Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Seeds

Zusammenfassung

Wir berichten über eine effiziente und einfache Methode, um Embryonen in frühen Stadien der Entwicklung Isolat aus Arabidopsis thaliana Samen. Bis zu 40 Embryonen in 1 Stunde bis 4 Stunden isoliert werden, abhängig von der Downstream-Anwendungen. Das Verfahren eignet sich für die Transkriptom-, DNA-Methylierung, die Expression des Reportergens, Immunfärbung und Fluoreszenz In situ Hybridisierung analysiert.

Zusammenfassung

In Blütenpflanzen, entwickelt der Embryo innerhalb einer nährenden Gewebe - das Endosperm - von den mütterlichen Saatgut Integumente (oder Samenschale) umgeben ist. Als Folge wird die Isolierung von pflanzlichen Embryonen in frühen Stadien (1 Zelle Kugelsternhaufen Stufe) technisch anspruchsvolle aufgrund ihrer relativen Unzugänglichkeit. Effiziente manuelle Zerlegung in frühen Stadien ist stark durch die geringe Größe der jungen Arabidopsis Samen und die Haftfähigkeit des Embryos in die umliegenden Gewebe beeinträchtigt. Hier beschreiben wir eine Methode, die die effiziente Isolierung von jungen Arabidopsis Embryonen ermöglicht, wodurch bis zu 40 Embryonen in 1 Stunde bis 4 Stunden, abhängig von der nachgeschalteten Anwendung. Die Embryonen werden in die Isolation Puffer durch leichtes Quetschen 250-750 Samen mit einer Kunststoff-Stößel in ein Eppendorf-Röhrchen veröffentlicht. Ein Glas entweder mit einem Standard-Labor-Pipette angebracht mikrokapillaren (über einen Gummischlauch) oder eine hydraulisch gesteuerte Mikroinjektor wird verwendet, um Embryonen aus Tröpfchen Ort zu sammelnd auf einer Multi-Well-Folie auf einem invertierten Lichtmikroskops. Die technischen Fähigkeiten erforderlich sind einfach und leicht übertragbar, und die grundlegende Einrichtung erfordert keine teure Ausrüstung. Erhaltene Embryonen sind geeignet für eine Vielzahl von Downstream-Anwendungen wie RT-PCR, RNA-Sequenzierung, DNA-Methylierungsanalyse, Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH), Immunfärbung und Reportergen-Assays.

Einleitung

Der Embryo von Blütenpflanzen wird durch das Endosperm, ein Nährgewebe von einer zweiten Düngung Veranstaltung abgeleitet umgeben. Sowohl Embryo und Endosperm durch mehrere Zellschichten der Samenschale umgeben. Gemeinsam bilden diese Gewebe einen Samen, der in der Frucht zu entwickeln. So werden Gewebe-und Zell-spezifische Analysen von Arabidopsis Embryonen stark beeinträchtigt durch ihre Unzugänglichkeit. Dennoch sind Embryonen bei den späten Kugelsternhaufen oder späteren Phasen relativ gut zugänglich manuelle Dissektion mit feinen Wolfram Nadeln unter dem Stereomikroskop, oder durch leichten Druck auf das Saatgut mit einer Pinzette, um sie zu extrahieren....

Protokoll

Das Verfahren ist in dem Flussdiagramm in 1 gezeigt zusammengefasst. Die Mikrokapillaren und die instrumentale Setup sind in Abbildung 2 und Abbildung 3 dargestellt und typische Schritte Embryo Isolierung sind in Abbildung 4 dargestellt.

1. Material-und Buffer Vorbereitung

1.1 Silicon Beschichtung von Glas Mikrokapillaren

1. Legen Sie die Mikrokapillaren in einem 15 ml Falcon-Röhrchen mit ~ 5 ml Sigmacote (Sigma) und invertieren mehrmals.
2. Entfernen Sie die Lösung, platzieren Sie den Falcon Röhrchen mit der Kapillaren in einer Al....

Ergebnisse

Unsere Embryo Isolation Verfahren (Abbildung 1) ermöglicht die Isolierung von bis zu 40 Embryonen in 4 Stunden, wenn Waschungen durchgeführt werden, z. B. für die molekulare Anwendungen oder in weniger als einer Stunde, wenn Wäschen weggelassen werden, zB für die zytologische Anwendungen. Abbildung 2 zeigt hohe und niedrige Qualität mikrokapillaren Tipps und Abbildung 3 zeigt den Aufbau des Embryos Isolierung Maschine. Abbildung 4 zeig.......

Diskussion

Wir entwickelten einen Embryo Isolation Protokoll, das eine schnelle, effektive ist, und kann leicht an andere Labors übertragen werden.

Die beschriebenen Geräte besteht hier aus einem inversen Mikroskop, einem Mikromanipulator, Glas-Mikrokapillaren ein vertikaler Faden Abzieher und Mikroinjektor (Abbildung 3A). Das Setup ist ähnlich dem für Einzeltier Zellisolation für Transkriptom-Analysen ¹⁷ beschrieben. Wir haben auch erfolgreich mit einem Basis-Setup, wo Glas.......

Materialien

EQUIPMENT

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
REAGENTS
Sigmacote	SIGMA	SL2-100 ml
RNAse OUT	Invitrogen (Lebenstechnologien)	10777-019
Erststrangpuffer	Invitrogen (Lebenstechnologien)	18064-022	enthalten im Superscript II-Paket
DTT	Invitrogen (Lebenstechnologien)	18064-022	enthalten in der Packung Superscript II
Rinderserumalbumin (BSA) 100x = 10 mg/ml	, New England Biolabs, Inc.		Verschiedene Anbieter sind ebenfalls erhältlich
: Dünnwandige Kapillaren 1,0 mm	World Precision Instruments	TW100F-4
DNA LoBind Röhrchen 0,5 ml	Vaudaux-Eppendorf	0030108.035
CellTricsΔ 30 μ m	PARTEC	04-0042-2316
5Vertiefungen Objektträger mit 10 mm Durchmesser	Elektronenmikroskopie	63421-10
Formaldehydlösung	Sigma-Aldrich	F1635
Superfrost Plus Objektträger	Thermo Fisher J1800AMNZ		Menzel-Glä ser
	Tris Amaresco	0497
EDTA	Applichem	A2937
Glycin	Fluka	50050
SDS Pellets	Roth	CN30.3
Micro Pestle	VWR	431-0094
Microfine Insulin Spritzen	BD	U-100
DEPC	Sigma-Aldrich	D5758
Ethanol	Schaurlau	ET00102500
Pinzette N5	Dumont	0108-5
Bioanalysator Pico Chip	Agilent Technologies	5067-1513<
Inverses Mikroskop	Nikon TMS (Japan),
Mikromanipulator	Leitz		Leica
Micomanipulator Post Mount LH1 Sonde	Leica Mikrosysteme	39430101	Andere Marke wird auch die Arbeit erledigen
Vertikaler Filamentabzieher	Sutter Instrument	P-20 Modell	Andere Modelle sind auch geeignet
Cell Tram vario	Vaudaux-Eppendorf	5176.000.033
Bioanalysator	Agilent Technologies	2100
Qubit Fluorometer	Invitrogen (Lebenstechnologien

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