalyx ist eine Schicht aus Proteoglycanen und zugehörige Glycosaminoglycane Auskleiden des Gefäßlumens. In vivo die Glykocalix hochhydratisierten ist, Bilden einer erheblichen endothelialen Oberflächenschicht (ESL), die zur Aufrechterhaltung der endothelialen Funktion beiträgt. Als die endotheliale Glykokalyx ist oft aberrante in vitro und ist während der normalen Gewebe Fixationstechniken verloren, benötigt Studie der ESL Verwendung von Intravitalmikroskopie. Um die beste Annäherung an die komplexen Physiologie des alveolären Mikrovaskulatur wird pulmonalen intravital Bildgebung ideal auf einem frei beweglichen Lungenkrebs durchgeführt. Diese Zubereitungen jedoch typischerweise unter umfangreichen Bewegungsartefakt. Wir zeigen, wie mit geschlossenem Brustkorb Intravitalmikroskopie einer frei beweglichen Mauslunge verwendet werden, um Glykocalix Integrität mittels ESL Ausschluss von fluoreszenzmarkierten hochmolekularen Dextrane aus der endothelialen Oberfläche zu messen. Diese Nichtwiedereinziehung chirurgische Technik, die benötigtgleichzeitige Hellfeld und Fluoreszenz-Bildgebung der Maus Lunge, ermöglicht Längs Beobachtung des subpleural Mikrovaskulatur ohne Beweise zu induzieren confounding Lungenschädigung.

Einleitung

Die endotheliale Glykokalyx ist ein extrazelluläres Schicht aus Proteoglycanen und zugehörige Glycosaminoglycane Auskleiden der vaskulären Intima. In vivo die Glykocalix hochhydratisierten ist, Bilden einer Oberflächenschicht wesentlichen endothelialen (ESL), die eine Vielzahl von Funktionen einschließlich Endothelzellen Fluiddurchlässigkeit 1, Neutrophilen-Endothel reguliert Haftung 2 und die Mechanotransduktion von Fluid Scherbeanspruchung 3.

Historisch gesehen hat die Glykokalyx war underappreciated aufgrund seiner aberrance in kultivierten Zellpräparationen 4, 5 und seine Abbauprodukte während der üblichen Gewebefixierung und Verarbeitung 6. Der zunehmende Einsatz 7 von Intravitalmikroskopie (in vivo Mikroskopie, IVM) hat mit erhöhter wissenschaftliche Interesse an der Bedeutung der ESL auf vaskuläre Funktion bei Gesundheit und Krankheit zusammenfiel. Die ESL ist unsichtbar für Lichtmikroskopie und kann nicht einfach in beschriftbarvivo, da die Neigung der fluoreszierenden Glykokalyx-bindenden Lektine RBC Agglutination 8 und tödlichen Lungenembolien (unveröffentlichte Beobachtungen) verursachen. Mehrere indirekte Ansätze wurden daher entwickelt, um ESL Dicke (und durch Erweiterung, Glykokalyx Integrität) in unbewegten Gefäßbetten wie die cremasterica und mesenterialen microcirculations abzuleiten. Diese Techniken umfassen die Messung der Differenzen der zirkulierenden Mikropartikel Geschwindigkeit als eine Funktion des Abstands von der endothelialen Membran (Mikropartikel Bild velocimetry 9) sowie die Messung der Ausschluss von sperrigen, fluoreszenzmarkierten vaskulären Markern (zB Dextrane) von der endothelialen Oberfläche (Dextran Exklusionstechnik 10, 11). Von diesen Techniken ist nur Dextran Ausschluss fähig Schätzen ESL Dicke aus Messungen an einem einzigen Zeitpunkt hergestellt. Durch die gleichzeitige Messung vaskulärer Breiten mit Hellfeldmikroskopie (a Breite inclusive der "unsichtbaren" ESL) und Fluoreszenz-Mikroskopie eines vaskulären Tracer vom ESL ausgeschlossen, kann ESL Dicke wie die Hälfte der Differenz zwischen vaskulären Breiten 2 berechnet werden.

Die Verwendung von einem momentanen Maß für ESL Dicke für Studium des pulmonalen Glykocalix gut geeignet. Intravitalmikroskopie der Lunge ist eine Herausforderung, da signifikante pulmonale und kardiale Bewegungsartefakte. Während jüngsten Fortschritte zur Immobilisierung Mauslungen ermöglichen in vivo 12, 13, bestehen Bedenken hinsichtlich der physiologischen Auswirkungen von Lungen Stasis. Lung Immobilität wird mit einer verminderten endothelialen Stickstoffmonoxid Signalisierung 14, ein Signalweg, der sowohl Neutrophilen Adhäsion 15 und Lungenschädigung 16 Auswirkungen verbunden. Weiterhin Immobilisierung eines Bereichs von Lungen freilegt umgebenden mobilen Alveolen zu schädigenden Scherkräften (sogenannte "Atelektrauma"), in Übereinstimmung mit den Konzepten der klassischen physiologischenalveolären Interdependenz 17.

Im Jahre 2008 entwickelte Arata Tabuchi, Wolfgang Kübler und Kollegen eine chirurgische Technik die es erlaubt Intravitalmikroskopie einer frei beweglichen Mauslunge 18. Respiratorischen Artefakt aus diesem Verfahren kann durch die Verwendung von Hochgeschwindigkeits-Abbildungssystem, einschließlich gleichzeitige Messung von Hellfeld und Fluoreszenzmikroskopie negiert werden. In diesem Bericht ausführlich wir, wie momentane Dextran Ausschluss Bildgebung eingesetzt werden, um ESL Dicke im subpleural Mikrozirkulation einer frei beweglichen, in vivo Mauslunge messen. Diese Technik kann leicht modifiziert werden, um zu bestimmen Glykokalyx-Funktion Insbesondere die Fähigkeit eines intakten ESL auszuschließen zirkulierenden Elemente aus der endothelialen Oberfläche. Wir haben kürzlich diese Techniken verwendet werden, um die Bedeutung der pulmonalen ESL Integrität zur Entwicklung von akutem Lungenversagen während systemische entzündliche Erkrankungen wie Sepsis 2 zu bestimmen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Ein. Vorbereitung der Surgical Tubing, Gefäßkathetern, Brust Wand Fenster

  1. Intravitalmikroskopie Bühne. Wir maßgeschneiderte eine Plexiglas Bühne, auf der die narkotisierten Maus liegt in der Mikroskopie. Diese Phase nimmt sowohl ein 15 cm x 10 cm flexible Kunststoff-Schneidebrett (auf dem die Maus liegt bei der Induktion der Anästhesie, Tracheotomie Platzierung und Katheterisierung) sowie einer ähnlich großen Heizelement (unter der Schneidebrett).
  2. Maus Thorakostomie Rohrvorbereitung (Abbildung 1). Ein 10 cm langes Stück PE 50-Schlauch (Intramedic, Innendurchmesser 0,58 mm, Außendurchmesser 0,965 mm) geschnitten. Ein Ende ist mit dem stumpfen Ende eines gekrümmten 23 Gauge-Nadel angebracht ist; diese Nadel wird verwendet, um das Rohr durch die Brustwand (innen → außen) übergeben vor dem Verschluss der thorakalen Fenster werden.
    Das distale Ende des Schlauches (1,5 cm in der Länge, entgegengesetzt zu der angehängten 23 GaugeNadel) wird immer wieder von einer 30-Gauge-Nadel punktiert, die Schaffung von "seitlichen Anschlüssen" wirksame Absaugung des intrathorakalen Luft zu erleichtern.
    Diese gefensterten Abschnitt wird dann von dem Rest des Rohrs durch mehrere umlaufende Schleifen von 4:0 Seidennaht getrennt; diese Schleifen wird als "Stopper" zu dienen, die Verankerung letztendlich 1,5 cm gefensterte Abschnitt innerhalb der Brusthöhle.
  3. Jugularvenöse Kathetern. Zwei 15 cm Längen PE 10-Schlauch (Intramedic, Innendurchmesser 0,28 mm, Außendurchmesser 0,61 mm) geschnitten werden. Ein Skalpell wird zur Abschrägung der Enden des Rohres, wodurch die Leichtigkeit der Venenpunktion. Der Schlauch wird über eine 1 ml Spritze, die 6% 150 kDa Dextranlösung (in PBS), die an den nicht abgeschrägten Ende des Schlauchs gespült.
  4. Chest wand Vorbereitung (Abbildung 2). Transparent Polyvinylidenfluorid-Membran (New Kure Wrap, Kuresha, Tokyo) wird in eine ovale Form (Hauptachse 6 cm, Nebenachse 4 cm) geschnitten. Ein kreisförmiger 5 mm # 1 Deckglas (Bellco) mit der Membran unter Verwendung α-Cyanacrylat-Klebstoff (Pattex flüssig, Fa. Henkel, Düsseldorf) befestigt ist.
  5. . Rohr für Pneumothorax Induktion ("Blasrohr") Ein 10 cm Länge Rohr (Innendurchmesser 3 mm, Außendurchmesser 5 mm) wird auf eine 5-ml-Spritze befestigt ist; das entgegengesetzte Ende wird verwendet, um Luft in das Tier einzuführen Brustkorb vor der Brust wand Transplantation.
  6. Spritze für Wasser Eintauchen Ziel. A 23-Gauge-Nadel auf eine 30 ml Spritze mit destilliertem Wasser angebracht. Die Spitze der Nadel abgestumpft ist (unter Verwendung eines Metall-Datei), um Schäden an dem Ziel zu verhindern.

2. Maus Anesthesia

  1. Eine Maus ist anästhesiert mit einer Mischung aus Ketamin (10 mg / ml) und Xylazin (2 mg / ml) intraperitoneal in einer Dosis von 8 ul pro Gramm Körpergewicht Maus. Sedierung erfolgt innerhalb von 3 - 6 min und sollten kein Hindernis Spontanatmung.
  2. Mit einem elektrischen Rasierer, Rasurder Hals-, Brust-, Bauch und rechten Seite der Maus.
  3. Mit Klebeband sichern Sie die Maus auf einer dünnen Kunststoff-Schneidebrett. Der Kopf der Maus sollte in Richtung des Bedieners (Abbildung 3) zeigen. Gentle Spannung durch eine Schlaufe des Fadens Weitergabe unter den oberen Zähnen dient Kopf-Erweiterung zu erhalten. Das Schneidebrett ist auf einem Heizkissen gelegt, die Aufrechterhaltung der Maus euthermia während Tracheostomie und Venenkatheter Platzierung.
  4. Wet rasiert Bereiche mit 100% Ethanol.
  5. Bestätigen adäquate Anästhesie mit einem Schwanz / paw Prise. Gehen Sie, wenn minimale Reaktion, bieten eine zusätzliche Bolus von Ketamin / Xylazin, wenn nicht ausreichend betäubt.

3. Tracheostomie

  1. Ein 1 cm lange Inzision über der Kehle vorgenommen. Darunterliegende Bindegewebe wird seziert, und die Speicheldrüsen getrennt und reflektiert seitlich. Der M. sternohyoideus sofort anterior der Trachea reseziert.
  2. Eine Schleife von 4:0 Naht wird unter th fortgeschrittene Trachea (Abbildung 4). Die Schleife wird dann geschnitten, wodurch zwei getrennte Stränge der Naht zugrunde liegenden Luftröhre. Die kaudale Nahtmaterial wird verwendet, um die Tracheostomiekanüle zu befestigen; der kraniale Nahtmaterial verwendet wird, um Spannung auf die Luftröhre während Tracheostomie Platzierung bereitzustellen.
  3. Mit zwei Fingern wird der obere Faden ergriffen und schonende Spannung auf die Luftröhre aufgebracht. Ein horizontaler Einschnitt in die Luftröhre zwischen oberen und unteren Nähten hergestellt. Dieser Schnitt sollte überqueren etwa zwei Drittel der trachealen Umfang. Ein Flansch Trachealkanüle (Harvard Apparatus, 1,22 mm Außendurchmesser) in das distale Luftröhre eingeführt und an seinem Platz mit der Schwanzflosse trachealen Naht.
  4. Die Tracheotomie wird auf ein Volumen-kontrollierte kleines Tier Ventilator (Inspira, Harvard Apparatus) verbunden ist, und die Maus ist mit 40% eingeatmeten Sauerstoffs und 9 ml / kg Tidalvolumen (Einstellungen optimiert, um eine adäquate Oxygenierung / Lüftung in unserem Labor erhalten) belüftet. Positive endexspiratorischen Druck (PEEP) wird an dieser Stelle nicht begonnen. Zu beachten ist, sollten die Einstellungen des Beatmungsgerätes besondere Bedingungen innerhalb der einzelnen Labors optimiert werden. Unterschiedliche Längen von redundanten Schlauch (der zwischen dem Schlauchsystem Y-Anschluss und Tracheotomie) kann zum Totraum einzustellen, eine stabile Alveolarventilation für jeden gewählten Atemzugvolumen.

4. Katheterisierung

  1. Die Verbindung der inneren und äußeren Jugularvene kann durch Verfolgen distalen Venenäste proximal identifiziert werden. Die externe Vena befindet sich unterhalb der reflektierten Speicheldrüsen gefunden, dies kann proximal verfolgt werden, um die externe-interne jugulare Kreuzung zu finden.
  2. Verwenden Sie sanfte stumpf, um die Vena Übergang von umgebenden Bindegewebe trennen.
  3. Mit 4.00 Nähten, binden Sie die externen Halsschlagader und interne Jugularvenen distalen (kraniale) an die Gurgel Kreuzung.
  4. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Carinader Vena Kreuzung, Blutungen sollte minimal sein.
  5. Zwei Katheter können schrittweise durch den Schnitt und in die Vena trunk vorangetrieben werden. Nach leichtes Ansaugen von Blut Rückkehr zu gewährleisten, werden Katheter in der Vene mit 4.00 Nähte gesichert.
  6. Band Kathetern auf das Schneidebrett gegen unbeabsichtigtes Herausfallen zu verhindern.

5. Intravital Maus Lung Microscopy Surgery (adaptiert aus Tabuchi et al. 18)

  1. Das Schneidbrett (enthaltend das zurückhaltend, narkotisierten Maus sowie abgeklebt Venenkathetern) mit dem Intravitalmikroskopie Stufe übergegangen, bei denen die verbleibenden chirurgische Eingriffe durchgeführt. Rektale Temperatursonde angeordnet ist; dieses Schnittstellen mit einem adaptiven Heizsystem (unter dem Schneidebrett), so dass Wartung der Maus euthermia.
  2. Ein jugularvenöse Katheter mit einer Spritze, die eine Pumpe Ketamin (10 mg / ml)-Xylazin (2 mg / ml) liefert befestigtMischung bei 200 ul pro Stunde. Eine adäquate Anästhesie wird erneut bestätigt, mit tail / paw Prise.
  3. Die Mittellinieneinschnitt vom Hals zum Xyphoid ausgefahren, dann Fortfahren seitlich an der rechten Seite (Fig. 5).
  4. Mit Elektrokauter wird die Brustmuskulatur entfernt, so dass den Brustkorb. Es wird darauf geachtet, um eine vollständige Blutstillung gewährleisten.
  5. Überqueren Sie die Maus rechten Hinterbein über die linke Seite und Klebeband ab. Die daraus resultierende Bauch Torsion dreht den Brustkorb leicht, durch Erleichterung der Operation.
  6. Legen Sie die Stufe bei einem Winkel von 45 Grad (Abb. 6); diese Positionierung ermöglicht die Lunge fallen weg von der Brustwand, sobald der Pneumothorax induziert wird.
  7. Die 1. Rippe (am unteren Rippe) wird mit einer Pinzette ergriffen und angehoben; eine gekrümmte Pinzette wird stumpf unterhalb der Rippe gedrückt. Diese trennt Pleura parietalis von der Brustwand. Die Pleura bleiben sollte unpunktierten.
  8. Mit dem Blasrohr undeine Spritze, wird die Luft gewaltsam gegen die Pleura parietalis eingeführt. Dies führt zum Bruch der Pleuraoberfläche und Pneumothorax, ohne die zugrunde liegenden Lunge. Die zugrunde liegende Lunge fallen weg von der Brustwand, so dass Einführung eines Elektrokauter Pinzette ohne Beschädigung der Lunge. Eine Abnahme der Beatmungsgerät Atemvolumen wird typischerweise nicht während dieses Schrittes notwendig.
  9. Mit Elektrokauter Pinzette, sezieren die Brustwand Muskulatur und schneiden Sie über den 5 th und 6 th Rippen / Pleura parietalis, so dass ein ~ 8 mm kreisförmigen Loch in der Brustwand. Wesentlich ist, daß eine vollständige Hämostase aufrechterhalten werden, da das Vorhandensein von Blutungen Mikroskopie (Abbildung 7) verdeckt wird.
  10. Mit einer Nadel Fahrer, legen Sie die Thorakostomie Rohr in der Brustwand Loch. Die Nadel sollte Punktion der Brustwand und verlassen die Brusthöhle unterhalb und seitlich des Thorax (Abbildung 7). Achten Sie darauf, zu vermeiden Punktion der Membran. DieSchlauch wird dann vorsichtig aus der Brustwand gezogen, bis er auf Widerstand tritt aus der Naht "Stopper" an der Kante des gefensterten Abschnitt des Rohres befindet.
  11. Zeigen die Bühne flach.
  12. Hinzufügen 3 cm H 2 O PEEP an das Beatmungsgerät zu helfen unterstützen Lungenkrebs reexpansion.
  13. Kleber (Pattex Gel, Henkel) in Umfangsrichtung um die Brust Fenster platziert. Die Membran gebunden ist, mit dem Deckglas zugewandten außerhalb der Brusthöhle. Vorsichtig (und umfangsmäßig) annähernd der Membran zu der Leim mit einem Baumwoll-Applikator.
  14. Während der Durchführung einer Lunge Rekrutierungsmanöver (3 Tidalvolumen während der die PEEP Lüfter-Anschluss verstopft ist), wird -3 mm Hg Saugen an der Brust Rohr aufgebracht. Die Lunge sollte anhaltend ungefähre die Membran, während sich frei bewegenden während Gezeiten Lüftung (Abbildung 8).
  15. Die rechte Vorderbein des Maus über die linke Seite durchquert, wodurch eine linke Seitenlage der Maus.Sponge Keile können verwendet werden, um richtig zu positionieren mit der Maus, so dass die Brust-Fenster mit der Mikroskopie Wasser Immersionsobjektiv ausgerichtet ist.
  16. Destilliertes Wasser wird auf dem Deckplättchen vor Mikroskopie platziert, so dass für die Visualisierung der Lunge unter Verwendung eines Wasser Immersionsobjektiv. Wasser müssen zeitweise ganz Bildgebung ergänzt werden.

6. Die Messung der Lungenfunktion Endothelial Oberflächenschichtdicke

  1. Unmittelbar nach Brustwand Verschlusses werden 500 ul FITC-markiertem Dextran 150 kDa (6% ige Lösung in PBS) über die zweite (nicht-Narkose) jugularis Venenkatheter verabreicht. Dieser dient als Bolus Volumengabe sowie das Gefäßsystem Tracer für ESL-Messung. Das Dextran Bolus hat keinen Einfluss auf neutrophilen Haftung oder Lungenödem Bildung 2.
  2. Das Wasser Immersionsobjektiv über das Deckglas zentriert. Die Wahl des Ziels ist wichtig zu kleinen Unterschieden in ESL Dicke eine hohe numeri visualisierencal Blende benötigt wird (> 0,8) unter Beibehaltung einer 2 - 3 mm Arbeitsabstand (ermöglicht das Eindringen durch die Lunge Fenster und Pleuraoberfläche). Wir verwenden die Nikon CFI 75 LWD 16x (NA 0,8) und CFI 75 LWD 25x (NA 1,1) Ziele für diesen Zweck.
  3. Um genau messen ESL Dicke in einem sich bewegenden Organ, ist es wesentlich, dass Hell-und fluoreszierende vaskulären Breiten gleichzeitig durchgeführt werden. Dies kann unter Verwendung eines Bildes Splitter (Dual View, Photometrics), die für die gleichzeitige Erfassung des reflektierten Lichts Differential-Interferenz-Kontrast (DIC, Hellfeld) und FITC Bilder (Abbildung 9) ermöglicht werden.
  4. Während eines 5 sec inspiratorische Pause ist eine kontinuierliche Bildgebung durchgeführt und aufgezeichnet. Später können diese Bilder überprüft werden, um in-Messfeld zu identifizieren.
  5. Verwendung eines In-Fokus-Rahmen, subpleuralen Mikrogefäßen (<20 Mikrometer Durchmesser) werden identifiziert; mindestens 3 Mikrogefäßen werden typischerweise auf einem einzigen Rahmen vorhanden. Nach Beendigung des Versuchs, DICund FITC-Dextran vaskulären Breiten gemessen werden (durch eine Blindbeobachter) durch Mitteln der Längen der drei senkrechten Abschnitte pro Mikrogefäßzellen. Annahme gleicher ESL Dicke an beiden Rändern des Schiffes kann die ESL Größe um die Hälfte der Differenz zwischen DIC und FITC-Dextran vaskulären Breiten, wie in der Repräsentative Ergebnisse Abschnitt definiert werden.
  6. Typischerweise kann Intravitalmikroskopie für> 90 min ohne jeden Beweis der Lungenschädigung oder Hypotonie 2 durchgeführt werden. Vorläufige Experimente durchgeführt werden, um mit der Maus Stabilität (Blutdruck, Sauerstoffsättigung, Lüftung, Lungenschädigung) während des Beobachtungszeitraums zu bestätigen. Experimentelle Medikamente können durch den zweiten (nicht-Narkose) Jugularkatheter an irgendeinem Punkt während des Verfahrens eingebracht werden.

7. Alternative Messung der Lungenfunktion Endothelial Surface Layer Integrität

Die intakten Endothelzellen Oberflächenschicht Funktionen (teilweise) auszuschließen circulatten Elemente aus der endothelialen Oberfläche 2. ESL Integrität kann daher durch die Fähigkeit einer Umlaufelement (zB eine fluoreszierende Mikrokugel) für den Zugriff und die Interaktion mit Zelloberflächen-Adhäsionsmolekülen (wie ICAM-1) gemessen werden.

  1. Anti-ICAM-1 markierten fluoreszierenden Mikrosphären vor der Operation vorbereitet. Streptavidin-beschichtete 0,97 um fluoreszierenden Mikrosphären werden mit biotinyliertem Anti-ICAM-1 (Klon YN1/1.7.4, 1:50, eBioscience) Antikörper oder Isotyp-Kontrolle für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mikrokugeln werden dreimal gewaschen und in PBS suspendiert bei 1 x 10 9 pro ml Mikrokügelchen.
  2. Während Intravitalmikroskopie wird die Mikrosphären Suspension (100 ul) in die Vena Katheter injiziert. Nach 15 min der Zirkulation, sind fluoreszierende Bilder über 5 min erfasst. Microspheres unbeweglich> 5 min gelten als Anhänger und quantifiziert mit Bildverarbeitungs-Software.

8. Sterbehilfe

Nach Abschluss des Verfahrens werden narkotisierten Mäusen durch Ausbluten über direkte Herzpunktion eingeschläfert. Sterbehilfe wird über bilaterale Pneumothoraces, nach denen Lungen geerntet und schockgefroren zur späteren Analyse bestätigt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Der experimentelle Ansatz in den Schritten 1-6 beschrieben ermöglichen Erfassung von mehreren Frames gleichzeitiger DIC (Hellfeld) und fluoreszierende Bilder. Um ESL Dicke zu bestimmen, werden aufgenommene Bilder mit einer Blindbeobachter nach Beendigung des experimentellen Protokolls bewertet. Mit Hilfe eines in-Fokussierrahmen subpleural Mikrogefäßen (<20 Mikrometer Durchmesser) identifiziert; mindestens 3 Mikrogefäßen sind in der Regel auf einem einzigen Rahmen (Abbildung 10). Mit Bildanalyse-Soft...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Koinzident mit dem expandierenden Verwendung von in vivo-Mikroskopie, gibt es zunehmende Wertschätzung sowohl für die beträchtliche Größe der ESL sowie dessen zahlreichen Beiträge Gefäßfunktion. Diese neuen Daten werden jedoch vor allem aus Studien der systemische Gefäßsystem abgeleitet. In der Tat, der in vivo-Mikroskopie in der Lunge zu verwenden ist technisch anspruchsvoll, da signifikante pulmonale und kardiale Bewegungsartefakte.

Mehrere neuere technische Fortschritte ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

Wir danken Drs. Arata Tabuchi und Wolfgang Kübler (University of Toronto) für den Unterricht über Intravitalmikroskopie. Wir danken Andrew Cahill (Nikon Instruments) für die Unterstützung in der Mikroskopie Design und Implementierung. Diese Arbeit wurde vom NIH / NHLBI Zuschüsse P30 HL101295 und K08 HL105538 (auf EPS) finanziert.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenz
FITC-Dextran (150 kDa) Sigma FD150S
TRITC-Dextran (150 kDa) Sigma T1287
Streptavidin-beschichtete fluoreszierenden Mikrosphären Bangs Laboratories CP01F/10428 Dragon Green Fluoreszenz (ähnlich FITC)
Ketamin Moore Medical
Xylazin Moore Medical
Anti-ICAM-1-Antikörper biotinylierter eBioscience Klonen YN1/1.7.4 1:50 Verdünnung
Isotyp biotinylierten Antikörper eBioscience IgG2b eB149/10H5 1:50 Verdünnung
EQUIPMENT
Beatmungsgerät Harvard Apparatus Inspira
Tracheostomie Katheters Harvard Apparatus 730028
Elektrokauter Gerät DRE Medical Valleylab SSE-2L
Bipolar Kauter Pinzette Olsen Medical 10-1200i 9.9cm McPherson
Temperatur control-System World Precision Instruments ATC1000
Spritzenpumpe Harvard Apparatus Pumpe 11 Elite
Microscope (Weitfeld) Nikon LV-150
Microscope (konfokalen) Nikon A1R
Bild Splitter Photometrics DV2
CCD-Kamera Photometrics CoolSNAP HQ2
Bildverarbeitungs-Software Nikon NIS Elements
Polyvinylidenfluorid-Membran Kure Wrap
Circular Deckglas Bellco 5CIR-1-BEL 5 mm, Nr. 1 Dicke
Glue (Deckglas zur Membran) Pattex Flüssig (liquid) Zum Aufkleben Deckglas zur Membran
Glue (Deckglas zur Maus) Pattex Gel Membran zum Anbringen an Maus
Chirurgische Schläuche Intramedic PE50, PE10
Naht Fischer 04.00 Seide
Trockenrasierer Oster 78997
Chirurgische Zange gekrümmten Roboz
Gerade chirurgische Pinzette Roboz
Chirurgische Schere Roboz
Chirurgische Mikroschere Roboz
Chirurgische Nadeltreiber Roboz
Surgical tape Fischer
Kitchen sponges (Schnitt in Keile) verschiedene

Referenzen

  1. Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung. AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).
  2. Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).
  3. Florian, J. A., et al. Heparan sulfate proteoglycan is a mechanosensor on endothelial cells. Circ. Res. 93, e136-e142 (2003).
  4. Chappell, D., et al. The Glycocalyx of the Human Umbilical Vein Endothelial Cell: An Impressive Structure Ex Vivo but Not in Culture. Circulation Research. 104, 1313-1317 (2009).
  5. Potter, D. R., Damiano, E. R. The hydrodynamically relevant endothelial cell glycocalyx observed in vivo is absent in vitro. Circ. Res. 102, 770-776 (2008).
  6. Weinbaum, S., Tarbell, J. M., Damiano, E. R. The Structure and Function of the Endothelial Glycocalyx Layer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 121-167 (2007).
  7. Pittet, M., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  8. Kilpatrick, D. C., Graham, C., Urbaniak, S. J., Jeffree, C. E., Allen, A. K. A comparison of tomato (Lycopersicon esculentum) lectin with its deglycosylated derivative. Biochem. J. 220, 843-847 (1984).
  9. Smith, M. L., Long, D. S., Damiano, E. R., Ley, K. Near-wall micro-PIV reveals a hydrodynamically relevant endothelial surface layer in venules in vivo. Biophys. J. 85, 637-645 (2003).
  10. Vink, H., Duling, B. R. Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries. Circ. Res. 79, 581-589 (1996).
  11. Marechal, X., et al. Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress. Shock. 29, 572-576 (2008).
  12. Presson, R. G. Jr, et al. Two-Photon Imaging within the Murine Thorax without Respiratory and Cardiac Motion Artifact. The American Journal of Pathology. 179, 75-82 (2011).
  13. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Meth. 8, 91-96 (2011).
  14. Pearse, D. B., Wagner, E. M., Permutt, S. Effect of ventilation on vascular permeability and cyclic nucleotide concentrations in ischemic sheep lungs. J. Appl. Physiol. 86, 123-132 (1999).
  15. Hossain, M., Qadri, S., Liu, L. Inhibition of nitric oxide synthesis enhances leukocyte rolling and adhesion in human microvasculature. Journal of Inflammation. 9, 28(2012).
  16. Schmidt, E. P., et al. Soluble guanylyl cyclase contributes to ventilator-induced lung injury in mice. AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, L1056-L1065 (2008).
  17. Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. J. Appl. Physiol. 28, 596-608 (1970).
  18. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J. Appl. Physiol. 104, 338-346 (2008).
  19. Gattinoni, L., Protti, A., Caironi, P., Carlesso, E. Ventilator-induced lung injury: the anatomical and physiological framework. Crit. Care Med. 38, 539-548 (2010).
  20. Tabuchi, A., Kim, M., Semple, J. W., Kuebler, W. M. Acute Lung Injury Causes Pendelluft Between Adjacent Alveoli In Vivo. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, A2490(2011).
  21. Roebuck, K. A., Finnegan, A. Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression. J. Leukoc. Biol. 66, 876-888 (1999).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Weitere Artikel entdecken

Intravitalmikroskopiepulmonale Mikrovaskulaturfluoreszierendes DextranDIC-BildgebungMäuselungeGlykokalyx-IntegritätThoraxdrainagesimultane BildgebungESL-Messung
In vivo Messung der Maus Pulmonary Endothelial Surface Layer
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.