Methodenartikel
Die Untersuchung in vitro β-Zell-Funktion mit isolierten Maus-Langerhans-Inseln ist ein wichtiger Bestandteil in der Studie der Diabetes Pathophysiologie und Therapie. Während viele Downstream-Anwendungen zur Verfügung stehen, dieses Protokoll beschreibt speziell die Messung der intrazellulären zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP) als wesentlicher Parameter, der β-Zellfunktion.
Unkontrollierter Blutzucker ist ein Markenzeichen von Diabetes mellitus und Begleiterkrankungen fördert wie Neuropathie, Nephropathie und Retinopathie. Mit der zunehmenden Verbreitung von Diabetes, sowohl immun-vermittelte Typ-1-und Adipositas-Linked-Typ-2-Studien bei der Abgrenzung Diabetes Pathophysiologie und therapeutische Mechanismen abzielen, sind von entscheidender Bedeutung. Die β-Zellen der Langerhans-Inseln Langerhans sind entsprechend Absonderung von Insulin in Reaktion auf einen erhöhten Blutzuckerspiegel verantwortlich. Zusätzlich zu Glukose und anderen Nährstoffen sind die β-Zellen auch durch spezifische Hormone stimuliert, Inkretine bezeichnet, die aus dem Darm in Reaktion auf eine Mahlzeit und wirken auf β-Zellen-Rezeptoren, die die Produktion von intrazellulären zyklischen Adenosinmonophosphat zu erhöhen sezerniert werden ( cAMP). Verringerte β-Zell-Funktion, Masse und Inkretin Reaktionsfähigkeit sind gut zu verstehen, die das Entstehen der Typ-2-Diabetes beitragen, und werden auch zunehmend verknüpft with Typ 1 Diabetes. Die vorliegende Maus Inselisolierung und cAMP-Bestimmung Protokoll kann ein Werkzeug, um zu beschreiben Mechanismen zur Förderung Fortschreiten der Krankheit und Therapiemaßnahmen, insbesondere solche, die von den Inkretin-Rezeptoren vermittelt werden oder verwandte Rezeptoren, die durch Modulation der intrazellulären cAMP-Produktion handeln. Während nur cAMP-Messungen beschrieben werden wird, schafft das beschriebene Inselisolierung Protokoll eine saubere Präparation, ermöglicht auch viele andere Downstream-Anwendungen, einschließlich Glucose-stimulierten Insulinsekretion, [3 H]-Thymidin-Einbau, Proteinmenge und der mRNA-Expression.
Die strikte Einhaltung euglycemia ist zwingend notwendig, um Begleiterkrankungen wie Neuropathie, Nephropathie, Retinopathie und, die alle Markenzeichen der Pathologie des unkontrollierten Typ-1-und-2-Diabetes sind 1 zu verhindern. Reduzierte β-Zell-Funktion und Masse in Typ 1 und 2 Diabetes stören Blutglukosekonzentrationen 2. Während immun-vermittelte Typ-1-Diabetes resultiert aus einem verheerenden Verlust von Insulin-produzierenden β-Zellen, gestörte β-Zellen Insulin-Sekretion und periphere Insulin-Signal bei Typ-2-Diabetes zusammen fördern Hyperglykämie, Dyslipidämie und erhöhte hepatische Glukoseproduktion, die schließlich zu sowohl Verlus....
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Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit allen einschlägigen Richtlinien, Vorschriften und Aufsichtsbehörden ausgeführt. Das Protokoll, die demonstriert wurde unter der Anleitung und Zustimmung des Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) der Universität von Wisconsin-Madison durchgeführt.
1. Herstellung von Lösungen
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Um eine hohe Ausbeute bei der Isolierung Insel zu gewährleisten, sollten chirurgische Techniken im Protokoll beschriebenen genau befolgt werden. Obwohl die hier vorgestellten Verfahren wird jedem Labor zugeschnitten werden, gibt es ein paar wichtige Schritte, die zu einem erfolgreichen Isolierung führen. Um den gemeinsamen Gallengang leicht zugänglich zu machen, ist es empfehlenswert, dass die Organe auf der rechten Seite der Maus (Fig. 1) verschoben werden kann. Darüber hinaus ermöglicht dies die Bauch.......
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Mit der Verbreitung von Diabetes voraussichtlich um 7,7% der Weltbevölkerung betreffen, ist die Voraussetzung für neuartige Forschungstechniken unerlässlich, sowohl Diabetes verstehen und zu behandeln 18. Die vorliegende Inselisolierung ist ein gut etabliertes Protokoll für die in-vitro-Versuche verwendet und hat vorher mit leichten Modifikationen 11,14,16 vorgestellt. Obwohl die Insulinsekretion ist ein gemeinsames stromabwärts Anwendung isolierten Inseln, die sich auf stromaufwärts Besta.......
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Autoren haben nichts zu offenbaren.
Wir möchten Renee L. Pasker und Harpreet K. Brar für kompetente technische Unterstützung auf die in dieser Arbeit beschriebenen Protokolle danken. Darüber hinaus möchten wir die Betreuung von Christopher B. Newgard an der Duke University und Alan D. Attie an der Universität von Wisconsin-Madison bestätigen, zusammen mit der Unterstützung ihrer Mitglieder Labor, die uns die Zeit erlaubt und unterstützt notwendig zur Optimierung der beschriebenen Protokollen. Insbesondere danken wir Hans Hohmeier, Danhong Lu, und Helena Winfield in der Labor-und Newgard Mary Rabaglia in der Attie Labor für produktive Diskussionen und Beratung. Diese Arbeit wurde vom NIH DK080845 und Ju....
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Kollagenase aus Clostridium histolyticum geeignet zur Isolierung aktiver Inselzellen | Sigma-Aldrich | C7657 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Hanks Balanced Salt Solution 10X | Invitrogen (Gibco) | 14065-056 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| RPMI 1640 (pulver) | Invitrogen (Gibco) | 31800-022 | |
| Albumin aus Rinderserum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7888 | |
| 3/0 Seidennahtfaden | Fine Science Tools | 18020-30 | |
| Dumont #5 Pinzette | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 0,8 mm Pinzette | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Gebogene Schere | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Vannas-Tü bingen Federschere - Gerade/Scharf/8,5 cm/5 mm Cutting | Edge Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Präparierschere | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| 5 ml BD Luer-Lok Spritze | BD | 309646 | |
| 1 ml BD Spritze | BD | 309628 | |
| 30 G BD Nadel 1/2" Länge | BD | 305106 | |
| 27 G BD Nadel 1/2" Länge | BD | 305109 | |
| Schleifstein | Fine Science Tools | 29008-01 | |
| 2-2-2-Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486-100mL | |
| Natriumchlorid (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Kaliumchlorid | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Monokaliumphosphat (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Natriumbicarbonat (NaCHO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| CaCl2· 2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| MgSO4· 7H2 | O Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
| Hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (H.I. FBS)Fisher | Scientific SH30088.03HI | ||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) | Sigma-Aldrich | 5879-100MG |
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