Cokultur Analyse der extrazellulären Protein Wechselwirkungen, die Insulinsekretion durch Betazellen des Pankreas

Zusammenfassung

Transzelluläre Protein-Interaktionen sind wichtige Determinanten der Pankreas-Beta-Zell-Funktion. Hier ist eine Methode der detaillierten angepasste aus einer Co-Kultur-Modell-Synaptogenese zur Untersuchung, wie bestimmte Transmembranproteine ​​Insulinsekretion beeinflussen. HEK293 Zellen exprimieren Proteine ​​von Interesse; Beta-Zellen brauchen nicht transfiziert oder anderweitig direkt gestört.

Zusammenfassung

Wechselwirkungen zwischen Zelloberflächen-Proteine ​​zur Koordination der Funktion der benachbarten Zellen. Betazellen der Bauchspeicheldrüse zusammen innerhalb Pankreasinseln gruppierten und handeln in einer koordinierten Art und Weise, um Glukose-Homöostase aufrecht zu erhalten. Es wird zunehmend deutlich, dass Wechselwirkungen zwischen Transmembranproteine ​​auf den Oberflächen der angrenzenden Beta-Zellen wichtige Determinanten der Beta-Zell-Funktion sind.

Aufklärung der Rolle der insbesondere transzellulären Wechselwirkungen durch Knockdown, Knockout oder Überexpression Studien in kultivierten Beta-Zellen oder in vivo erfordert direkte Störung der mRNA und Protein-Expression, möglicherweise beeinflussen beta-Zelle Gesundheit und / oder die Funktion in einer Weise, die Analysen über die Auswirkungen verwechseln könnte von spezifischen Wechselwirkungen. Diese Ansätze auch ändern Niveaus der intrazellulären Domänen der Zielproteine ​​und kann Auswirkungen auf Wechselwirkungen zwischen Proteinen innerhalb der gleichen Zelle Membran zu verhindern, dass disunterschieden von den Auswirkungen der transzellulären Wechselwirkungen.

Hier wird ein Verfahren zur Bestimmung der Wirkung von spezifischen transzellulären Wechselwirkungen auf die Insulin-sezernierenden Kapazität und Reaktionsfähigkeit der Beta-Zellen präsentiert wird. Dieses Verfahren ist für Beta-Zell-Linien, wie INS-1-Zellen, und distanzierte primären Beta-Zellen. Es basiert auf Kokultur Modelle von Neurobiologen, die, dass die Exposition von kultivierten Neuronen spezifische neuronale Proteine ​​auf HEK293 (oder COS) Zellschichten identifizierten Proteine ​​wichtig für den Antrieb Synapsenbildung Ausdruck gefunden entwickelt wurde. Angesichts der Parallelen zwischen der sekretorischen Maschinerie der neuronalen Synapsen und der Beta-Zellen, begründeten wir, dass beta-Zelle funktionelle Reifung durch ähnliche transzellulären Wechselwirkungen könnte angetrieben werden. Wir entwickelten ein System, in dem Beta-Zellen auf einer Schicht aus HEK293 Zellen, die ein Protein von Interesse kultiviert werden. In diesem Modell wird das Beta-Zell-Zytoplasma unberührt, während extrazellulären Protein-Protein interactions manipuliert werden. Obwohl wir hier in erster Linie auf Studien von Glukose-stimulierte Insulinsekretion zu konzentrieren, können andere Prozesse analysiert werden, z. B. Veränderungen in der Genexpression durch Immunoblot oder qPCR bestimmt.

Einleitung

Wir beschreiben hier eine Methode, um Untersuchungen, wie die extrazellulären Domänen spezifischer Transmembranproteine ​​beeinflussen Insulinsekretion zu erleichtern. Die Methode Sonden die Auswirkungen der Interaktionen des Proteins von Interesse mit Proteinen (oder möglicherweise andere Moleküle) auf der pankreatischen beta-Zelloberfläche. Das Verfahren ermöglicht Untersuchungen, wie Zelloberflächen-Proteine ​​durch Beta-Zellen oder anderen benachbarten Zellen (zB endothelialen Zellen, Neuronen, Bauchspeicheldrüsen-alpha-Zellen) exprimiert beeinflussen Betazellfunktion durch transzellulären Wechselwirkungen (zB durch Wechselwirkung mit Interaktionspartner auf der Oberfläche des benachbarten Beta-Zellen).

Die zelluläre Plasmamembran enthält eine komplexe Anordnung von struktureller und funktioneller Proteine, die als Brücken an die extrazelluläre Umgebung. Durch Bildung von transzellulären Verbindungen oder durch Einleitung von Kunststoff-Signalwege können Wechselwirkungen zwischen Zelloberflächen-Proteine ​​helfen, koordinieren dieFunktion von benachbarten Zellen. Betazellen des Pankreas sind zusammen in den Langerhans-Inseln gruppierten und handeln in einer koordinierten Art und Weise, um Glukose-Homöostase ¹ aufrecht zu erhalten. Wie soeben bekannt wurde, zum Beispiel durch die Bedeutung der extrazellulären EphA-EphrinA und neuroligin-2-Wechselwirkungen in der Regulation des Glukose-stimulierte Insulinsekretion, wird es immer klarer, dass eine erhöhte Kenntnis der auftretenden Wechselwirkungen zwischen extrazellulären Proteine ​​auf den Oberflächen von benachbarten Beta-Zellen wird von großer Bedeutung für die Gewinnung ein umfassendes Verständnis der Insulinsekretion der Beta-Zellen funktionelle Reifung und der Aufrechterhaltung der Glukose-Homöostase ^1-3 sein. Das Ziel der hier beschriebenen Methode ist es, Untersuchungen der Auswirkungen auf die Beta-Zell-Funktion transzellulären Wechselwirkungen mit spezifischen Transmembran oder anderweitig-Zell-Oberflächen-assoziierten Proteinen ermöglichen. Durch Co-Kultivierung Beta-Zellen mit HEK293 Zellen mit unterschiedlichen Ausdruck Konstrukten transfiziert, die Auswirkungen auf die beta-Zell-Funktion verschiedener Zelloberflächen-Proteine ​​oder mutierten Varianten davon können effizient sondiert. Dies wird ohne transfektieren die Beta-Zellen selbst zu erreichen.

Aufklärung der Rolle der insbesondere transzellulären Wechselwirkungen durch Knockdown, Knockout oder Überexpression Studien in kultivierten Beta-Zellen oder in vivo erfordert direkte Störung der Beta-Zell-mRNA und Protein-Expression, möglicherweise beeinflussen Betazellen Gesundheit und / oder die Funktion in einer Weise, die Analysen verwechseln könnte die Auswirkungen der extrazellulären Wechselwirkungen. Diese nähert sich auch ändern Niveaus der intrazellulären Domänen der Zielproteine ​​und ferner nicht erlauben Effekte aufgrund von Wechselwirkungen zwischen Proteinen, die am oder in der gleichen Zelle unter den Auswirkungen von Wechselwirkungen transzellulären unterscheiden. Hier ist ein Verfahren zur Bestimmung der Wirkung von spezifischen transzellulären Wechselwirkungen auf die Insulin-sezernierenden Kapazität und Reaktionsfähigkeit der Betazellen Artbezibed. Dieses Verfahren ist für insulinproduzierenden ß-Zelllinien, wie INS-1-Zellen ⁴ und dissoziierte primären Nagetier oder humanen beta-Zellen. Es basiert auf Kokultur Modelle von Neurobiologen, die, dass die Exposition von kultivierten Neuronen spezifische neuronale Proteine ​​auf HEK293 (oder COS) Zellschichten exprimiert gefunden entwickelten Proteine ​​identifizieren konnte, die Fahrt Synapsenbildung ^5,6. Angesichts der Parallelen zwischen der sekretorischen Maschinerie der neuronalen Synapsen und der Beta-Zellen, begründeten wir, dass Beta-Zell-Funktion und funktionelle Reifung durch ähnliche transzellulären Wechselwirkungen ^7-9 könnte angetrieben werden. Um diese Wechselwirkungen untersuchen, haben wir das hier beschriebene System in der Beta-Zellen auf einer Schicht aus HEK293 Zellen, die ein Protein von Interesse ¹⁰ sind co-kultiviert. Dieses System ermöglicht die Beta-Zell-Zytoplasma unangetastet bleiben, während extrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen manipuliert werden.

Protokoll

1. Transfektion von HEK293 Schicht

1. Bereiten HEK293 Zellmedium durch Zugabe zu 500 ml Flaschen DMEM (mit 4,5 g / ml Glucose und Phenolrot und ohne Glutamin): 50 ml FBS, 5 ml 100X Penicillin / Streptomycin-Lösung, 5 ml 100x L-Glutamin-Lösung und 500 ul Amphotericin B.
2. Platte aus HEK293-Zellen in einer 24-Well-Platte unter Verwendung von 0,5 ml pro Vertiefung HEK293 Medien. Stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig auf die Unterseite der Platte verteilt.
3. Wenn HEK293-Zellen 100% Konfluenz erreichen Transfektion mit 0,8 ug Plasmid kodiert für das Protein von Interesse (eingesetzt in einem Säugetier-Expressionsvektor) und 2 ul Lipofectamin 2000 gemäß der Lipofectamin-Protokoll. Wir haben entschieden, den pcDNA 3.3 Rückgrat für die Expression in Säugerzellen zu verwenden.
4. Optional kann nach 6 h Inkubation Austausch die Transfektion Medien beschrieben in der Lipofectamine Protokoll mit normalen HEK293 Medien.
5. Um die Expression des transfizierten Prote bewertenin, kann ein Teil der transfizierten Gewebekulturvertiefungen für Immunfluoreszenz Nachweis des exprimierten Proteins oder Western-Blot-Analyse von Protein-Expression unter Verwendung von Standard-Techniken verwendet werden.

2. Optional Fixation von HEK293-Zellen transfizierten Protein

HEK293 Zellen schonend fixiert werden, um Kokultur in Medien, die schädlich für lebende HEK293 Zellen (z. B. Schritt 3.9 unten) oder um die effiziente Vorbereitung im Vorfeld von Platten für mehrere Experimente auf einmal erlauben (siehe auch Diskussion) erleichtern könnten.

1. Führen Pilotstudien um den zeitlichen Verlauf der Expression des Proteins in den HEK293-Zellen zu bestimmen.
2. Nach Transfektion der HEK293 Zellschicht, saugen die Medien aus den Zellen bei der Post-Transfektion Zeitpunkt mit höchster Expression assoziiert. Wenn dies geschieht innerhalb der ersten 24 Stunden, nicht bis 24 Stunden nach der Transfektion anzusaugen.
3. Waschen HEK293 Zellen vorsichtig mit D-PBS fügen Sie dann 500 ul 4% Paraformaldehyd (PFA) und Inkubation bei RT für 30 min. (Zu 4% PFA-Lösung zu machen, mit 16% igen Lösung in 1X PBS beginnen und verdünnen 1:4 1X PBS.)
4. Mit einer sterilen PBS, vorsichtig waschen die Zellen 3 mal in PBS und Inkubation O / N bei 4 ° C.
5. Waschen der Zellen 3 mal mit sterilem PBS, dann fügen PBS und lassen bei 4 ° C bis zur Verwendung (maximale Lagerzeit je nach Protein exprimiert. Wir speichern HEK293 Zellen transfiziert, um neuroligin Isoformen für bis zu 2 Wochen ausdrücken, ohne wesentliche Änderungen in beobachteten Effekte auf die Insulinsekretion).

3. Co-Kultivierung von INS-1 Beta-Zellen mit HEK293 Zellen

1. Bereiten INS-1-Medien durch Zugabe von 500 ml RPMI 1640 (mit Glucose und Phenolrot und ohne Glutamin): 50 ml FBS, 5 ml 100X Penicillin / Streptomycin, 5 ml 100X L-Glutamin-Lösung, 5 ml Natriumpyruvat, 500 ul Amphotericin B, 500 ul beta-Mercaptoethanol (dies ist fast identisch mit dem medium normalerweise für primäre Kultur Insel mit Ausnahme der Zugabe von beta-Mercaptoethanol) eingesetzt.
2. Benutzen Sie die Cell-Stripperin (oder einem anderen nicht-enzymatischen Zelle Entferner), Ernte INS-1-Zellen bei etwa 70-80% Konfluenz aus dem Boden einer T75 Kulturflasche. Jeder Kolben wird grob genug Zellen für 48 Brunnen liefern.
3. Nach Stillstand Zellen in der Zentrifuge für 3 min bei 1200 rpm in einer 50/50 Mischung aus INS-1 und HEK Medien resuspendieren. Für eine 70-80% konfluenten Flasche INS-1-Zellen, in etwa 25 ml Mischtechnik resuspendieren.
4. Bei Verwendung von HEK293-Zellen, die in Paraformaldehyd wurden anstelle von lebenden HEK293 Zellen fixiert, resuspendieren INS-1-Zellen in 100% INS-1-Media anstatt Mischtechnik.
5. Verwendung einer 10 ml Pipette zu entfernen, die Zellen aus dem Pellet, um eine homogene Zellsuspension zu machen.
6. Saugen Sie die Medien auf den HEK293 Zellen zu entfernen.
7. Mit einer Pipette p1000, sanft hinzufügen 500 ul von INS-1 Zell-Suspension auf die HEK Zellschicht an den Seiten of den Brunnen. Nach jeweils 6 Vertiefungen, verwenden Sie eine 10 ml Pipette, um die INS-1-Zellen wieder suspendieren, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten. Die allgemeine Regelung der Kokultur Set-up ist in Abbildung 1 dargestellt.
8. Inkubieren Sie die Zellen für 24-48 h, je nach dem experimentellen Protokoll.
9. Wenn mehr als 48 Stunden Kokultur Zeitraum erforderlich ist, verwenden optionale Schritte in Abschnitt 2 die HEK293 Zellen zu fixieren.
10. Bei der Verwendung von primären dissoziiert Nagetier oder menschlichen Inselchen [siehe zB vor Protokolle in JoVE ^11-15], sicherzustellen, dass eine geeignete Medien wie RPMI mit 5 ml Penicillin / Streptomycin, 5 ml L-Glut, 0,5 ml Amphotericin-B wird anstelle von INS-1-Medien. Obwohl eine dissoziierte Inselzellen in einer Platte mit 24 Vertiefungen verwendet werden können, in der Praxis wegen der großen Anzahl von Inseln möglicherweise benötigt, ist es empfehlenswert, dass die Prüfung der Skalierung gegeben werden auf eine 48-Well-Platte (erfordern weniger Inselzellen pro Vertiefung). Auf einer 48-Well-Platte, fügen Sie etwa 100 Inseln im Wert von Dissoziationted Zellen pro Platte zu starten. Je nach Wirksamkeit der Dissoziation und das Verfahren verwendet wird, kann weniger Inseln erforderlich.

4. Glucose Insulinsekretion

1. Vorinkubieren Zellen in 250 ul 2,5 mM Glukose in KRB (Krebs-Ringer Bicarbonat-Puffer) für mindestens 1 Stunde. Um vorinkubieren, entfernen Kokultur mittel-und unmittelbar mit KRB ersetzen. Dieser Austausch sollte man gut gemacht werden zu einem Zeitpunkt, um die Exposition der INS-1-Zellen zu Umweltinformationen Sauerstoff zu minimieren. Saugen Sie mit einer Hand, während Pipettieren der niedrig (2,5 mM) Glucose KRB mit den anderen.
2. Austausch Vorinkubation KRB bis 250 ul von entweder 2,5 mM oder 20 mM Glukose in KRB-Puffer ein und zu einem Zeitpunkt.
3. Wenn die für den spezifischen Experiment können zusätzliche secretagogues wie 100 uM IBMX zugegeben, um eine robustere stimulierte Insulinsekretion Reaktion zu erzeugen. Dissoziierte primären Beta-Inselzellen insbesondere sind schlecht auf erhöhte Glucosekonzentrationen Alone, so hier besonders Zugabe von IBMX oder andere Sekretagoga sollte ^16,17 in Betracht gezogen werden.
4. Nach 1 Stunde Inkubation übertragen Medien in Röhrchen zentrifugieren und Spin 1.500 xg für 5 min.
5. Entfernen 200 ul des Überstandes und nutzen diese für die Analyse durch Insulin RIA oder ELISA.
6. Um Zelllysat herzustellen, werden 100 ul RIPA Lysepuffer (150 mM NaCl, 1,0% IGEPALCA-630 oder Nonidet P-40, 0,5% Natriumdesoxycholat, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0) mit Proteaseinhibitoren der Platte sofort nach dem Entfernen von Medien und Inkubation bei 4 ° C für 20 min.
7. Spin down Lysat für 15 min bei 10.000 xg und entfernen 50 ul Überstand zur Analyse durch Insulin RIA oder ELISA.

Ergebnisse

Mit dem hier beschriebenen Verfahren haben wir die Wirkung von verschiedenen Varianten des Proteins neuroligin auf die Insulinsekretion getestet. Dies ergänzt unsere veröffentlichte Arbeit untersucht die Wirkung von neuroligin-2 auf Beta-Zell-Funktion ^10. Abbildung 2, zum Beispiel, stellt Ergebnisse von Cokultivierung INS-1 beta-Zellen mit HEK293-Zellen transfiziert, um einen Ausdruck zu erhalten neuroligin Isoform hier bezeichnet als NL- X. Dieses Experiment wurde entworfen, um die Hypothese...

Diskussion

Die Kokultur hier beschriebene Verfahren bietet einen effektiven Weg, um die physiologische Bedeutung der spezifischen Beta-Zell-Oberfläche, Transmembranproteine ​​bestimmen und speziell ihrer extrazellulären Domänen. Durch Kultivierung Betazellen oder Insulinomazellen (wie die INS-1-Zellen verwendet hier) in Kontakt mit HEK293 Zellen, die ein Protein von Interesse auf der Zelloberfläche kann Experimente entwickelt, um die Auswirkungen der extrazellulären Protein-Protein-Wechselwirkungen stören, ohne direkt zu bestimmen...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
pcDNA 3.3 Vektor/Rückgrat	Invitrogen	K830001
Lipofectamine 2000	Invitrogen	18324012
DMEM	Mediatech	45001-312
Pen/Streptokokken-Lösung	Mediatech	45001-652-1
Amphotericin B Mediatech		45001-808-1/30
RPMI-1640	Mediatech	45001-404
D-PBS	Mediatech	45001-434
Natriumpyruvat	Mediatech	45001-710-1
2-Mercapt– thanol	Invitrogen	21985023
Zellstripper	Mediatech	45000-668
T75 Kolben	BD	1368065
16% Paraformaldehyd	Elektronenmikroskopie Sciences	50980487
10x PBS	Mediatech	45001-130
Fötales Rinderserum	Mediatech	MT35010CV
IBMX	Sigma	I5879-100MG
RIPA Lysepuffer	Sigma	R0278