Anwendung eines<em&gt; In-vitro-</em&gt; DNA-Schutz-Assay, um Stress Mediation Eigenschaften des DPS-Protein Visualisieren

Zusammenfassung

Die DNA-bindendes Protein von ausgehungerten Zellen (DBS) spielt eine entscheidende Rolle bei der Bekämpfung bakterieller Belastung. Dieser Artikel beschreibt die Reinigung von E. coli Dps und das Protokoll für eine In vitro Test demonstriert DPS-vermittelte Schutz der DNA vor Abbau durch reaktive Sauerstoffspezies.

Zusammenfassung

Oxidativer Stress ist eine unvermeidbare Nebenerscheinung des aeroben Lebens. Molekularer Sauerstoff ist wichtig für terrestrische Stoffwechsel, aber es nimmt auch an vielen schädlichen Reaktionen im lebenden Organismen. Die Kombination von aeroben Stoffwechsels und Eisen, die eine weitere wichtige Verbindung für das Leben ist, ist genug, um Radikale durch Fenton Chemie produzieren und zelluläre Komponenten abbauen. DNA-Abbau ist wohl die schädlichen Prozess, der intrazellulären Radikale, wie DNA-Reparatur ist alles andere als trivial. Der Test in diesem Artikel vorgestellten bietet eine quantitative Methode zu messen und visualisieren die Wirkung von Molekülen und Enzymen auf radikalvermittelte DNA-Schäden.

Die DNA-Schutz-Assay ist eine einfache, schnelle und stabile Werkzeug zur in-vitro-Charakterisierung der schützenden Eigenschaften von Proteinen oder Chemikalien. Es schließt ein, dass eine DNA schädigende oxidative Reaktion und Zugabe von verschiedenen Konzentrationen der Verbindung von Interesse. Die Verringerung oder Erhöhung der DNA-Schädigung in Abhängigkeit von der Konzentration der Verbindung wird dann unter Verwendung von Gelelektrophorese sichtbar gemacht. In diesem Artikel zeigen wir die Technik der DNA-Schutz-Assay durch Messung der schützenden Eigenschaften der DNA-bindendes Protein von ausgehungerten Zellen (DBS). DPS ist eine Mini-Ferritin, das von mehr als 300 Bakterienarten verwendet wird, um kräftig zu bekämpfen Umwelt-Stressoren. Hier präsentieren wir die Dps Aufreinigungsprotokolls und die optimierten Testbedingungen für Auswertung DNA Schutz durch Dps.

Einleitung

Aeroben Organismen müssen ständig mit reaktiven Sauerstoffspezies, die ihre DNA sowie andere wichtige biologische Makromoleküle beschädigen kämpfen. Ein starkes Werkzeug, um die toxischen Effekte von oxidativen Schäden entgegenzuwirken ist die DNA-bindendes Protein von ausgehungerten Zellen (DBS). Seit seiner Entdeckung im Jahre 1992 von ausgehungerten E. coli-Kultur ¹ hat Dps in mehr als 300 Arten von Bakterien und Archaebakterien ² identifiziert worden. Massiver Hochregulation von Dps während der stationären Phase macht es am meisten hochexprimierten nucleoid-assoziiertes Protein von E. coli unter Hunger Bedingungen ^{3, 4.} Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass Dps sowohl bakterielle Lebensfähigkeit und DNA Integrität während vielen verschiedenen Belastungen, einschließlich Hunger, hohe Eisenkonzentration, UV-Licht Exposition, Hitzeschock, oxidativer Stress und ^{5, 6} zu bewahren.

Strukturell Dps Selbst-Mitarbeiter in eine stabile homooligomeren Komplex von 12 Monomere, werden in einem kugelförmigen hohlen Schale montieren. Das ~ 4,5 nm breiten inneren Hohlraum zugänglich an der Außenseite Lösungsmittel über Poren, die den Durchtritt von kleinen Molekülen ⁷ zu ermöglichen, und es kann mineralisierten Metallen wie Eisen ⁸ binden. Die schützende Wirkung von Dps leitet sich von seinen verschiedenen biochemischen Aktivitäten, die nicht-spezifische DNA-Bindung ^1, Ferroxidaseaktivität und Speicherung von Eisen ⁸ gehören.

Detaillierte Studie der positiven biochemischen Aktivitäten von Dps erfordert zunächst seine Reinigung. Dps Reinigung ist eine aufwendige Prozedur, wie Dps nicht nur von anderen Proteinen getrennt werden müssen, sondern auch von jedem gebundenen DNA ^7. Unsere optimierten Reinigungsprozess verwendet viele gängige Techniken, bestehend aus zwei Ionenaustausch-Säulen und einem Ammoniumsulfatfällung Schritt. Mehrere Puffer Börsen sind erforderlich, da hochkonzentriert Dps ausfallen können von Lösung in salzarme Bedingungen. Sobald Dps Protein wurde gereinigtKann es zu Assays, die direkt zu messen sein Ferroxidaseaktivität ^8, DNA-Bindungsstöchiometrie ⁹ und Mechanismen Eisenbindungskapazität ¹⁰ aufgebracht werden. Gereinigt Dps hat auch andere Einsatzmöglichkeiten. Die stabile Hohlkugelstruktur von Dps als Gerüst wurde für die Speicherung von hydrophoben Teilchen im Inneren des Proteins Hohlraum ¹¹ verwendet und sogar als eine Reaktionskammer zu synthetisieren neuartige magnetische Nanopartikel ^12.

Die Schutzfähigkeit von Dps um Schäden durch reaktive Sauerstoffspezies vermitteln kann klar und direkt nachgewiesen mit Hilfe der DNA-Schutz-Assay ^{13, 14.} In diesem in vitro-Verfahren werden Radikale erzeugt, wenn Eisen katalysiert H ₂ O ₂ Zersetzung durch Fenton Chemie. Diese Reste direkt schädigen DNA in der Reaktion und vollständig abzubauen es bei hohen Konzentrationen. Zwei wichtige Dps Aktivitäten können sowohl direkt den Effekten entgegenzuwirken, von Fenton-vermittelten radikalischen Produktion. DPS senkt die Konzentration an katalytischem Eisen durch Mineralisierung und verbraucht den verfügbaren Wasserstoffperoxid in den Prozess. Darüber hinaus kann die Bindung an DNA DPS potentiell abschirmen physisch von Radikalen und kondensiert sie in ein kleineres Volumen mit weniger reaktiven Oberfläche. Die Kombination dieser beiden Eigenschaften macht den DNA-Schutz-Assay auch für den Zweck der Messung schützende Dps Aktivität geeignet.

Die DNA-Schutz-Assay ist sehr vielseitig und kann für eine Vielzahl von Anwendungen über DPS Charakterisierung verwendet werden. Radikale ist eine häufige Form von Stress in Zellen, und viele verschiedene Proteine ​​und Chemikalien werden verwendet, um dem entgegenzuwirken. Das allgemeine Prinzip des Assays unter Verwendung von DNA-Integrität als Marker für Radikale, können in Kombination mit fast jedem Rest-produzierenden Reaktion oder entgegenwirkende Mittel eingesetzt werden. Unter anderem hat der Test erfolgreich verwendet, um anti-oxidativen Eigenschaften zu bestimmenvon K. paniculata Extrakt für den Einsatz in der Lebensmittelindustrie ^15, um die Auswirkungen der Harnsäure auf Hydroxyl Schäden Mediation ¹⁶ charakterisieren und neue Einblicke in die Funktion des Fur Transkriptionsregulators Proteine ^​​17 zu gewinnen.

Trotz der zahlreichen Verwendungen des Assay in veröffentlichten Arbeiten fanden wir, dass viele Optimierung und Fehlerbehebung erforderlichen Schritte wurden, wodurch die Einrichtung der Test zum ersten Mal eine unnötig aufwendige Arbeit für viele Forscher. Das Protokoll präsentieren wir in diesem Artikel soll diese Barriere für den Eintritt zu entfernen.

Protokoll

1. Dps Expression und Reinigung

Beziehen Protein von hoher Reinheit ist ein wichtiger erster Schritt für die DNA-Schutz-Assay. Reinigung von Dps Protein kann in 4 bis 5 Tagen durchgeführt werden.

1. Verwandeln Sie ein Protease-defizienten Stamm von E. coli (wie BL21 (DE3) pLysS) mit einem pET-Vektor (wie pET17), in die der dps-Protein-kodierende Sequenz kloniert wurde.
2. Streak die umgewandelten Zellen auf Luria Broth (LB)-Agarplatten, die entsprechenden Antibiotika (zB Ampicillin und Chloramphenicol für die Beispiele in 1,1 gestellt). Die Inkubation über Nacht bei 37 ° C.
3. Impfen einer einzelnen Kolonie von der Platte in 30 ml LB-Medium mit geeigneten Antibiotika. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln bei 200-250 Umdrehungen pro Minute.
4. Impfen 2 x 1 L LB-Medium mit entsprechenden Antibiotika mit je 10 ml der Übernacht-Kultur. Wachsen bei 37 ° C, unter Schütteln, bis OD ₆₀₀ von ca. 0,6. (Wachsende Zellen zu höheren OD erhöht Ausbeute an Protein, ohne merklich zu beeinträchtigen die Reinheit des Endprodukts.) Induzieren die Expression von Dps durch Zugabe von IPTG bis zu einer Konzentration von 0,3 mM und Inkubation bei 37 ° C für 3-4 Stunden unter Schütteln.
5. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 6.000 xg für 15 min. Resuspendieren der Zellpellets in 7,5 ml DEAE-Puffer A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA) pro Liter der induzierten Zellkulturen. Die Proben können in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C, wenn gewünscht. Das Verfahren kann dann durch Auftauen der Proben in einem Wasserbad bei 4 ° C fortgesetzt
6. In ein Gemisch von Protease-Inhibitoren (z. B. Calbiochem Satz III Proteaseinhibitoren bei 0.167 ul pro ml Zellsuspension) zu der Zellsuspension, um den Abbau von überexprimierten DPS verhindern.
7. Bereiten zellfreien Extrakt mit einem Französisch Presse. Prime die Französisch Presse mit 20 ml DEAE-Puffer A (bei Verwendung eines Durchfluss-Modell), dann DISRUPt die Probe zweimal bei 20 kpsi. Zentrifuge das Lysat bei 30.000 g für 35 min bei 4 ° C bis unlösliche Partikel zu klären, und speichern Sie den Überstand. Der Überstand kann dann mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C, wenn gewünscht.
8. Äquilibrieren eine 30 ml DEAE-Sepharose CL-6B-Säule mit DEAE-Puffer A, unter Verwendung eines FPLC. Laufpuffer durch die Säule mit 1-2 ml / min bei einem maximalen Druck von 0,2 MPa über Hintergrund. Laden Sie die zellfreien Extrakt auf die Säule, und beginnen, die Flow-Through, sobald die OD _280-Signal beginnt oberhalb der Grundlinie erhöhen zu sammeln. Waschen Sie die Säule mit DEAE Buffer A, bis die OD _280-Wert auf den Ausgangswert zurück, während kontinuierlich Sammeln der Durchströmung. Der Durchfluss sollte die Mehrheit der DPS-Protein, frei von gebundenen DNA. Die Säule wird mit 100% Puffer B (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 1 M NaCl, 0,1 mM EDTA). Dieses Eluat enthält DPS-DNA-Komplexe sowie andere Proteine ​​codieren und kann verworfen werden.
9. Ad entfernenzusätzliche verunreinigenden Proteine ​​durch Ammoniumsulfat-Fällung. Bestimmen Sie das Volumen von gepoolten Durchströmung. Langsam (über einen Zeitraum von 10-20 min) hinzufügen trockenen kleinen Korn Ammoniumsulfat auf 62% Sättigung (390 mg pro ml Lösung) bei 4 ° C unter Rühren gut. Die Mischung wird für weitere 20-30 min nach der Zugabe der letzten Portion von Ammoniumsulfat, um eine vollständige Gleichgewichtseinstellung zu gewährleisten. Dps bleibt löslich, während verunreinigenden Proteine ​​ausfallen wird der Lösung.
10. Entfernen gefällten Proteine ​​durch Zentrifugation bei 20.000 × g für 30 min bei 4 ° C und speichern Sie den Überstand.
11. Langsam fügen Sie eine zusätzliche 227 mg Ammoniumsulfat pro ml Überstand auf 94% Sättigung zu erreichen und rühren für 20-30 min, um eine vollständige Gleichgewichtseinstellung zu gewährleisten. DPS fällt bei dieser hohen Salzkonzentration und durch Zentrifugation bei 20.000 × g für 30 min bei 4 ° C gesammelt Die EP werden im Pellet sein, der Überstand verworfen werden können. Das Pellet kann bei -80 ° C gelagert werden, wenn desired.
12. Resuspendieren der DPS-Pellet in Resuspensionspuffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Stellen Sie die Probenmenge zu 2,5 ml.
13. Pufferaustausch die Ammoniumsulfat unter Verwendung einer PD-10 Gelfiltrationssäule zu entfernen. Equilibrieren das Gel Bett mit 25 ml Resuspensionspuffer. Übernehmen Sie die 2,5 ml Dps Probe auf die Spitze des PD-10-Säule und lassen Sie ihn einweichen in. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. Sammle Dps durch Elution mit 3,5 ml Resuspensionspuffer.
14. Zentrifugieren Pufferaustausch Probe bei 16.000 × g für 10 min bei 4 ° C, um alle unlöslichen Bestandteile zu entfernen, und verdünnen mit 6-10 ml Verdünnungspuffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 0,1 mM EDTA), um sicherzustellen, dass die Salzkonzentration niedrig genug für die EP, der SP-Sepharose-Säule gebunden. Besonders konzentrierte Proben der EP kann es weniger löslich bei Verdünnung in einer niedrigeren Salzpuffer, wie Trübung der Flüssigkeit nachgewiesen, sondern kann vollständig durch die Zugabe einer kleinen amou Lösung gebracht werdennt von 5 M NaCl-Lösung (eine zusätzliche 10-20 mm).
15. Äquilibrieren einer 30 ml SP-Sepharose Fast Flow-Säule mit SP Puffer A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Führen Puffer durch die Säule mit 1,5-2 ml / min mit einem Druck von 0,3 MPa über Hintergrund. Legen Sie die Probe auf die Säule. Waschen mit Puffer A SP, bis die OD ₂₈₀ Spuren auf den Ausgangswert zurück, und entsorgen Sie die Durchströmung. Führen Sie einen 150 ml linearen Gradienten von 0 bis 100% Puffer B, beim Sammeln von 2 ml Fraktionen. Die EP werden in einem scharfen Peak bei etwa 50% B eluieren, obwohl Variation von 10% ist möglich.
16. Führen Sie die Elutionsfraktionen auf einem 15% SDS-PAGE-Gel, und überprüfen Sie die DNA-Kontaminationen durch Messung der OD ₂₆₀ / OD ₂₈₀ Verhältnis mit einem Spektralphotometer. Das Gel sollte nur zeigen, ein Band um 19 kDa und die OD ₂₆₀ / OD ₂₈₀ ist in der Regel etwa 0,7. Schwimmbad Das reinste Dps Fraktionen. Verwenden Sie einen Zentrifugalfiltereinheit (wie der Amicon Ultra-Filtration Unit) mit einem10K Molekulargewicht cut-off zu konzentrieren der DPS und tauschen sie in einen Pufferspeicher (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM NaCl). Aliquot die gereinigten Dps und Einfrieren in flüssigem Stickstoff für die Lagerung bei -80 ° C.

2. DNA-Schutz-Assay

Der Test umfasst mehrere zeitkritische Schritte und sollte mit dem zweiten zeitgesteuert werden, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Viele Zutaten und Pipettierschritten beteiligt sind, so dass ein Pipettieren (siehe Tabelle 1) ist es ratsam, den Überblick über die Schritte und Volumen zu halten. Die Gesamtzeit für den Assay benötigt wird, nicht mehr als 3 Stunden.

1. Messen 30 ml Wasser in einem luftdichten Gefäß, die Wasserleitung mit N ₂ für 10 min (mit zwei Injektionsnadeln, ein in der Flüssigkeit, eine darüber), um Sauerstoff aus der Lösung zu entfernen. In 0,0168 g FeSO ₄ • 7H ₂ O, um das Wasser, um eine 2 mM Stammlösung zu erhalten. Verschließen Sie die Flasche und spülen mit Stickstoff für 5 min mehr, dann mischen. Die Lösung mussklar, wenn jeder Hauch von gelb nachweisbar ist, bereiten eine neue Eisen Lösung.
2. Machen Sie eine 100 mM H ₂ O _2-Lösung (10.87 ul 9.2MH ₂ O ₂ in 1 ml Wasser), auf Eis zu halten und vor Licht geschützt durch das Einwickeln in Aluminiumfolie. Verwenden Sie nur für etwa 1-2 Stunden nach der Herstellung durch spontanen Zerfall. Das Wasserstoffperoxid Lager ist ähnlich störanfällig, die teilweise durch die richtige Lagerung (im Dunkeln bei 4 ° C) kann verbessert werden. Regelmäßige Kontrollen des Bestands Konzentration durch Messung der OD ₂₄₀ werden empfohlen.
3. Tauwetter ein Aliquot des gereinigten Dps schnell in einer Raumtemperatur Wasserbad, und halten auf dem Eis. Zentrifuge für 10 sec bei 4.000 xg in einer Tischplatte picocentrifuge auszufallen Aggregate. Messen Konzentration nach Zentrifugation mit einem Spektralphotometer (OD ₂₈₀ = 1.547 zeigt eine Konzentration von 100 pM Monomer DBS).
4. Verdünnen lineare DNA von hoher Konzentration Lager mit 12x Reaktionspuffer (1M MOPS-KOH, pH 7,0, 1 M NaCl) zu einer Konzentration von 100 ng / ul. Lineare DNA wird verwendet, um die Quantifizierung zu erleichtern, aber Plasmid-DNA kann ebenso verwendet werden.
5. Je 1 ul der DNA-Puffer-Gemisches in ein PCR-Röhrchen. Fügen Sie genug Wasser in der Reaktion, so dass die Endreaktionsvolumen (minus SDS) werden 12 ul sein. Dieser Betrag sollte im Voraus mit dem Pipettieren Tabelle berechnet werden. In Dps zu einer endgültigen Dodecamer Konzentration von 3 um. Inkubation: 15 min bei Raumtemperatur zu ermöglichen DPS DNA binden.
6. Fügen Sie genug 2 mM FeSO _4-Lösung, um die gewünschte Konzentration zu erreichen. Ein typisches Experiment verwendet einen Konzentrationsbereich von 0 bis 1 mM FeSO _4. Höhere Konzentrationen führen umfangreichere DNA-Abbau, sondern kann auch zur Bildung von Eisen-III-Ausscheidungen in der Reaktionsmischung führen. Schnelles Hinzufügen von 1 ul der 100 mM H ₂ O _2-Lösung (10 mM Endkonzentration) und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min, damit der Fenton-Vermittelten Abbau Reaktion stattfindet.
7. In 0,8 ul 20% SDS (Natriumdodecylsulfat). Mischen und Inkubation bei 85 ° C für 5 min auf der DPS-DNA-Komplexe zu stören. Die SDS destabilisiert die Dps-DNA-Komplex und verhindert unerwünschte Verschiebungen Gel für die DNA, die die Leichtigkeit der Quantifizierung verbessert. Ein optionaler Schritt ist die Reaktion durch katalytische Abbau des Wasserstoffperoxids in nicht-toxische Produkte auf. Für die Bedingungen in diesem Protokoll beschrieben, ist dieser Schritt nicht notwendig, um ein breites Spektrum von DNA-Abbau erhalten.
8. Inkubation auf Eis für 1 min, fügen Laden Farbstoff und laden auf einem Agarosegel. Führen Sie das Gel und Fleck für die DNA mit Ethidiumbromid. Das Gel sollte gebeizt post-Elektrophorese, anstatt vor der Elektrophorese, die SDS von störenden mit dem Ethidiumbromid Verteilung im Gel zu verhindern.

Ergebnisse

Das Reinigungsverfahren für Dps beschrieben ist hier sehr reproduzierbar. DPS Reinigung nach dem beschriebenen Protokoll, mit 2 l E. coli-Kultur als Ausgangspunkt, wird in der Regel ergeben 2,5 ml Protein enthaltenden Dps ₁₂ in Konzentrationen zwischen 5 und 12 um. Längere Zeiten Induktion (4 h) scheinen diese Variabilität zu reduzieren. Protein Reinheit durchweg über 99%, wie durch SDS-PAGE-Gelen (Abb. 1) zeigt. Der Grad der DNA-Kontaminationen werden durchweg gering, da sowohl durc...

Diskussion

Das Reinigungsverfahren Dps wie in diesem Artikel beschrieben wird, ist sehr robust. Reinheit ist durchweg hoch (> 99%); keine anderen Proteine ​​scheinen auf SDS-PAGE-Gelen als sichtbare Banden. Trotzdem scheinen einige Chargen von gereinigtem DPS Nukleaseaktivität haben, wie durch partielle DNA-Abbau nachgewiesen, wenn mit sehr hohen Konzentrationen von Dps inkubiert. Dies könnte darauf hindeuten, das Vorhandensein von hochaktiven DNasen bei niedriger Konzentration, dass wir nicht durch Reinigung zu entfernen waren...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BL21(DE3)pLysS kompetente Zellen	Promega	L1195
pET-17b DNA	EMD-Millipore	69663-3
LB Bouillon Pulver	Sigma-Aldrich	L3022
Ampicillin Natriumsalz	Sigma-Aldrich	A0166
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758
HEPES	BDH	441476L
Kaliumhydroxid	Merck	105033
Natriumchlorid	VWR	443824T
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
Proteasehemmer Cocktail Set III	EMD-Millipore	539134
DEAE-Sepharose	Sigma-Aldrich	DFF100
Ammoniumsulfat	Sigma-Aldrich	A4418
PD-10 Entsalzungssäulen	GE Healthcare LS	17-0851-01
SP-Sepharose	Sigma-Aldrich	S1799
Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO)	Millipore	UFC901024
Eisensulfat-Heptahydrat	Sigma-Aldrich	F8048
Wasserstoffperoxid-Lösung	Sigma-Aldrich	216763
MOPS	Calbiochem	475898 SDS-Lösung
	Bio-Rad	161-0418
Ethidiumbromid	Sigma-Aldrich	E1510
Statischer Inkubator	Hettich	INE500
Schüttelinkubator	New Brunswick Sc.	Inova 44
Gekühlte Zentrifuge	Beckman Coulter Avanti	J-E
Tischzentrifuge	Eppendorf	5424
Zelldisruptor	Constant Systems Ltd.	TS2/40/AA/AA
FPLC Luftreiniger	General Electric	AKTA
Luftdichte Fläschchen	Cole-Parmer	EW-08918-85
Spritzennadeln	BD	305128
Pipetten	Eppendorf	Z683779-1EA, Z683795-1EA