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Methodenartikel

Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

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DOI:

10.3791/50329

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2. April 2013

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Illinois at Chicago , 2Department of Anesthesiology, University of Illinois at Chicago

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier berichten wir über eine experimentelle Technik der Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie um heterotypische Thrombozyten-Neutrophilen-Interaktionen auf dem aktivierten Endothel während der vaskulären Entzündungen und Thrombusbildung in lebenden Mäusen sichtbar zu machen. Diese mikroskopische Technik wird wertvoll sein, um die molekularen Mechanismen der vaskulären Erkrankungen zu studieren und pharmakologische Mittel unter pathophysiologischen Bedingungen zu testen.

Zusammenfassung

Wechselwirkung von aktivierten Blutplättchen und Leukozyten (hauptsächlich Neutrophile) auf der aktivierten Endothel vermittelt Thrombose und vaskuläre Entzündung. 1,2 Während Thrombusbildung an der Stelle der Verletzung arteriolären unterstützen Blutplättchen Anhänger der aktiviertes Endothel und subendothelialen Matrixproteinen neutrophilen rollenden und Haftung. 3 Umgekehrt unter venulären entzündlichen Erkrankungen können Neutrophile Anhänger der aktiviertes Endothel unterstützt Haftung und Akkumulation von zirkulierenden Blutplättchen. Heterotypische Blutplättchen-Aggregation neutrophilen erfordert sequentiellen Prozessen von den spezifischen Rezeptor-counter Rezeptor-Wechselwirkungen zwischen Zellen. 4 Es ist bekannt, aktivierten Endothelzellen Adhäsionsmolekülen wie von Willebrand-Faktor freizusetzen, initiiert somit Plättchenadhäsion und Akkumulation unter Hochscherbedingungen. 5 Außerdem aktivierten Endothelzellen unterstützt Neutrophilen rolling und Haftung durch die Expression Selektine eined interzellulären Adhäsionsmoleküls-1 (ICAM-1), bzw. bei niedrigen Shear-Bedingungen. 4 Platelet P-Selektin interagiert mit Neutrophilen durch P-Selektin Glykoprotein Ligand-1 (PSGL-1), dadurch Induzieren Aktivierung der neutrophilen β2 Integrinen und feste Haftung zwischen zwei Zelltypen. Trotz der Fortschritte in der in vitro-Experimenten, bei denen heterotypische Blutplättchen neutrophilen Wechselwirkungen in Vollblut oder isolierte Zellen, 6,7 ermittelt werden diese Studien nicht manipulieren kann Oxidationsmittel Stressbedingungen bei Gefäßerkrankungen. In diesem Bericht mit fluoreszenzmarkierten, spezifische Antikörper gegen eine Maus Blutplättchen und Neutrophilen-Marker beschreiben wir eine detaillierte Protokoll zu intravitalmikroskopische heterotypische Wechselwirkungen von Blutplättchen und Neutrophilen auf der aktivierten Endothelzellen während TNF-α-induzierte Entzündung oder nach laserinduzierten überwachen Verletzungen M. cremaster Mikrogefäßen von lebenden Mäusen.

Protokoll

Ein. Vorbereitung der Intravital Mikroskop (Abbildung 1A)

  1. Bereiten Superfusion Puffer (125 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2 und 17 mM NaHCO 3, pH 7,4).
  2. Schalten Sie eine Durchblutungsstörung Wasserbad auf eine Temperatur von Puffer und eine thermo-kontrollierten Decke bei 37 ° C zu halten Belüften mit Stickstoffgas Puffer (5% CO 2 mit Stickstoff ausgeglichen).
  3. Schalten Sie den Mikroskop-System (Sutter Lambda DG-4 High-Speed-Wellenlänge Wechsler, Arbeitsplatzrechner, Olympus BX61W Mikroskop, MPC-200 Multi-Manipulator, ROE-200 Phase-Controller, High-Speed-Kamera, und Verstärker).
  4. Für die Gefäßentzündung Modell verwenden eine 100% dichroitischen Spiegel. Zur Thrombusbildung durch Laser Schädigung induzieren, Ersetzen einer 100%-Spiegel mit einem 50/50%-Spiegel und drehen auf einer Mikrospitze Laserablationssystem.

2. Vorbereitung der Cremaster Muskel für Intravital Mikroskopie (Abbildung 1B)

  1. Anesthetize amännliche Maus (6-8 Wochen alt, C57BL / 6) durch ip-Injektion von Ketamin (125 mg / kg Körpergewicht (BW)) und Xylazin (12,5 mg / kg KG). Die University of Illinois Institutional Animal Care und Formate gebilligten alle Tierhaltung und experimentellen Verfahren. Für eine Gefäßentzündung Modell, injizieren murine TNF-α (0,5 ug in 250 ul Kochsalzlösung) intrascrotally in eine Maus 3 Stunden vor der Bildgebung (2-2.5 Stunden vor der Operation).
  2. Platzieren Sie die Maus auf einem thermo-kontrollierten Decke bei 37 ° C auf einem intravital Mikroskop Fach.
  3. Ziehen Sie die Haut auf der Oberfläche des Halses mit einer Pinzette und einschneiden horizontal die Mittellinie des Halses Haut bis zu 1 cm mit einer Schere.
  4. Öffnen Sie vorsichtig die zervikalen Muskeln mit stumpfen Schere und entfernen Sie die Muskeln rund um die Luftröhre.
  5. Kanülieren eine PE90 Rohr in Luftröhre Atemnot zu beseitigen.
  6. Entfernen Sie vorsichtig die linke Seite des zervikalen Muskeln und zu isolieren, die Halsschlagader vom umgebenden Gewebe.
  7. C jährlichspät ein PE10 Rohr in der linken Halsschlagader zur Infusion von Antikörpern und zusätzliche Anästhetika.
  8. Ziehen Sie vorsichtig und einschneiden die Skrotalhaut horizontal. Um Gewebe Integrität während des Experiments zu erhalten, wurde vorgewärmtem Puffer über dem OP-Feld superfundiert.
  9. Drücken Sie auf den Unterleib mit einer Pinzette und vorsichtig einen Hoden mit der anderen forcep.
  10. Entfernen Sie die umliegende Bindegewebe rund um die Hoden.
  11. Inzision des M. cremaster vertikal und glätten den Muskel über einem Deckglas auf einem intravital Mikroskop Schale durch Pinning der Peripherie.
  12. Erlauben 10-20 min für die Muskel vor der Datenerfassung stabilisieren. M. cremaster Arteriolen (für Thrombusbildung) und Venolen (für Gefäßentzündung) mit einem Durchmesser von 30-45 um wurden für unsere Studie ausgewählt.
  13. Um Anästhesie Bedingungen aufrechtzuerhalten, einzuflößen 30-50 ml des gleichen Narkose ca. alle 30 min durch die Vena cannulus.

3. Intravital Mikroskopie für TNF-α-induzierte vaskuläre Inflammation

  1. Nach Platzierung der Maus auf den intravital Mikroskop, offene SlideBook 5,0 Software und klicken Sie auf "Focus Window" in der Menüleiste, um die entsprechende Optik und objektive (60X) eingestellt.
  2. Infuse DyLight 488-konjugierten Ratte-anti-Maus-CD42c (0,1 ug / g BW in 100 ul Kochsalzlösung) und Alexa Fluor 647-konjugierten Ratte-anti-Maus-Gr-1-Antikörper (0,05 pg / g BW in 100 ul Kochsalzlösung) über einen Vena cannulus .
  3. Zum Menüleiste und klicken Sie auf "Image Capture" in der Symbolleiste.
  4. Ein neues Menü öffnet sich, in "Bild", wählen Sie "Bin Factor" als 1x1 und wählen Sie "640" auf Breite und "460" auf der Höhe.
  5. In "Filter Set", markieren Sie die Checkbox für die Kanäle, die Sie gerne zu entlarven und die Belichtungszeit für jeden würde. Zum Beispiel, offenen Kanal: 10 ms, FITC-Kanal: 50 ms, und Cy5-Kanal: 50 ms.
  6. Wählen Sie "Time-Lapse Capture" um die Anzahl der Zeitpunkte und Intervall einstellen. For die Entzündung Modell wird die Anzahl von Zeitpunkten, um 1.000-1.500 mit einem Intervall von 200 ms (: 5 min Gesamt verstrichene Zeit) gesetzt.
  7. Klicken Sie auf "Test", um eine Ein-Ebenen-Bild in der angegebenen Belichtungszeit für diesen Kanal zu sehen. Passen Sie Belichtungszeit und / oder Mikroskop Licht, bis das Histogramm eine angemessene Intensitätsverteilung (Für Mehrkanal-Aufnahme, wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Kanal) zeigt.
  8. Nachdem alle Parameter eingestellt sind (Kanäle, Belichtungszeiten, und so weiter) in der "Image Capture", wählen Sie "Start", um die Aufzeichnung zu beginnen.
  9. Überwachen Wälz-und adhärente Thrombozyten und Neutrophilen für 5 min in der oberen Hälfte eines entzündeten cremaster venule in der Gefäßentzündung Modell. Acht bis zehn verschiedene Venolen in einem Maus aufgezeichnet.
  10. Bilder wurden mit insgesamt Vergrößerung 60X (1,0 NA Wasser Immersionsobjektiv) geben eine Fenstergröße von 157 um x 118 um.
  11. Nach Beendigung des Versuchs wurden die Mäuse über zervikalen Dislocatio euthanasiertn.

4. Data Analysis für die venulären Entzündung Modell

  1. Öffnen SlideBook 5,0 Software und klicken Sie auf "Ordner" auf der Menüleiste, um eine Datei zu öffnen.
  2. Klicken Sie auf den Dropdown-Kanal-Menü und wählen Sie "Öffnen, FITC, Cy5, etc."
  3. Klicken Sie auf "renormieren (roten und grünen Balken)" und wählen Sie den Kanal. Ziehen Sie die roten und grünen Balken nach links oder rechts auf rund optimieren Fluoreszenzsignal.
  4. Klicken Sie auf "Übernehmen" und "OK", um das Bild zu aktualisieren.
  5. Klicken Sie auf "Thumbnail Button" zur aktuellen Anzeige als Standard wählen.
  6. Spielen erobert timelapse Bild, und zählen Walz-und adhärenten Neutrophilen während der 5-Minuten-Zeitraum.
  7. Um Thrombozyten Thrombusbildung zu analysieren, "Mask" und wählen Sie "Create".
  8. Nennen Sie eine Maske und mark "In dem aktuellen Bild".
  9. Klicken Sie auf "Large Bleistiftsymbol" in "Marquee Tool" in der Hauptansicht.
  10. Farbe ist ein Bereich außerhalb des Schiffes in der Hauptansicht, um einen Hintergrund-Maske eingestellt.
  11. Gehe to "Mask", klicken Sie auf "Kopieren dieser Ebene", klicken Sie auf "Copy-Maske in der aktuellen Zeitpunkt" und wählen Sie "Alle Zeitpunkte", und klicken Sie auf "OK".
  12. Um Hintergrund-Signal zu berechnen, "Statistik" und klicken Sie auf "Mask Statistics".
  13. Klicken Sie auf "Aktuelle 2D Zeitraffer-oder 4D-Image (s)" in Bild Scope, und wählen Sie "Entire Mask" in Maske Scope. In Funktionen, wählen Sie "Abgelaufene Zeit (hh: mm: ms)" unter Datum der Aufnahme, wählen Sie "Area (Pixel)" unter Morphometrie, wählen Sie "Maximum Intensity" unter Intensität, und klicken Sie auf "Export" (Diese statistische Methode ermöglicht es uns, Berechnung Auto-Fluoreszenz Intensität (Hintergrund-Signal)).
  14. Öffnen Sie die Textdatei in MS Office Excel und berechnen den Mittelwert der Hintergrund-Signal während der Aufzeichnungsdauer. Dies ist der Hintergrund-Fluoreszenzintensität.
  15. Um Thrombus Intensität zu bestimmen, klicken Sie auf "Large Bleistiftsymbol" wieder in der "Marquee Tool" in der Hauptansicht.
  16. Farbe im Inneren des Behälters in der Hauptansicht die Thrombozytenfunktion Signal gesetzt.
  17. Gehen Sie auf "Mask", klicken Sie auf "Kopieren dieser Ebene", klicken Sie auf "Copy-Maske in der aktuellen Zeitpunkt", wählen Sie "Alle Zeitpunkte", und klicken Sie auf "OK".
  18. Gehen Sie auf "Statistik" und klicken Sie auf "Mask Statistics".
  19. Klicken Sie auf "Aktuelle 2D Zeitraffer-oder 4D-Image (s)" in Bild Scope, und wählen Sie "Entire Mask" in Maske Scope. In Funktionen, wählen Sie "Abgelaufene Zeit (hh: mm: ms)" unter Datum der Aufnahme, wählen Sie "Area (Pixel)" unter Morphometrie, wählen Sie "Sum Intensity" unter Intensität, und klicken Sie auf "Export" (Diese statistische Methode ermöglichen es uns, Berechnung der Fluoreszenzintensität innerhalb des Gefäßes).
  20. Öffnen Sie die Textdatei in MS Office Excel. Fluoreszenzsignal von Plättchen wird durch Subtraktion des Mittelwerts der Hintergrundintensität x Fläche (Pixel) aus der Summe der Intensität der Innenseite des Behälters berechnet wird. Dies ist die Fluoreszenzintensität der Blutplättchenthrombus.
  21. Wiederholen Sie dies in 30 verschiedenen Venolen in 3-5 verschiedenen Mäusen. Dann berechnen Medianwert der Fluoreszenzintensität von Blutplättchen.
  22. Aufanalysieren die Neutrophilen Walzen und Haftung, wurde die rollende Zustrom von Neutrophilen über 5 min in jedem venule ermittelt und als Zellzahlen pro Minute. Die Zahl der anhaftenden Neutrophilen, die stationär für> 30 sec waren und langsam kroch (<10 um über 30 sec), aber nicht überschlagen, wurden gezählt und als Zellzahlen pro 5 min.

5. Intravital Mikroskopie für Laser-induzierte arteriolären Thrombosis

5-1 Kalibrierung von Abtragslaser

  1. Legen Sie einen gespiegelten Folie auf Mikroskoptisch, wenden Sie einen kleinen Tropfen destilliertes Wasser bis zum oberen Rand der Folie, und stellen Sie die Intensität und Fokussierung mit dem Okular.
  2. Öffnen Sie "Focus Window" und wählen Sie "FRAP" tab in SlideBook 5,0 Software.
  3. Stellen Sie die Laserleistung bei 40-50, und setzen Sie beide "Doppelklick Wiederholungen" und "Doppelklick Größe" bis 8. Markieren Sie auf der "Guide"-Box zu bringen, eine Reihe von Fadenkreuz.
  4. Wählen Sie die "Pfeil"-Symbol in der Taskleiste on die oben auf dem Bildschirm.
  5. Unter dem "FRAP Alignment", klicken Sie "Fire next". Ein kleiner Fleck sollte in der Nähe der unteren linken Ecke auf dem Monitor erscheinen. Sobald der Fleck erscheint, doppelklicken Sie auf die Mitte des darauf klicken. Einmal angeklickt, sollte eine andere Stelle über angezeigt und auf der rechten Seite der ersten Stelle, doppelklicken Sie darauf. Wiederholen Sie dies für 16 Punkte (die 16 th Spot wird in der rechten unteren Ecke angezeigt.) Klicken Sie auf "Speichern", wenn Sie fertig die Kalibrierungsparameter zu aktualisieren.
  6. Um die Genauigkeit der Kalibrierung zu testen, auf dem "Center" button-einen kleinen Fleck auf sollte in der Mitte des Bildschirms angezeigt. Wenn nicht, wiederholen Sie die Kalibrierung, bis die gewünschte Genauigkeit erreicht ist.

5-2 Laser-induzierte arteriolar Thrombusbildung

  1. Legen Sie eine narkotisierten Maus (siehe das Verfahren der 2-2 bis 2-12) auf dem Mikroskoptisch.
  2. Unter dem "Capture"-Fenster, wählen Sie ein Protokoll oder eine neue erstellen. Die Einstellungen sind wie folgt: CY5 (70 ms Belichtungszeit), Open (10 msec Exposition) und FITC (50 msec Exposition). Das Bild wird über 20 min (ca. 2.400 Zeitpunkten mit einem Intervall von 500 ms) erfasst.
  3. Infundieren DyLight 488-konjugierten Anti-Maus-CD42c und Alexa Fluor 647-konjugierten Anti-Maus-Gr-1-Antikörpern wie oben beschrieben.
  4. Optimieren Mikroskop Parameter einschließlich Fluoreszenz und Hellfeld in 3-3 bis 3-7 beschrieben.
  5. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Test", um die ordnungsgemäße Hellfeld Intensität oder Antikörper-Signal, Arteriole Platzierung und Ausrichtung zu gewährleisten.
  6. Klicken Sie auf "Start", um die Bildaufnahme zu initiieren.
  7. Vor dem Brennen der Abtragslaser, stellen Sie sicher, dass der Mauszeiger das Symbol ausgewählt wurde und dass der Gefäßwand ist ein klarer Fokus.
  8. Um den Laser abfeuern, doppelklicken Sie auf eine Stelle 2-3 um intern auf der Gefäßwand. Verletzung der Arteriolen Endothelzellen bewirkt eine visuelle Form Veränderung, die offensichtlich sein sollte im Hellfeld Bild, gefolgt von Thrombozyten Akkumulation. Monitor ThrombusBildung für 5 min nach dem Laser Verletzungen.
  9. Fünf Minuten nach der Laser-Verletzung (der Thrombus Größe sollte nun stabil sein) pause und stornieren die Aufnahme. Anschließend starten Sie eine Aufnahme mit 2400 Punkte mit einem 500 ms Intervall auf adhärente Thrombozyten und rollenden / anhaftenden Neutrophilen für 20 min aufnehmen. Drei bis fünf Arteriolen in einem Maus aufgezeichnet.
  10. Nach Beendigung des Versuchs wurden die Mäuse über Genickbruch getötet.

6. Data Analysis für die Arteriolen Thrombose-Modell

  1. Fahren Sie über die Schritte 4.1 bis 4.5.
  2. Um den Hintergrund Fluoreszenzintensität während der Thrombozyten Thrombusbildung zu erhalten, gehen Sie über Stufen 4,7 bis 4,14.
  3. Gehen Sie auf "Mask", klicken Sie auf "Segment", wählen Sie FITC im Kanal, und legen Sie den Mittelwert der Hintergrund-Signal auf Low. Klicken Sie auf "Übernehmen" und "OK".
  4. Die Fluoreszenzintensität von Blutplättchenthrombus (DyLight 488-konjugierten Anti-CD42c-Antikörper) zu analysieren, über Stufen 4,18 durchlaufen 4,19. Um die Antikörper-Signals zu berechnen, "Summe Intensity" wird von der Hintergrund subtrahiert ("Maximum Intensity" x "Bereich (Pixel)"). Dies ist die Fluoreszenzintensität der Blutplättchenthrombus.
  5. Um die Rollen und anhaftenden Neutrophilen quantifizieren, spielen die timelapse und zählen die Anzahl der Zellen, die sichtbar in den Blutplättchenthrombus über 20 min rollen. Rollende wird als eine Abnahme der neutrophilen Geschwindigkeit definiert, während die Interaktion mit dem Blutplättchenthrombus für mindestens 2 Sekunden. Anhaftenden Neutrophilen gelten alle Neutrophilen, die an den Blutplättchen-Thrombus bleibt mindestens 2 min definiert. Die Zahl der rollenden und adhärenten Neutrophilen wurde als Zellzahlen pro 20 min vorgestellt. Walzgeschwindigkeit wurde berechnet unter Verwendung eines Teilchens Tracking-System.

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Ergebnisse

Verwendung einer detaillierten Intravitalmikroskopie Analyse waren heterotypische Blutplättchen neutrophilen Wechselwirkungen auf der aktivierten Endothel visualisiert durch Infusion von fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen ein Plättchen (CD42c) oder Neutrophilen Marker (Gr-1) in einen Live-Mäusen.

In einem Modell der TNF-α-induzierte venulären Entzündungen, wurden die meisten Rollen Neutrophilen stabil an das Endothel vermutlich durch Interaktion von aktivierten β2 Integrine mit ICAM-1 e...

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Diskussion

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für Echtzeit-Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie um heterotypische Thrombozyten-Neutrophilen-Interaktionen auf dem aktivierten Endothel während der vaskulären Entzündung und Thrombose zu visualisieren. Zuvor ähnliche fluoreszenzmikroskopische Ansätze gemeldet wurden, um die molekularen Mechanismen der Thrombusbildung und vaskuläre Entzündungen zu studieren. 8,12 Da die heterotypische Zell-Zell-Interaktion könnte für Vaso-Okklusion wichtig, an der verletzten Stell...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanzielles Interesse.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus National Institutes of Health (P30 HL101302 und RO1 HL109439 um JC) und der American Heart Association (SDG 5270005 JC) unterstützt. A. Barazia wurde von einem T32HL007829 NIH Ausbildungsförderung unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
NaClFisher Scientific7647-14-5
KClSigma-Aldrich7447-40-7
CaCl2 2H2O Sigma-Aldrich10035-04-8
MgCl2 6H2OFisher Scientific7791-18-6
NaHCO3Fisher Scientific144-55-8
0,9 % NaCl KochsalzlösungHospira0409-4888-10
KetaminHospira0409-2051-05
XylazinLloyd
Intramedizinische Schläuche (PE 90)BD Diagnostik427421
Intramedizinische Schläuche (PE 10)BD Diagnostik427401
murines TNF-& alpha;Forschung & Forschung D Systems410-MT
Dylight 488- markierter Anti-Maus-Antikörper für Ratten Emfret AnalyticsX488
Alexa Fluor 647-konjugierter Anti-Maus-Antikörper Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) BioLegend108418
NESLAB EX Wasserbad/ZirkulatorThermo-Scientific
Olympus BX61W MikroskopOlympus
TH4-100 LeistungOlympus
Lambda DG-4Sutter
MPC-200 MultimanipulatorSutter
R–-200 Stage ControllerSutter
C9300 HochgeschwindigkeitskameraHamamatsu
IntensifierVideo Scope International
Ablation LaserPhotonische Instrumente, Inc.
SlideBook 5.0in der intelligenten Bildgebung
Innovationen

Referenzen

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Intravitale Mikroskopiefluoreszierende Antik rperCremastermuskelTNF AlphaLaserverletzung
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