Wir berichten über eine effiziente und einfache Methode, um Embryonen in frühen Stadien der Entwicklung Isolat aus Arabidopsis thaliana Samen. Bis zu 40 Embryonen in 1 Stunde bis 4 Stunden isoliert werden, abhängig von der Downstream-Anwendungen. Das Verfahren eignet sich für die Transkriptom-, DNA-Methylierung, die Expression des Reportergens, Immunfärbung und Fluoreszenz In situ Hybridisierung analysiert.
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Methodenartikel
Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In Blütenpflanzen, entwickelt der Embryo innerhalb einer nährenden Gewebe - das Endosperm - von den mütterlichen Saatgut Integumente (oder Samenschale) umgeben ist. Als Folge wird die Isolierung von pflanzlichen Embryonen in frühen Stadien (1 Zelle Kugelsternhaufen Stufe) technisch anspruchsvolle aufgrund ihrer relativen Unzugänglichkeit. Effiziente manuelle Zerlegung in frühen Stadien ist stark durch die geringe Größe der jungen Arabidopsis Samen und die Haftfähigkeit des Embryos in die umliegenden Gewebe beeinträchtigt. Hier beschreiben wir eine Methode, die die effiziente Isolierung von jungen Arabidopsis Embryonen ermöglicht, wodurch bis zu 40 Embryonen in 1 Stunde bis 4 Stunden, abhängig von der nachgeschalteten Anwendung. Die Embryonen werden in die Isolation Puffer durch leichtes Quetschen 250-750 Samen mit einer Kunststoff-Stößel in ein Eppendorf-Röhrchen veröffentlicht. Ein Glas entweder mit einem Standard-Labor-Pipette angebracht mikrokapillaren (über einen Gummischlauch) oder eine hydraulisch gesteuerte Mikroinjektor wird verwendet, um Embryonen aus Tröpfchen Ort zu sammelnd auf einer Multi-Well-Folie auf einem invertierten Lichtmikroskops. Die technischen Fähigkeiten erforderlich sind einfach und leicht übertragbar, und die grundlegende Einrichtung erfordert keine teure Ausrüstung. Erhaltene Embryonen sind geeignet für eine Vielzahl von Downstream-Anwendungen wie RT-PCR, RNA-Sequenzierung, DNA-Methylierungsanalyse, Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH), Immunfärbung und Reportergen-Assays.
Einleitung
Der Embryo von Blütenpflanzen wird durch das Endosperm, ein Nährgewebe von einer zweiten Düngung Veranstaltung abgeleitet umgeben. Sowohl Embryo und Endosperm durch mehrere Zellschichten der Samenschale umgeben. Gemeinsam bilden diese Gewebe einen Samen, der in der Frucht zu entwickeln. So werden Gewebe-und Zell-spezifische Analysen von Arabidopsis Embryonen stark beeinträchtigt durch ihre Unzugänglichkeit. Dennoch sind Embryonen bei den späten Kugelsternhaufen oder späteren Phasen relativ gut zugänglich manuelle Dissektion mit feinen Wolfram Nadeln unter dem Stereomikroskop, oder durch leichten Druck auf das Saatgut mit einer Pinzette, um sie zu extrahieren. Solche Techniken wurden erfolgreich für Transkriptom oder epigenome Profiling Analysen wie Microarray-Hybridisierung, Bisulfit-Sequenzierung oder RNA-Sequenzierung (zB 1-3) verwendet. Im Gegensatz dazu bleiben Studien von Embryonen bei der Zygote bis Anfang globulären Stadium technisch anspruchsvoll. Bisher haben nur wenige Studien reported Transkriptomanalysen auf junge Embryonen entweder mit Laser-Mikrodissektion (LCM) von embryonalen Geweben von festen Samen Abschnitten 4 oder manuelle Extraktion einzelner Embryonen aus Samen mit feinen Werkzeugen 5. Allerdings ist LCM Ausrüstung nicht allgemein verfügbar und manuelle Extraktion Embryos in frühen Stadien ist zeitaufwendig und erfordern hervorragende Präparation Fähigkeiten, die nicht leicht übertragbar. Neben genomweite Analysen, in situ Genexpressionsanalysen sind auch schwierig, auf junge, whole-mount Embryonen von Arabidopsis durchzuführen. In gewissem Umfang können junge Embryonen auf Objektträgern durch sanften Druck auf die Samen freigesetzt werden und für Reportergen-Assays oder Protein Erkennung durch Immunfärbung (siehe zum Beispiel 6,7). Diese Technik ist jedoch nicht erlaubt High-Throughput-Embryo Isolierung und behindern so quantitative Analysen.
Deshalb entwickelten wir eine effiziente und schnelle Protokollfür frühe Embryo isoliert von Arabidopsis Samen, die einfach zu installieren, leicht übertragbar und eignet sich für eine Vielzahl von nachgelagerten Anwendungen. Das Grundprinzip besteht darin, vorsichtig zerdrücken Samen - seziert von jungen Schoten in ein Eppendorf-Röhrchen mit einem Kunststoff-Stößel in einer geeigneten Isolierung Puffer. Der Extrakt wird in Tröpfchen auf einer Multi-Well-Objektträger aufgebracht und auf das Vorhandensein des freigesetzten Embryonen bei der gewünschten Stufe gescreent unter Verwendung eines invertierten Mikroskops. Die Embryonen werden gesammelt mit einem Glas zu einem Mikroinjektor oder einem Standard-Labor-Pipette angebracht mikrokapillaren. Für molekulare Anwendungen werden Embryonen zweimal durch wiederholte Freisetzung in Tropfen neue Isolierung Puffer vor der Übertragung auf den Zielpuffer in einem minimalen Volumen gewaschen. Für zytologische Anwendungen (Reporter-Assays, Immunfärbung FISH), können Waschschritte verzichtet werden.
Das Verfahren bietet mehrere Vorteile: (i) es ergibt 25-40 Embryonen in ~ 45 min für die zytologische Appfentlichungen oder in 3-4 Stunden für die molekulare Anwendungen (einschließlich der Waschschritte), (ii) es ermöglicht Isolierung spezifischer embryonalen Stadien, (iii) es ist leicht auf andere Personen übertragbar und Labors aufgrund seiner einfachen Setup, (iv) es erfordert erschwinglichen Geräten für die Grundeinstellungen, die zugänglich für Upgrades ist, und (v) wurde erfolgreich für verschiedene nachgelagerte Anwendungen wie RNA-Sequenzierung 8, Gen-spezifischen DNA-Methylierung Analyse 9, Reporter-Assays (10 und Raissig et al. verwendet, in prep.) und FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux unveröffentlicht, siehe Abbildung 5).
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Protokoll
Das Verfahren ist in dem Flussdiagramm in 1 gezeigt zusammengefasst. Die Mikrokapillaren und die instrumentale Setup sind in Abbildung 2 und Abbildung 3 dargestellt und typische Schritte Embryo Isolierung sind in Abbildung 4 dargestellt.
1. Material-und Buffer Vorbereitung
1.1 Silicon Beschichtung von Glas Mikrokapillaren
- Legen Sie die Mikrokapillaren in einem 15 ml Falcon-Röhrchen mit ~ 5 ml Sigmacote (Sigma) und invertieren mehrmals.
- Entfernen Sie die Lösung, platzieren Sie den Falcon Röhrchen mit der Kapillaren in einer Aluminiumfolie und backen Sie sie für 3 Stunden bei 60 ° C Lagerung bei Raumtemperatur.
1.2 Erhalten ~ 50-100 um Durchmesser mikrokapillaren Tipps
- Ziehen 1 mm Durchmesser Glaskapillaren entweder manuell über einen Bunsenbrenner oder durch Verwendung eines handelsüblichen Abzieher (vertikale Faden Abzieher oder Feinpipettenziehvorrichtung).
- Verwenden Sie eine Diamant-Filzstift oder Klinge, um die Spitze der Kapillare gezogen geschnitten, um die gewünschte Öffnung zu schaffen. Wählen Sie die beste-förmigen Kapillaren unter einem Stereomikroskop. Die Öffnung sollte 50-100 um (Abbildung 2).
1.3 Slide Vorbereitung
- Siliconize sauber Schlitten durch die alle Vertiefungen mit Sigmacote (~ 1 ml / Folie) für 5 min, zu entfernen. Bake 3 Stunden in Alufolie. Lagerung bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Multi-Well-Glas Objektträger für 10 min in 10% SDS, 2 x 2 min in Nuklease-freiem Wasser (DEPC autoklaviert-ddH 2 O), 2 min in 70% Ethanol, 2 min in 100% Ethanol, Luft- trocknen. Alle Schritte werden in autoklavierte Coplin Gläser getan. Folien können mehrmals verwendet werden, sofern eine gründliche Reinigung zwischen jedem Gebrauch.
- Unmittelbar vor dem Embryo isoliert Ausbreitung ~ 0,5 ul 10 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA) mit einer Pipette über die gesamte Oberfläche jeder Vertiefung und an der Luft trocknen.
1.4 Mikroskop und Kapillar-Setup
- Mit einem inversen Mikroskop mit 10x und 20x Vergrößerung Ziel. Optimieren Sie das Licht Kontrast (Embryonen sind sehr transparent).
- Legen Sie eine Mikromanipulators die Glaskapillare neben dem Mikroskop zu halten. Die Glaskapillare mit einem Mikroinjektor (3A) oder einem regelmäßigen P-200 Pipette über einen Gummischlauch verbunden (Fig. 3B, siehe die Diskussion für eine ausführliche Beschreibung des Setup).
- Legen Sie die Kapillare über dem Objektträger bei einer ~ 70 ° Winkel (Abbildung 3) und passen Sie die Position, um die Öffnung in das Blickfeld zu haben.
- Kurz vor dem Embryo Isolation aufnehmen und abgeben ~ 5-10 ul BSA (1 mg / ml) zur Beschichtung der Kapillare.
1.5 Puffer
Tabelle 1 listet die Isolierung und Zielpuffer Abhängigkeit von den Downstream-Anwendungen.
- Bereiten ~ 1 ml Isolation Puffer pro Probe vor Gebrauch frisch und bewahren Sie es auf Eis.
- Bereiten Sie die Ziel-Puffer in einem 0,5 ml Eppendorf schwach bindende Röhrchen auf Eis (molekulare Anwendungen) oder auf einem Objektträger (zytologische Anwendungen) in einer feuchten Kammer.
2. Seed Dissection und Embryo Extraction
2.1 Synchronisation von Seed Entwicklung
- Emasculate Blumen und halten sie 2 Tage im Wachstum der Kammer, während die Vermeidung von Kontakt der exponierten pistils mit anderen Blumen, dann bestäuben sie (z. B. 11).
- Testen Sie die Stufe der Entwicklung unter den Wachstumsbedingungen durch mikroskopische Untersuchung von Saatgut gelöscht. Mit unserem Wachstumsbedingungen (16 Stunden Licht bei 21 ° C, 8 Stunden Dunkelheit bei 18 ° C und 70% Luftfeuchtigkeit) Samen gesammelt 2,5 Tage nach der Bestäubung (DAP) lieferte hauptsächlich 2-4 Embryonen und Samen gesammelt 3,5-4 DAP ergab Kugelsternhaufen Embryonen.
2.2 Seed Dissection und Rupture
- Entfernen Sie die seeds 10-15 Schoten (~ 2,5 DAP) unter einem Stereomikroskop mit einer Pinzette und Insulin Nadeln.
- Tauchen Sie die Samen in 20 ul Isolation Puffer in einem 2-ml-Eppendorf-Röhrchen auf Eis gelegt.
- Vorsichtig zerdrücken Sie die Samen mit einer Kunststoff-Stößel (mit 10% SDS Pre-gereinigt, gespült mit DEPC-ddH2O gewaschen und mit 70% Ethanol), um die Embryonen freizugeben, bis die Samen-Extrakt ist bewölkt. Die Kraft anzuwenden ist, die von jedem Benutzer bei Versuch bestimmt werden.
- Spülen Sie den Stößel mit 300 ul Puffer, um die Isolation Stößel waschen und Verdünnen Sie die Probe.
- Spin-down der Extrakt bei 5.000 xg für 5 Sekunden. Vorsichtig resuspendieren pelletiert Extrakt durch Pipettieren up-and-down 2-3 mal.
- Der Extrakt wird mit einer 30 um Nylon-Mesh (montiert auf Rohr-Adapter, zB von PartecCelltricks). Spülen Sie die Masche mit einer zusätzlichen Isolierung 200 ul Puffer.
3. Embryo Isolation
3.1 Slide Vorbereitung
- Ein sauberes, BSA-beschichteten und silikonisierten Multi-Well-Schieber auf der Bühne des inversen Mikroskop, suspendieren die gefilterte Extrakt durch Pipettieren vorsichtig nach oben und unten und Pipette 2 Tropfen von 40-50 ul-Extrakt in 1 oder 2 Brunnen . Screening nur 1 bis 2 Tropfen auf einmal verhindert die Verdunstung der Probe.
- Platz 50 ml frisches Isolation Puffer (1. wash & Drop) in eine Vertiefung einer anderen Folie wie zuvor vorbereitet. Bewahren Sie diese Folie in einem überdachten, feuchten Kammer, um Verdunstung zu verhindern.
3.2 Bildschirm, reinigen, sammeln
- Bildschirm Der Tropfen Extrakt für Embryonen in der gewünschten Stufe mit dem 10-facher Vergrößerung Ziel. Bestätigen Sie ggf. die Bühne mit dem 20-facher Vergrößerung. Die Embryonen in der Regel an der Unterseite des Schlittens sinken.
- Manuell entfernen Sie Schmutz rund um den Embryo mit einer Wolfram-Nadel, einer Insulin-Nadel oder ähnlichen Geräten.
- Bewegen Sie die Glaskapillare in der Nähe der Embryo mit dem Mikromanipulators take up des Embryos mit so wenig wie möglich Lösung.
- Sammle mehrere Embryonen (z. B. alle ein Tröpfchen) und lassen sie in der 1. Wäsche Tropfen (molekulare Anwendung) oder in Ziel-Puffer (zytologische Anwendungen). Jede Runde sammeln sollte innerhalb von 5-10 min und Embryonen aufbewahrt werden sollten in einem minimalen Volumen (das Gesamtvolumen aller Sammeln Runden sollte <5 ul sein) gesammelt werden.
- Wiederholen Sie das Screening und Sammlung, bis die gewünschte Menge an Embryonen in der 1. Wäsche Tropfen gesammelt (zentral, wenn möglich, um Erinnerung zu erleichtern).
- Erinnern Sie alle Embryonen auf einmal aus der Wäsche Tropfen (wenn Schutt durchgeführt werden über, entfernen Sie sie mit einer Nadel vor Erinnerung).
- Lassen Sie die Embryonen in einem 2. waschen Tropfen von 50 pl. Wiederholen 3.2.6.
- Lassen Sie die Embryonen in der Ziel-Puffer. Die Übertragung sollte beinhalten nur einen Kontakt, und nicht Eintauchen der Kapillare Spitze.
- Ersetzen Sie die microcapillARY für die nächste Probe.
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Ergebnisse
Unsere Embryo Isolation Verfahren (Abbildung 1) ermöglicht die Isolierung von bis zu 40 Embryonen in 4 Stunden, wenn Waschungen durchgeführt werden, z. B. für die molekulare Anwendungen oder in weniger als einer Stunde, wenn Wäschen weggelassen werden, zB für die zytologische Anwendungen. Abbildung 2 zeigt hohe und niedrige Qualität mikrokapillaren Tipps und Abbildung 3 zeigt den Aufbau des Embryos Isolierung Maschine. Abbildung 4 zeig...
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Diskussion
Wir entwickelten einen Embryo Isolation Protokoll, das eine schnelle, effektive ist, und kann leicht an andere Labors übertragen werden.
Die beschriebenen Geräte besteht hier aus einem inversen Mikroskop, einem Mikromanipulator, Glas-Mikrokapillaren ein vertikaler Faden Abzieher und Mikroinjektor (Abbildung 3A). Das Setup ist ähnlich dem für Einzeltier Zellisolation für Transkriptom-Analysen 17 beschrieben. Wir haben auch erfolgreich mit einem Basis-Setup, wo Glas...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Wir möchten Tal Nawy und Martin Bayer für ihre Beratung auf den Embryo Isolierung danken. MTR, VG, UG und CB entwickelt der Embryo Isolierung Ausrüstung. MTR, VG und CB entwickelt der Embryo Isolation Protokoll. MTR, VG und CB etablierte das Protokoll, die Embryonen isoliert und erzeugten Embryo-cDNA durchgeführt VG die PCR, MTR die GUS-Färbung, JJ die FISH Experimente. MTR, VG, CG und UG schrieb das Manuskript. Diese Arbeit wurde von der Universität Zürich, ein Stipendium der Roche Research Foundation (MTR) und Zuschüsse aus dem Schweizerischen Nationalfonds (UG und CB) finanziert.
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Materialien
EQUIPMENT
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (Lebenstechnologien) | 10777-019 | |
| Erststrangpuffer | Invitrogen (Lebenstechnologien) | 18064-022 | enthalten im Superscript II-Paket |
| DTT | Invitrogen (Lebenstechnologien) | 18064-022 | enthalten in der Packung Superscript II |
| Rinderserumalbumin (BSA) 100x = 10 mg/ml | , New England Biolabs, Inc. | Verschiedene Anbieter sind ebenfalls erhältlich | |
| : Dünnwandige Kapillaren 1,0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind Röhrchen 0,5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μ m | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5Vertiefungen Objektträger mit 10 mm Durchmesser | Elektronenmikroskopie | 63421-10 | |
| Formaldehydlösung | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus Objektträger | Thermo Fisher J1800AMNZ | Menzel-Glä ser | |
| Tris Amaresco | 0497 | ||
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS Pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine Insulin Spritzen | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Pinzette N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalysator Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513< | |
| Inverses Mikroskop | Nikon TMS (Japan), | ||
| Mikromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post Mount LH1 Sonde | Leica Mikrosysteme | 39430101 | Andere Marke wird auch die Arbeit erledigen |
| Vertikaler Filamentabzieher | Sutter Instrument | P-20 Modell | Andere Modelle sind auch geeignet |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalysator | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (Lebenstechnologien | ||
Referenzen
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