Hier berichten wir über eine experimentelle Technik der Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie um heterotypische Thrombozyten-Neutrophilen-Interaktionen auf dem aktivierten Endothel während der vaskulären Entzündungen und Thrombusbildung in lebenden Mäusen sichtbar zu machen. Diese mikroskopische Technik wird wertvoll sein, um die molekularen Mechanismen der vaskulären Erkrankungen zu studieren und pharmakologische Mittel unter pathophysiologischen Bedingungen zu testen.
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Methodenartikel
Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Wechselwirkung von aktivierten Blutplättchen und Leukozyten (hauptsächlich Neutrophile) auf der aktivierten Endothel vermittelt Thrombose und vaskuläre Entzündung. 1,2 Während Thrombusbildung an der Stelle der Verletzung arteriolären unterstützen Blutplättchen Anhänger der aktiviertes Endothel und subendothelialen Matrixproteinen neutrophilen rollenden und Haftung. 3 Umgekehrt unter venulären entzündlichen Erkrankungen können Neutrophile Anhänger der aktiviertes Endothel unterstützt Haftung und Akkumulation von zirkulierenden Blutplättchen. Heterotypische Blutplättchen-Aggregation neutrophilen erfordert sequentiellen Prozessen von den spezifischen Rezeptor-counter Rezeptor-Wechselwirkungen zwischen Zellen. 4 Es ist bekannt, aktivierten Endothelzellen Adhäsionsmolekülen wie von Willebrand-Faktor freizusetzen, initiiert somit Plättchenadhäsion und Akkumulation unter Hochscherbedingungen. 5 Außerdem aktivierten Endothelzellen unterstützt Neutrophilen rolling und Haftung durch die Expression Selektine eined interzellulären Adhäsionsmoleküls-1 (ICAM-1), bzw. bei niedrigen Shear-Bedingungen. 4 Platelet P-Selektin interagiert mit Neutrophilen durch P-Selektin Glykoprotein Ligand-1 (PSGL-1), dadurch Induzieren Aktivierung der neutrophilen β2 Integrinen und feste Haftung zwischen zwei Zelltypen. Trotz der Fortschritte in der in vitro-Experimenten, bei denen heterotypische Blutplättchen neutrophilen Wechselwirkungen in Vollblut oder isolierte Zellen, 6,7 ermittelt werden diese Studien nicht manipulieren kann Oxidationsmittel Stressbedingungen bei Gefäßerkrankungen. In diesem Bericht mit fluoreszenzmarkierten, spezifische Antikörper gegen eine Maus Blutplättchen und Neutrophilen-Marker beschreiben wir eine detaillierte Protokoll zu intravitalmikroskopische heterotypische Wechselwirkungen von Blutplättchen und Neutrophilen auf der aktivierten Endothelzellen während TNF-α-induzierte Entzündung oder nach laserinduzierten überwachen Verletzungen M. cremaster Mikrogefäßen von lebenden Mäusen.
Protokoll
Ein. Vorbereitung der Intravital Mikroskop (Abbildung 1A)
- Bereiten Superfusion Puffer (125 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2 und 17 mM NaHCO 3, pH 7,4).
- Schalten Sie eine Durchblutungsstörung Wasserbad auf eine Temperatur von Puffer und eine thermo-kontrollierten Decke bei 37 ° C zu halten Belüften mit Stickstoffgas Puffer (5% CO 2 mit Stickstoff ausgeglichen).
- Schalten Sie den Mikroskop-System (Sutter Lambda DG-4 High-Speed-Wellenlänge Wechsler, Arbeitsplatzrechner, Olympus BX61W Mikroskop, MPC-200 Multi-Manipulator, ROE-200 Phase-Controller, High-Speed-Kamera, und Verstärker). ....
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Ergebnisse
Verwendung einer detaillierten Intravitalmikroskopie Analyse waren heterotypische Blutplättchen neutrophilen Wechselwirkungen auf der aktivierten Endothel visualisiert durch Infusion von fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen ein Plättchen (CD42c) oder Neutrophilen Marker (Gr-1) in einen Live-Mäusen.
In einem Modell der TNF-α-induzierte venulären Entzündungen, wurden die meisten Rollen Neutrophilen stabil an das Endothel vermutlich durch Interaktion von aktivierten β2 Integrine mit ICAM-1 e.......
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Diskussion
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für Echtzeit-Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie um heterotypische Thrombozyten-Neutrophilen-Interaktionen auf dem aktivierten Endothel während der vaskulären Entzündung und Thrombose zu visualisieren. Zuvor ähnliche fluoreszenzmikroskopische Ansätze gemeldet wurden, um die molekularen Mechanismen der Thrombusbildung und vaskuläre Entzündungen zu studieren. 8,12 Da die heterotypische Zell-Zell-Interaktion könnte für Vaso-Okklusion wichtig, an der verletzten Stell.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanzielles Interesse.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus National Institutes of Health (P30 HL101302 und RO1 HL109439 um JC) und der American Heart Association (SDG 5270005 JC) unterstützt. A. Barazia wurde von einem T32HL007829 NIH Ausbildungsförderung unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| CaCl2 2H2 | O Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | 144-55-8 | |
| 0,9 % NaCl Kochsalzlösung | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Ketamin | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazin | Lloyd | ||
| Intramedizinische Schläuche (PE 90) | BD Diagnostik | 427421 | |
| Intramedizinische Schläuche (PE 10) | BD Diagnostik | 427401 | |
| murines TNF-& alpha; | Forschung & Forschung D Systems | 410-MT | |
| Dylight 488- markierter Anti-Maus-Antikörper für Ratten | Emfret Analytics | X488 | |
| Alexa Fluor 647-konjugierter Anti-Maus-Antikörper Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) BioLegend | 108418 | ||
| NESLAB EX Wasserbad/Zirkulator | Thermo-Scientific | ||
| Olympus BX61W Mikroskop | Olympus | ||
| TH4-100 Leistung | Olympus | ||
| Lambda DG-4 | Sutter | ||
| MPC-200 Multimanipulator | Sutter | ||
| R–-200 Stage Controller | Sutter | ||
| C9300 Hochgeschwindigkeitskamera | Hamamatsu | ||
| Intensifier | Video Scope International | ||
| Ablation Laser | Photonische Instrumente, Inc. | ||
| SlideBook 5.0 | in der intelligenten Bildgebung |
Referenzen
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Nieswandt, B., Kleinschnitz, C., Stoll, G. Ischaemic stroke: a thrombo-inflammatory disease. J. Physiol. 589, 4115-4123 (2011).
- Yang, J., Furie, B. C., Furie, B.
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Nachdrucke und Genehmigungen
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