Eine einfache und zuverlässige Technik für die Visualisierung und Quantifizierung Atemwege Zilien Motilität und Zilien erzeugte Strömung mit der Maus Luftröhre beschrieben. Dieses Verfahren kann modifiziert werden, um zu bestimmen, wie eine Vielzahl von Faktoren Zilien Motilität beeinflussen, einschließlich pharmakologischer Wirkstoffe, genetische Faktoren, Umwelteinflüssen und / oder mechanische Faktoren wie Schleim zu laden.
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Methodenartikel
Ex-vivo-Verfahren für High Resolution Imaging von Cilia Motilität in Nagetier Atemwegsepithelien
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Ex-vivo-Imaging-Technik für Maus Atemwegsepithelien für die quantitative Analyse von beweglichen Zilien Funktion wichtig für Einblick in mukoziliäre Clearance-Funktion wurde eingerichtet. Frisch geerntete Maus Luftröhre wird in Längsrichtung durch den trachealis Muskel geschnitten und in einer flachen ummauerten Kammer auf einem Glasboden-Gericht. Die Luftröhre Probe wird entlang seiner Längsachse positioniert, um von der trachealis in Längsrichtung gewellt nehmen. Dies ermöglicht die Abbildung von Flimmerbewegung im Profil entlang der gesamten Länge Luftröhre. Videos mit 200 Bildern / sec werden unter Verwendung von Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie und eine Hochgeschwindigkeits-Digitalkamera der quantitativen Analyse der Cilienschlag Frequenz und Wellenform ciliary ermöglichen. Mit dem Zusatz von fluoreszierenden Kügelchen während der Bildgebung, Zilien erzeugten Fluidstroms bestimmt werden kann. Das Protokoll Zeit erstreckt sich über etwa 30 min mit 5 min für Kammer Vorbereitung, 5-10 min für ProbeMontage und 10-15 min für Videomikroskopie.
Einleitung
Analyse von beweglichen Zilien Funktion im Atemwegsepithelien ist experimentell wichtig für die Aufklärung der genetischen und umweltbedingten Faktoren, die mukoziliäre Clearance und pulmonale Gesundheit 1 beeinflussen können. Das einfache Protokoll für die Bildgebung der Maus Atemwegsepithelien entwickelt bietet eine effiziente Methode, um Atemwege Zilien Motilität in Mutanten und Knockout Mausmodelle verhören und erfordern nur Grundkenntnisse in Maus Luftröhrengewebe Dissektion und ex-vivo-Bildgebung der Atemwege Zilien Motilität mit hoher Auflösung Videomikroskopie. Dieses Protokoll wurde gegründet und während eines großen Maus Mutagenese Bilds....
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Protokoll
1. Reagenzien-Setup
1.1 Dissection und Imaging Medium
Leibovitz L-15-Medium (L15) mit FBS (10%) und Penicillin-Streptomycin (100 Einheiten / ml Penicillin G-Natrium und 100 ug / ml Streptomycin Sulfat) ergänzt wird sowohl während der Ernte und Abbildung Luftröhre Proben verwendet.
2. Shallow Walled Kultur Chamber Assembly
Die Kammer zur Luftröhre Gewebe halten ist in Abbildung 1 dargestellt. Der Boden der Kammer ist der Glasboden 35 mm Kulturschale. Die obere und die Seite der Kammer wird, indem ein kleines Stück 0,3 mm dicken Silikon Folie üb....
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Ergebnisse
Steuerung Atemwege Zilien muss deutlich sichtbar sein und gesehen in einer koordinierten Art und Weise (Supplemental Film 1; Filmwiedergabe auf 15% verlangsamt Echtzeit) zu schlagen, mit spürbarer Strömung in Richtung der Zilien schlagen (Supplemental Movie 2; Filmwiedergabe ist 100% real time). Die Quantifizierung der Zilien Filme sollten zu Ergebnissen führen ähnlich wie in Abbildung 3 zu sehen. Sammlung von High-Speed-DIC Filme ermöglicht die Quantifizierung der Cili.......
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Diskussion
Messung der Zilien Überlagerungsfrequenz (CBF) ist relativ einfach mit hoher Leistung Mikroskop-Objektive und schnelle Bildaufnahme Hardware 13,15, und erklärt, warum CBF-Messungen die Grundlage der meisten Studien untersuchen mukoziliäre Clearance bei Gesundheit und Krankheit bilden. Doch während CBF-Messung ist für das Verständnis mukoziliäre Clearance, Messung der CBF allein wesentlichen ignoriert die zugrunde liegende Bedeutung sowohl ciliary erzeugt Strom und Cilienschlag Wellenform, die beide mehr schwe.......
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Offenlegungen
Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Das Projekt wurde vom NIH U01HL098180 vom National Heart, Lung, and Blood Institute unterstützt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt den offiziellen Standpunkt des National Heart, Lung, and Blood Institute oder die National Institutes of Health
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Leibovitz' s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | Kein Phenolrot |
| Fötales Rinderserum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x feine Pinzette | Roboz | RS-4976 | |
| Präparierschere | Roboz | RS-5676 | |
| Mikrodissektionschere | Roboz | RS-5620 | |
| Skalpell | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 Pipettierer | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 Spitzen | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm runde Glasabdeckfolien | Fisher Scientific | 430588 | |
| 35 mm Kulturschalen aus Kunststoff | Corning | 430588 | |
| 35 mm Kulturschalen mit Glasboden | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silikonfolie 0,012" (0,3 mm) dick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0,20 μ m Durchmesser Fluoresbrite YG Carboxylate Mikrosphären | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverses Mikroskop, mit 100x Ölobjektiv und DIC-Filtern | Lecia | DMIRE2 | Marke ist nicht kritisch. |
| 100-Watt-Quecksilberlampe, epifluoreszierende FITC-Anregungs-/Emissionsfilter | Lecia | Brand ist nicht kritisch. | |
| Mikroskoptisch Inkubator | Lecia | 11521749 | Nicht erforderlich, wenn die Bildgebung von Zilien bei Raumtemperatur |
| Hochgeschwindigkeitskamera Hellfeld | Vision Research | Phantom v4.2 | Marke ist nicht kritisch. Muss schneller als 125 fps |
| sein Hochgeschwindigkeits-Leuchtstofflampe | Hamamatsu | C9100-12 | Marke ist nicht kritisch. Muss schneller als 10 fps |
| sein Filmanalysesoftware | National Institutes of Health | ImageJ mit MtrackJ-Plugin |
Referenzen
- Stannard, W., O'Callaghan, C. Ciliary function and the role of cilia in clearance. J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).
- Francis, R. J., et al. The initiation and maturation of cilia generated flow in....
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Nachdrucke und Genehmigungen
