Methodenartikel

Untersuchung von Makrophagen-Polarisation mit Knochenmark-Makrophagen

DOI:

10.3791/50323

⸱

23. Juni 2013

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1Department of Animal Science, Texas A&M University, 2Department of Biology, Texas A&M University, 3Department of Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Der Artikel beschreibt eine leicht einfach adaptive In vitro Modell Makrophagen Polarisation zu untersuchen. In Gegenwart von GM-CSF/M-CSF, hämatopoetische Stammzellen sind / Vorläuferzellen aus dem Knochenmark in Monozyten Differenzierung gerichtet, gefolgt von M1 oder M2 Stimulation. Der Aktivierungsstatus kann durch Änderungen in Zelloberflächen-Antigene, Genexpression und Zellsignalwege verfolgt werden.

Zusammenfassung

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Der Artikel beschreibt eine einfache adaptive leicht in vitro Modell zur Makrophagen-Polarisierung zu untersuchen. In Gegenwart von GM-CSF/M-CSF, hämatopoetische Stammzellen sind / Vorläuferzellen aus dem Knochenmark in Monozyten Differenzierung gerichtet, gefolgt von M1 oder M2 Stimulation. Der Aktivierungsstatus kann durch Änderungen in Zelloberflächen-Antigene, Genexpression und Zellsignalwege verfolgt werden.

Einleitung

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Im Unterschied zu klassischen Entzündungsreaktionen, Makrophagen, die Gewebe infiltrieren zeigen oft polarisiert Aktivierungsstatus, die eine entscheidende Rolle bei der Regulierung Wirtsgewebe physiologischen Funktionen 1-8 spielt. Nach Stimulation kann Makrophagenaktivierung in classic (M1) und alternativen (M2) Aktivierung 2, 4, 9 sortiert werden. M1 Makrophagenaktivierung hängt von Toll-like Rezeptoren (TLR) und Aktivierung von nuclear factor kappa B (NFKB) / c-Jun N-terminal kinase 1 (JNK1), was zur Produktion von inflammatorischen Zytokinen wie TNF-α und IL- 1β und Aktivierung von iNOS, die zu einer erhöhten Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies wie Nitrid-Oxid (NO) 10, 11. Im Gegensatz dazu führt M2 Makrophagen-Aktivierung rekrutiert PPAR, PPAR oder IL-4-STAT6 Wege, um alternative, entzündungshemmende (M2), die mit Aktivierung Hochregulation von Mannose-Rezeptor CD206 zugeordnet ist, und Arginase 1 (Arg1) 6, 12 - 14 </ Sup>.

Knochenmark abgeleiteten Makrophagen (BMDM) präsentieren eine ideale in vitro Modell, um die Mechanismen, die die Polarisation des aktivierten Makrophagen 15 zu verstehen. Insbesondere kann die Aktivierung von Makrophagen M1 durch Lipopolysaccharide (LPS) Stimulation induziert werden, während Polarisation M2 Makrophagen IL-4 und / oder IL-13 induziert werden kann. Ältere Knochenmark stammende Makrophagen und aktivierten Makrophagen durch Durchflusszytometrie-Analyse auf die Expression von Oberflächen-Antigenen, einschließlich CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 und CD86 9, 16, 17 identifiziert werden. Darüber hinaus können Änderungen in der Produktion von Zytokinen und Zellsignalwege mit Makrophagen Polarisationsrichtung zugeordnet ist, durch quantitative RT-PCR und Western Blot, jeweils gemessen werden. Zusammenfassend kann Knochenmark der Maus Makrophagen als relevantes Modell Makrophagen Polarisation in-vitro-Studie dienen.

Protokoll

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1. Isolation von Knochenmarkzellen

  1. Isolieren Oberschenkels und des Schienbeins Knochen von 6-8 Wochen alten Mäusen, abspülen Haar und dann aufgeschnitten den Knochen.
  2. Verwenden Sie eine Nadel 21G und 10-ml-Spritze zu spülen Knochenmark in kaltem PBS +2% hitzeinaktiviertes Fetal Bovine Serum (FBS) (3-5 ml / Maus).
  3. Pass Knochenmark durch eine 21G Nadel 4-6 mal um die Zellen zu distanzieren.
  4. Pass Zellen durch eine 70 um Zellsieb zu Zellklumpen, Knochen, Haare und andere Zellen / Gewebe zu entfernen.
  5. In 3 Volumen von NH 4 Cl-Lösung (0,8% NH 4 Cl-Lösung, Stemcell Technology), und Inkubation auf Eis für 10 min, um rote Blutkörperchen zu entfernen.
  6. Spin down Zellen bei 500 xg für 5 min bei 4 ° C.
  7. Zellpellet in kaltem PBS + 2% FBS (20-50 ml, je nach der Menge der Zellen).

2. Induction BMDM Formation

  1. Resuspendieren der isolierten Knochenmarkzellen in BMDM Wachstumsmedium (2x10 6 Zellen / ml).

BMDM Wachstumsmedium:

Iscoves Modified Dulbecco-Medium (IMDM) + 10% FBS + 15% gefiltert (0,2 um) L-929-Zellen (ATCC, CCL-1) Kulturüberstand (mit Monozyten-Kolonie-stimulierender Faktor, M-CSF) oder 10 ng / ml M -CSF.

Hinweis: L-929 Zellüberstand enthält M-CSF 18. Um die effektive Aktivität des konditionierten Mediums, 5 X 10 5 sicherzustellen L-929-Zellen in T75 cm 2-Kolben für 6-7 Tage ausgesät, konditionierte Medium gesammelt und durch ein 0,45 um-Filter vor dem Gebrauch übergeben. Aliquots Medium kann sofort verwendet werden oder gespeichert in -80 ° C für 1-2 Monate.

  1. Seed-Zellen in 6 oder 12 Loch-Gewebekulturplatten (je nach Versuchsaufbau) (Corning Costar).
  2. Ändern frisch BMDM Wachstumsmedium am 3. Tag.
  3. Am 7. Tag wird die Bildung von reifen BMDM ausgewertet mittels Durchflusszytometrie-Analyseund Fluorophor konjugierten Antikörpern zu erkennen exprimieren CD11b und F4/80.

3. BMDM Polarized Aktivierung

  1. Am Tag 7, an die frische Stimulation Medium ändern: für M1 Aktivierung verwenden IMDM mit 10% FBS und 100 ng / ml LPS oder 100 ng / ml LPS mit 50 ng / ml IFN; M2 für Aktivierung verwenden IMDM mit 10% FBS mit 10 ng / ml IL-4 und / oder 10 ng / ml IL-13.
  2. Sammeln angeregt BMDMs durch Lösen sie aus der Schale mit warmem 0,05% Trypsin, gefolgt vom Waschen der Zellen zweimal mit PBS, enthaltend 10% FBS.

Hinweis: Um lösen und suspendieren reifen Makrophagen nach der Differenzierung, 0,05% Trypsin-Lösung (enthaltend 0,48 mM EDTA, Invitrogen) oder 2-5 mM EDTA in Ca-und Mg-freiem PBS oder Hanks-Puffer (HBSS) verwendet werden. Bei der Verwendung von Trypsin Verdauung Medium werden die Zellen bei 37 ° C für weniger als 10 Minuten behandelt, um Verlust zu vermeiden surGesicht Proteine ​​aufgrund über-Verdauung.

  1. Mit Antikörpern, um die Expression von Zelloberflächen-Antigene, einschließlich CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 oder CD86 zu verschiedenen Zeitpunkten mit Standard Durchflusszytometrie Färbeverfahren.
  2. Bestimmen Expression von Genen charakteristisch aktivierten M1 und M2 Makrophagen einschließlich IL-1β, TNF-α und IL-6 (M1 Aktivierung) oder IL-10, IL-13, arginase1 und PPAR (M2 Aktivierung) mit qRT-PCR. Bestimmen Aktivierung der Zelle Signalwege in der Aktivierung von M1 oder M2 Makrophagen durch Western-Blot-Analyse beteiligt.

Ergebnisse

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Eine schematische Beschreibung des BMDM Generation Verfahren vorgestellt (Abbildung 1). Hohe Reinheit von reifen Makrophagen an Tag 7 beobachtet werden, wenn sie 95 bis 99% der CD11b + F4/80 + Zellen (Abbildung 2) zu vertreten. Polarisierte Makrophagen untersucht werden unter Verwendung von Antikörpern gegen CD11b, F4/80, gefolgt CD11c und CD206 mittels Durchflusszytometrie-Analyse. Wie in Abbildung 3 gezeigt, sind M1 Makrophagen erkannt CD11b + CD11c + + F4/80 CD206-Zellen (Q2), während M2 Makrophagen sind CD11b + CD11c + F4/80-CD206 + Zellen (Q4). Die Aktivierung BMDM Status kann durch eine erhöhte zelluläre Größe (Abbildung 4A, rechte Shift in FSC-A) und erhöhte Fülle von Oberflächen-Antigene CD69, CD80, CD86 auf Makrophagen oder bestätigt werden (Gate: CD11b + F4/80 +), wie in Abbildung gezeigt 4B. Cytokin-Produktion, Genexpression und Zellsignalwegs Aktivierung in M1 oder M2 Makrophagen unter Verwendung quantitative RT-PCR oder Western-Blotting werden. As in Abbildung 5 dargestellt, wurden Arginase 1 (Arg1) und PPAR Ebenen in M2 Makrophagen bei 10 ng / ml IL-4 Stimulation erhöht, während IL-1β und TNF-Produktion in Makrophagen (M1) mit 100 ng / ml LPS stimuliert wurden erhöht , die durch p65 Aktivierung (Abbildung 6) begleitet.

BMDM-Differenzierungsprozessdiagramm, Isolierung von Knochenmarkzellen bis zur Genexpressionsanalyse.
Abbildung 1. Schema für die Isolierung, Bildung und Förderung der Maus BMDMs. Schritt für Schritt-Anleitungen sind im Text beschrieben. In kurzen, Oberschenkel und Schienbein Knochen von 6-8 Wochen Mäusen und Knochenmarkszellen unter Verwendung von PBS mit 2% hitzeinaktiviertem FBS gespült gesammelt. Nach roten Blutkörperchen mit NH4Cl-Lösung lysiert, werden die Zellen in BMDM Wachstumsmedium für 7 Tage durch Reifung und Analyse auf Reinheit der Zellpopulation kultiviert wurden. Für die Analyse von Makrophagen po Polarisation wurden die Zellen mit LPS oder LPS + IFN für M1, oder IL-4 und / oder IL-13 für M2 Aktivierung stimuliert. Polarisierte Makrophagen kann auf der Grundlage von Änderungen in der Zellmorphologie, Oberflächenmarker Präsentation Zytokinproduktion und Zellsignalwegs aktiviert ausgewertet werden.

Punktdiagramm für Durchflusszytometrie; SSC vs. FSC und CD11b vs. F4/80 Antigen-Dichteanalyse-Tabelle.
Abbildung 2. Durchflusszytometrie Analyse BMDM Bildung. (A) waren die ersten BMDMs gated auf FSC und SSC, um Schmutz und Konjugate zu entfernen. (B) Mature BMDMs wie definiert wurden CD11b + F4/80 + Subpopulationen (oben rechts) mit der Reinheit als Prozentsatz angezeigt Grundgesamtheit gated auf FSC / SSC.

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Abbildung 3. . Makrophagen Polarisationsanalyse Tissue infiltrierten Makrophagen als CD11b + F4/80 + Zellen definiert; M1 Makrophagen CD11b + CD11c + + F4/80 CD206-Zellen, während M2 Makrophagen CD11b + CD11c + F4/80-CD206 + Zellen.

Durchflusszytometrische Analyse, M0-, M1-, M2-Makrophagen; stimuliert vs. unstimuliert, CD11b+F4/80+ Gating.
Abbildung 4. Makrophagen-Aktivierungs-Analyse mittels Durchflusszytometrie. (A) Nach der Aktivierung, erhöhen die Größe der Makrophagen durch die Verschiebung der FSC-A von M1 oder M2 Makrophagen nach 24 Stunden nach Stimulation im Vergleich zu M0 (unbehandelt) Makrophagen nachgewiesen. (B) Die Aktivierung Zusammenhang Oberflächenmarker wurden mittels Durchflusszytometrie nach IL4 oder LPS-Stimulation untersucht. Die frühen reagiert CD69 wurde bei 5 oder 24 Stunden nach der Stimulation ausgewertet, CD80 und CD86 markers wurden 48 h nach Stimulation analysiert. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Balkendiagramm; IL-4-Einfluss auf die relative Häufigkeit von Arginase 1 und PPARγ; Analyse der Genexpression.
Abbildung 5. Alternative Aktivierung von Makrophagen. Makrophagen mit 10 ng / ml IL-4 für 24 Stunden stimuliert wurden gesammelt und Gesamt-RNA extrahiert. Erhöhte Arginase 1 (Arg1) und PPAR-Expression wurde in M2 Makrophagen erkannt zu unbehandelten Makrophagen mittels quantitativer RT-PCR-Analyse verglichen.

Balkendiagramm und Western Blot zur Analyse der IL-1β- und TNFα-Expression; LPS-Wirkung auf P-p65- und p65-Proteine.
Abbildung 6. Klassische Aktivierung von Makrophagen. (A) Gesamt-RNA wurde aus Makrophagen mit 100 ng / ml L stimuliert extrahiertPS 24 h und in quantitative RT-PCR-Analysen. Expression von entzündungsfördernden Zytokinen einschließlich IL-1β und TNF in M1 Makrophagen erhöht. (B) Aktivierung des NFKB Weg durch LPS induziert wurde, wie unter Verwendung Antikörpern gegen p65 und p65 phosphoryliert in Western-Blot-Analysen.

Diskussion

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Wir berichten hier über eine einfache und leicht anpassbar in vitro Verfahren zur Aktivierung von Makrophagen aus Knochenmark-Vorläuferzellen abgeleitet induzieren. Dieses Verfahren kann zur Untersuchung der Mechanismen, die für die Polarisation von Makrophagen verwendet werden. Die Reinheit von reifen Makrophagen unter Verwendung dieses Protokolls beträgt 95 bis 99%, und keine zusätzlichen Reinigungsschritte benötigt werden. Um die Funktion bestimmter Gene von Interessen im Rahmen der Makrophagen-Polarisierung, ektopische Expression oder Gen-spezifischen Knockdown untersuchen können folgende Transfektion der Zellen am Tag 7 durchgeführt werden. Dieses Protokoll wird auch eine 7-tägige Kultur Fenster, um die Auswirkungen bestimmter Faktoren oder Gene, die die Bildung, Reifung und Phänotyp von Makrophagen beeinflussen zu untersuchen.

Aktivierte Makrophagen zeigen komplizierten zellulären und molekularen Profile mit großer Plastizität als Reaktion auf verschiedene Stimuli 3, 9, 19. FürBeispielsweise löst LPS potenten pro-inflammatorischen M1 Antworten, die weiter verbessert werden in Gegenwart von IFN oder Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) und IL-4 und IL-13 sowohl stimulieren M2 Aktivierung kann, aber die Aktivierung Profile nicht vollständig überlappen 3, 4, 9, 15, 19, 20. Die Ergebnisse in diesem Protokoll vorgestellt stellen nur typische Ergebnisse von Experimenten mit Knochenmark-Makrophagen mittels Durchflusszytometrie, quantitative RT-PCR und Western Blot analysiert. Oberfläche Antigen-Präsentation und Zelle Signalwege mit der Aktivierung von Makrophagen assoziiert variieren, wie in der umfangreichen Literatur über Makrophagen Polarisation 1-8 festgestellt.

Offenlegungen

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von der American Heart Association (BGIA 7850037 Dr. Beiyan Zhou) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
IMDMThermo ScientificSH30259.01
Fötales RinderserumInvitrogen10438-026
Maus GM-CSFPeproTech315-03
NH4ClStemCell Technologies7850
L-929ATCCCCL-1
70 μ m ZellensiebBD Biosciences352350
10 x PBSThermo ScientificAP-9009-10
Anti-Maus CD11b-APCeBioscience17-0112-81
Anti-Maus F4/80-FITCeBioscience11-4801-81
Anti-Maus CD69-PEeBioscience12-0691-81
Anti-Maus CD86-PEeBioscience12-0862-81
Propidium-Jod-InvitrogenP3566

Referenzen

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DurchflusszytometrieEchtzeit PCRWestern BlotZelloberfl chenantigeneGenexpressionsanalyseM1 M2 AktivierungZytokindetektionZellsignalwege

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