Isolierung von Liquor aus Rodent Embryonen für die Verwendung mit Dissected Cerebral Kortikale Explantate

Zusammenfassung

Kammerunterstützungsgerät Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) taucht die neuroepithelialen und zerebralen Kortex Vorläuferzellen während der frühen Entwicklung des Gehirns im Embryo. Hier beschreiben wir die Methode entwickelt, um ventrikuläre CSF aus Nagetier Embryonen unterschiedlichen Alters zu isolieren, um seine biologische Funktion untersucht. Darüber hinaus zeigen wir unsere zerebralen Kortex Explantat Dissektion und Kultur Technik, die für Explantat Wachstum ermöglicht mit minimalem Volumen von Kulturmedium oder CSF.

Zusammenfassung

Das GFK ist eine komplexe Flüssigkeit mit einer sich dynamisch ändernden Proteom während der Entwicklung und im Erwachsenenalter. Während der embryonalen Entwicklung unterscheidet der naszierenden CSF aus dem Fruchtwasser bei Schließen des vorderen Neuralrohr. CSF Volumen steigt dann über den folgenden Tagen als neuroepithelialen Vorläuferzellen entlang der Herzkammern und die Plexus generate CSF. Die embryonalen CSF Kontakte der apikale, ventrikuläre Oberfläche der neuralen Stammzellen des sich entwickelnden Gehirns und des Rückenmarks. CSF bietet entscheidende Flüssigkeitsdruck für den Ausbau des sich entwickelnden Gehirns und vertreibt wichtige wachstumsfördernde Faktoren auf neurale Vorläuferzellen in einem zeitlich-spezifische Weise. Um die Funktion der CSF zu untersuchen, ist es wichtig, reine Proben von embryonalen CSF ohne Kontamination aus Blut oder der Entwicklungswalze telencephalen Gewebe isolieren. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um relativ reine Proben von ventrikulären embryonalen CSF, die verwendet werden kann für isoliereneine Vielzahl von experimentellen Untersuchungen, wie Massenspektrometrie, Protein-Elektrophorese und der Zelle und primären Explantatkultur. Wir zeigen, wie zu sezieren und Kultur kortikalen Explantate auf porösen Polycarbonatmembranen um die Entwicklung kortikalen Gewebe mit reduzierten Volumina von Medien oder CSF wachsen. Mit diesem Verfahren kann unter Verwendung von Experimenten CSF aus unterschiedlichen Alters oder Bedingungen, um die biologische Aktivität des CSF Proteom auf Zielzellen zu untersuchen.

Einleitung

Das GFK ist eine komplexe Flüssigkeit, die die Entwicklung Neuroepithel ^1-6 badet und liefert wesentliche Druck ⁷ und wachstumsfördernde Signale für das sich entwickelnde Gehirn ^8-12. Die CSF im Laufe der Entwicklung des Gehirns zu untersuchen, haben wir Techniken Ventrikelliquor aus Entwicklungs Ratte oder Maus-Embryonen isolieren während verschiedenen Stadien der Entwicklung ^6,9. Bisherige Methoden der Isolation aufgenommen mit einem Glas Mikro-Nadel und Isolierung der CSF mit einem Mikro-Injektor ^1,2. Unsere Methode nutzt ein Glas Mikro-Kapillarpipette deren Spitze wurde gezogen, um eine ultrafeine für verbess....

Protokoll

Ein. Embryo Isolation / der Zubereitung

Diese Technik kann für Maus oder Ratte verwendet werden. In diesem Protokoll demonstrieren wir die CSF Sammlung Technik und zerebralen Kortex Explantat Dissektion mit embryonalen Gehirn. Wir werden auf alle wichtige Unterschiede für Ratten im Vergleich zu Mäusen, die im Rahmen der allgemeinen Techniken existieren kommentieren. Für die embryonalen Alter Staging-System, ist E1 als der Tag des Steckers für Ratten klassifiziert und E0.5 wird als Tag des Steckers für Mäuse eingestuft.

1. Bereiten Sie eine Mikrodissektion Gericht mit Sylgard Silikon-Elastomer. Sylgard 184 Silikon-Elastomer wird al....

Ergebnisse

Die CSF Sammlung sollte ergeben einen klaren, transparenten Flüssigkeit. Es sollte keine Anzeichen von Kontamination aus Blut sein, wie durch einen rot oder gelb gefärbten Flüssigkeit in der Ansaug und in der Eppendorf-Röhrchen nachgewiesen. Es sollte auch keine Hinweise auf Gewebe in dem Aspirat und Eppendorf Rohr sein. Wenn der CSF zentrifugiert wird, kann man auch die für das CSF mikroskopisch um sicherzustellen, dass es keine Kontamination. Bei Anzeichen von Verunreinigungen sind, sollte die CSF verworfen werden. Vo.......

Diskussion

Das beschriebene Verfahren zur Ventrikelliquor Kollektion relativ reine Proben von embryonalen CSF mit stabilen Protein-Zusammensetzung und konsequente Aktivität in einer Reihe von zellulären Assays ⁹ ergab. Mit einer guten Sammlung Technik und Wurfgröße von zehn E14.5 Mäusen, kann man erwarten, 10-15 ul CSF zu sammeln und aus einem Wurf von E16 Ratten, kann man erwarten, dass etwa 50-90 ul CSF sammeln. Diese Sammlung Technik minimiert Kontamination von Blut und Gewebe, durch sorgfältige Beobachtung, Zentrifu.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenz / Material	Firma	Catalog Number	Kommentare
Wiretrop II Kapillarnadeln	Drummond Scientific	# 5-000-2020
Sylgard	Ellsworth Adhesives	Nr. 184 SIL ELAST Kit
Aspirator Tubusbaugruppe	Sigma	# A5177-5EA
Einwegfilter	Venturi oder örtlichen Apotheke	nicht verfügbar	Standard Zigarettenfilter
Roundstock opthalmic Messer (15 Grad stab Messer)	World Precision Instruments, Inc.	# 500250
35mm Glasboden Kulturschale	MatTek Corp	# P35G-1.5-14-C
Platin-Iridium-Draht	Tritech Forschung	# PT-9010-010-3FT
Nuclepore Track-Etch Membrane	Whatman	# 09-300-57
Hanks Balanced Salt Solution	Fisher Scientific	# SH30031.FS
Iridektomie Scissors	Fine Science Tools	# 15000-02