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Methodenartikel

Herstellung von Azinuszellen des Pankreas für die Zwecke von Calcium Imaging, Cell Verletzung Messungen und Adenovirus-Infektion

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DOI:

10.3791/50391

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5. Juli 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Rangos Research Center, Pediatric Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition, Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC, 2Department of Surgery, Tufts University Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein reproduzierbares Verfahren zur Herstellung von Maus Azinuszellen des Pankreas von einer Maus für die Zwecke der Prüfung Azinuszelltumoren Calcium-Signale und zelluläre Schädigung mit physiologisch und pathologisch relevanten Reize. Verfahren für die adenovirale Infektion dieser Zellen wird ebenfalls bereitgestellt.

Zusammenfassung

Das Pankreas Azinuszelltumoren ist die wichtigste Parenchymzelle des exokrinen Pankreas und spielt eine führende Rolle bei der Sekretion von Pankreas-Enzyme in den Pankreasgang. Es ist auch der Ort für die Einleitung der Pankreatitis. Hier beschreiben wir, wie Azinuszellen isoliert werden aus ganzen Pankreasgewebe und intrazellulären Calcium-Signale werden gemessen. Darüber hinaus beschreiben wir die Techniken der Transfektion dieser Zellen mit adenoviralen Konstrukte und anschließend Messung der Leckage von Laktat-Dehydrogenase, ein Marker der Zellschädigung, während die Bedingungen Azinuszelltumoren Verletzungen in vitro zu induzieren. Diese Techniken bieten ein leistungsfähiges Werkzeug, um Azinuszelltumoren Physiologie und Pathologie zu charakterisieren.

Einleitung

Dynamische Veränderungen in zytosolischen Kalzium sind notwendig sowohl für physiologische und pathologische Azinuszelltumoren Veranstaltungen. Diese unterschiedlichen Effekte von Calcium werden gedacht, um aus unterschiedlichen räumlichen und zeitlichen Muster der Calcium-Signalgebung 1 führen. Zum Beispiel werden Enzym und Sekretion aus der Azinuszelltumoren Calcium Spikes aus einem begrenzten Bereich des apikalen Pol, wo Sekretion erfolgt 2 verbunden. Im Gegensatz dazu ist ein globales Calcium Welle durch intensive nicht-oszillierende Kalzium-Signale verfolgt mit frühen pathologischen Ereignissen, die zu einer akuten Pankreatitis führen 3,4 zugeordnet. Dazu gehören intra-acinar Proteaseaktivierung, reduzierte Enzym-Sekretion und Azinuszelltumoren Verletzungen. Unser Labor verwendet isoliert Pankreasazini diese frühen pathologischen Ereignissen, die Krankheit sowohl in vivo und in vitro 5-7 führen zu studieren. Die Methoden detailliert beschreiben Isolierung von primären Azinuszellen zum Zweck der Messung cytosolic Kalziumspiegel und Zellschäden. Verfahren für die adenovirale Infektion dieser Zellen wird ebenfalls bereitgestellt.

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Protokoll

1. Vorbereiten Azinuszellen des Pankreas für Calcium Imaging

  1. Bereiten HEPES Inkubationspuffer enthaltend 20 mM HEPES, 95 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM MgCl 2, 1,3 mM CaCl 2, 10 mM Glucose, 2 mM Glutamin und 1 × Minimum Eagle-Medium nicht-essentiellen Aminosäuren. Stellen Sie die endgültige Lösung auf pH 7,4 mit NaOH.
  2. Vorbereiten einer BSA Inkubationspuffer indem BSA (1% w / v Endkonzentration) unter 25 ml HEPES Inkubationspuffer (oben beschrieben).
  3. Vorbereiten einer Collagenaseverdau Puffer durch Zugabe von 1,1 mg / ml (200 Einheiten / ml) Typ-4-Kollagenase und 1 mg / ml Sojabohnen-Trypsininhibitor bis 6 ml BSA Inkubationspuffer (oben beschrieben).
  4. Acid-Wash 22x22 mm Deckgläser durch Eintauchen in zwei Teile HNO 3 und einem Teil HCl für 2 Stunden. Dann dekantiert mit DI-Wasser und Speicher in 70% Ethanol.
  5. Euthanize eine Maus durch CO 2-Erstickung. Orient das Tier in Rückenlage, und bereiten die Bauchdecke von cleAning mit 70% Ethanol. Führen Sie eine Laparotomie, um die Bauchhöhle aussetzen. Präparieren Sie sich die Bauchspeicheldrüse und sofort in einem kleinen Boot wiegen mit 6 ml Kollagenaseverdau Puffer spülen.
  6. Sezieren entfernt alle große Stücke von Fett oder sichtbare Blutgefäße, entfernen Sie dann 5 ml Kollagenaseverdau Puffer und fügen Sie es zurück in die 15 ml konischen Röhrchen.
  7. Mit feinen Sezierung Schere zerkleinern die Bauchspeicheldrüse in dem kleinen Boot mit einem Gewicht, das 1 ml Kollagenaseverdau Puffer. Mince bis die resultierende Lösung erscheint gleichmäßig verteilt.
  8. Übertragen Sie das Hackfleisch Produkt einem 125 ml Erlenmeyer Plastikflasche, und fügen Sie die restlichen 5 ml Kollagenaseverdau Puffer zum Container. Stellen Sie sicher, das Gewebe vollständig in Puffer getaucht.
  9. Der Kolben wird in einem 37 ° C warmen Wasserbad und schütteln bei 90 rpm für 30 min. Während dieser kurzen Zeit von Ausfallzeiten, bereiten Calcium aktivierenden Agonisten (zB Caerulein, Carbachol) und spülen Sie die 22x22 mm acid-washed Abdeckungrutscht mit DI-Wasser. Trockene, und legen Sie dann oben auf eine ebene Fläche von Labor Film ausgekleidet.
  10. Nach Ablauf der 30 min Digest abgeschlossen ist, überführt die Suspension zurück zu dem 15 ml konischen Röhrchen und damit die Zellen zu begleichen. Beim Pipettieren das Kollagenaseverdau Puffer und ersetzen mit 6 ml BSA Inkubationspuffer. Kräftig schütteln Rohr von Hand für 10 Sekunden, um die Zellen in kleinere Cluster zu dispergieren. Unmittelbar nach Schütteln entfernen großen, Treibgut aus den unruhigen Medien.
  11. Lassen Sie die übrigen Zellen zu regeln, und tauschen Sie die Medien mit frischen BSA Inkubationspuffer.
  12. Wiederholen Sie Schritt 1.11 zweimal, bis die Suspension von nur kleinen Clustern, die nur fein mit bloßem Auge besteht. Die Zellen sollten die in Abbildung 1A (obere Reihe) dargestellt ähneln.
  13. Entfernen Sie die BSA Inkubationspuffer und ersetzen mit HEPES Inkubationspuffer.
  14. Bereiten Sie eine 750 pM, 100X Lager von Fluo-04.00 in 10% DMSO.
  15. Legen Sie die Zellen in der 15 ml konischen Röhrchen mit der Zellsuspension und BSA-freien HEPES Inkubationspuffer. Um dies zu tun, fügen Sie ein geeignetes Volumen (1:100 Verdünnung) der Stammlösung zu der Zellsuspension. Dann die Platte 500 ul dieser Suspension auf jeden 22x22 mm Deckglas.
  16. Halten Deckgläser im Dunkeln bei Raumtemperatur. Nehmen Sie die erste Ca 2 +-Messungen 30 min nach der Belastung. Der Farbstoff wird automatisch von dem Medium bei Beginn der Perfusion, die 30 min nach Farbstoffbeladung auftreten sollte entfernt.

2. Mess-Calcium in Azinuszellen des Pankreas

  1. Spülen jedes Perfusion Aufbau mit entionisiertem Wasser füllen und mit einer geeigneten Menge von Puffer oder Agonisten. Prime jede Spritze mit Puffer oder Agonisten zur richtigen Fluss zu versichern. Clamp Spritzen zu einem Ring stehen etwa 1-2 Meter über dem Mikroskop Bühne.
  2. Verwenden feinen Pinzette vorsichtig aus seinem Rand ein Deckglas haltige Zellsuspension zu erreichen. Kippen Sie die Abdeckungrutschen 45 °, und lassen Sie das überschüssige Puffer ablaufen. Legen Sie das Deckglas auf der Gummidichtung mit den Zellen auf der Oberseite des Deckglases, und montieren Sie die Kammer (2A und 2B).
  3. Sichern Sie die Perfusionskammer auf die Bühne und legen Sie den Schlauch, die Puffer enthält in den ersten Einlass der Kammer (Abbildung 2C). Drehen Sie die Spritze mit Puffer auf und lassen Sie den Puffer auf perfundieren über die gesamte Oberfläche des Deckglases. Sobald der Puffer das entgegengesetzte Ende der Kammer erreicht hat, legen Sie eine Saugleitung in das Vakuum Einlass. Legen Sie keine anderen Rohre (mit Agonisten, Inhibitoren, etc.) in die entsprechende Position entlang der Kammer.
  4. Visualisieren der Zellen entweder mit einem 200X oder 400X, 1,4 numerische Apertur Ziel und einen Argon-Laser, um die Fluo-4.00 Farbstoff bei einer Wellenlänge von 488 nm (1A, unten) zu erregen. Die Leistungseinstellung des Lasers sollte so eingestellt werden, daß die Photovervielfacherröhre (PMT) Nicht durch das emittierte Licht gesättigt. Darüber hinaus muss die Spannung über der PMT, um eine maximale Lichterfassungseinrichtung optimiert werden.
  5. Langpaß Sendesignale von> 515 nm bei Frameraten von 2-5 gesammelt sec / Rahmen zur Visualisierung langsam oszillierenden Muster und 0,2-0,3 sec / Rahmen zur Visualisierung schneller, global Calcium Wellen (3 und 4).
  6. Nach der Bebilderung abgeschlossen ist, schließen Sie die Spritzen und entfernen Sie alle Schläuche. Demontieren Sie die Kammer und wiederholen Sie die Schritte 2.2-2.4.
  7. Sammeln von Daten als numerische Werte der Fluoreszenzintensität über die Zeit und Transfer zum Bild J (Software als Freeware von den National Institutes of Health und finden Sie unter http://rsb.info.nih.gov/ij/ ).
  8. Echtzeit-Anzeige von Bildern und zellulären identifizieren regions of interest (ROIs, dh apikal, basolateral, Kernenergie, etc.)
  9. Erwerben Fluoreszenzintensitäten für diese ROIs und represent als Fluoreszenzintensität / Fluoreszenzbasismesswert Intensität (dh F/F0).
  10. Generieren Kurven durch Auftragen F / F 0 vs Zeit. Neben Kurven sind repräsentative Bilder allgemein vorgesehen und angezeigt Pseudocolor.

3. Herstellung von Azinuszellen des Pankreas für Zellschädigung Assays

  1. Warm DMEM F-12 Medium (ohne Phenolrot) bis 37 ° C.
  2. In BSA (0,1% w / v final) und HCl (50 uM endgültig) DMEM F-12 Medien.
  3. Aliquot 50 ml DMEM in einem konischen Rohr.
  4. Vorbereiten einer Kollagenase-Puffer durch Zugabe von 0,5 mg / ml (12 U / ml) von Collagenase Typ IV bis 10 ml DMEM ergänzt F-12 Medien.
  5. Euthanize eine Maus durch CO 2-Erstickung. Orient das Tier in Rückenlage, und bereiten Sie die Bauch-Oberfläche durch die Reinigung mit 70% Ethanol. Führen Sie eine Laparotomie, um die Bauchhöhle aussetzen. Präparieren Sie sich die Bauchspeicheldrüse und sofort in einem kleinen Boot mit einem Gewicht von c spülenontaining 6 ml Kollagenase-Puffer.
  6. Mince das Gewebe mit feinen Sezierung Schere für 3-5 min oder bis die resultierende Lösung erscheint gleichmäßig verteilt.
  7. Übertragen Sie die zerkleinerte Gewebe in einen 125 ml Erlenmeyerkolben mit 5 ml Kollagenase zusätzliche Puffer und anschließend in einem 37 ° C Wasserbad unter Schütteln bei 90 rpm für 5 min.
  8. Entfernen Sie aus dem Shaker, erlauben Zellen kurz absetzen, und der Austausch mit 5 ml frischem Kollagenase-Puffer. Dann für weitere 35 min in einem 37 ° C Wasserbad unter Schütteln bei 90 Upm inkubiert.
  9. Energisch resuspendieren Digest mit einem Transferpipette bis die Suspension erscheint ohne offensichtliche Zellklumpen homogen. Dann vorsichtig pipettieren die Zellsuspension durch eine vorbefeuchtenden Nylon-Mesh in einen Erlenmeyerkolben.
  10. Kräftig pipettieren weitere 3 ml frisches DMEM F-12 Medium (mit Kollagenase) durch das Gitter, um durch alle übrigen Zellen zu erzwingen.
  11. Hinzufügen 6-10 ml DMEM F-12 Medien und einellow die Zellen für 2-3 min zu begleichen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, und entfernen Sie den Überstand nach dem letzten Waschen.
  12. In frischem DMEM F-12 Medien, werden die Zellen, und die Platte 500 ul Zellsuspension in jede Vertiefung einer 48-well Gewebekulturplatte. Die Zellen sollten die in Abbildung 1B dargestellt ähneln.
  13. Die Platte wird in einem 37 ° C Wasserbad bei 90 UpM für 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen, bevor Agonisten.
  14. Stimulieren Sie die Zellen mit unterschiedlichen Agonisten für 2-4 Std.
  15. Kippen Sie die Platte in einem Winkel, damit die Zellen, sich niederzulassen und sorgfältig Pipette heraus ein Aliquot der Medien (in der Regel 100 ul) und Flash-freeze in flüssigem Stickstoff.
  16. Blitzeis die verbleibende Zellsuspension. Flash-Einfrieren ist nicht für LDH Messungen unerlässlich. Als Alternative können Proben auf Eis gehalten werden, wenn sie am gleichen Tag analysiert oder gespeichert werden in -20 ° C für die langfristige Lagerung.

4. Mess-Lactatdehydrogenase Leakage

  1. Measure Lactat-Dehydrogenase (LDH) Leckage in erster Linie mit den Reagenzien und Anweisungen in der Promega CytoTox 96 Non-Radioactive Zytotoxizität Assay Kit (siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien und Materialien) geliefert.
  2. Den Inhalt der LDH Substrat (das ist im Kit enthalten) mit 12 ml Assay-Puffer (ebenfalls mitgeliefert).
  3. Auftauen Zellsuspension und Medien Proben in einem Wasserbad bei Raumtemperatur.
  4. Die Platte 50 ul jeder Medien Probe in einer 96-Well-Platte.
  5. Zu der Zellsuspension, fügen Sie das notwendige Volumen von 10X Lysepuffer so dass die endgültige Konzentration 1X. Vortex kurz und bei 37 ° C für 60 min.
  6. Zentrifuge lysierten Proben bei 250 xg für 4 min zur Pelletierung Zelltrümmer.
  7. Für Zelllysaten Platte 50 ul einer Verdünnung von 1:10 in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.
  8. In 50 ul des rekonstituierten Substrat in jede Vertiefung, bebrüten die Platte im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 min.
  9. Stoppen der Reaktion durchZugabe von 50 ul der Stop-Lösung (im Kit enthalten) in jede Vertiefung.
  10. Messen Sie die Absorption bei 490 nm.
  11. Verwenden Sie die folgenden Formeln% LDH Leckage berechnen. Die optischen Dichten sind unten durch Subtraktion eine leere OD Lesung aus einem Brunnen, die nur PBS, Substrat korrigiert und Stop-Lösung.

LDH in media = (Medien OD492) x (Medien Verdünnungsfaktor) x (Bd. von Medien) * Da es in der Regel nicht erforderlich, Medien Proben zu verdünnen, der Verdünnungsfaktor wird meist equal1.

Insgesamt LDH = ((Lysate OD 490) x (Lysat Verdünnungsfaktor) x (Volumen in Zellsuspension)) + ((Media-OD 490) x (Verdünnungsfaktor) x (Volumen der Medien für die Probenahme aliquotiert))

figure-protocol-1

5. Infizieren Azinuszellen des Pankreas mit Adenovirus

  1. BereitenAzinuszellen des Pankreas, wie in Kapitel 3 beschrieben.
  2. Nach Schritt 3.12, mit 10 7 infektiösen Einheiten (IFUs) von Adenovirus zu der Zellsuspension und Inkubation für 30 min bei 37 ° C
  3. Gleichmäßig Platte 2 ml Zellsuspension in einer 6-Well-Platte.
  4. Für die meisten Ausdruck Konstrukte sollten die Zellen ausreichend innerhalb von 18 Stunden infiziert werden, und für einige Luciferase Konstrukten, nur innerhalb von 6 Stunden.

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Ergebnisse

Ein Beispiel Azinuszelltumoren Calcium, welche in Reaktion auf physiologische Stimuli ist in 3 bereitgestellt. Acinar Zellen wurden mit dem Calcium geladen Farbstoff Fluo-4 und durchströmt mit dem Acetylcholin analogen Carbachol (CCH, 1 uM)) 8. Zellen reagierten in Form eines Calcium-Welle, die in dem apikalen Bereich initiiert und breitet sich zur basolateralen Bereich 3,9. Repräsentative Kurven in 3B gezeigt zeigen die typische Peak-Plateau-Muster häufig mit 1 uM...

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Diskussion

Die Zelle Isolierung Verfahren und anschließende Tests hier dargestellten stellen leistungsfähige Werkzeuge, mit denen die physiologische und pathophysiologische Funktionen des exokrinen Pankreas zu studieren. Das Verfahren zur Isolierung verteilt Azinuszellen des Pankreas wurde erstmals von Amsterdam und Jamieson 1972 11 beschrieben. Die hier vorgestellten Methoden aus neueren Methoden Isolierung von Van Acker und Kollegen 12 beschrieben angepasst wurden. Obwohl diese Techniken gut reproduzierbare...

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Offenlegungen

Kein Interessenkonflikt erklärt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von einem National Institutes of Health Grants DK083327 und DK093491 (bis SZH) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
MäuseNCIN/AMännlich 20-30 Gramm; praktisch jeder Stamm sollte vergleichbare Ergebnisse liefern.
HEPESAmerican BioanalyticalAB00892
NatriumchloridJ.T. Baker3624-05
KaliumchloridJ.T. Baker3040-01
MagnesiumchloridSigmaM-8266
CalciumchloridFischerC79
DextroseJ.T. Baker1916-01
L-GlutaminSigmaG-8540
Minimum Eagle's Medium nicht-essentielle AminosäuremischungGibco11140-050
NatriumhydroxidEMSX0593
RinderserumalbuminSigmaA7906
KollagenaseWorthington4188
Sojabohnen-Trypsin-InhibitorSigmaT-9003
KohlendioxidMatheson Gas124-38-9
125 ml Erlenmeyer KunststoffkolbenCrystalgen26-0005
DissektionssetFine Science Tools14161-10
70% EthanolLabChemLC222102
P1000, P100, P10 PipettenGilsonFA10005P
WägeschiffchenHeathrow ScientificHS1420A
Transferpipetten aus KunststoffUSA Scientific1020-2500
15 ml konische RöhrchenBD Falcon352095
50 ml konische RöhrchenBD Falcon352070
1,5 ml MikrozentrifugenröhrchenFisher05-408-129
0,65 ml MikrozentrifugenröhrchenVWR20170-293
22 x 22 mm GlasdeckgläserFisher032811-9
SalpetersäureFischerA483-212
SalzsäureFischerA142-212
Deionisiertes WasserN/AN/A
18 x 18 mm DeckgläserFischer021510-9
LaborfolieParafilmPM-996
Fluo-4AMInvitrogenF14201
DimethylsulfoxidSigmaD2650
Luer-LockBecton Dickinson932777
60 ml SpritzeBD BioscienceDG567805
23 ¾ ManometernadelBD Bioscience9328270
PE50 SchlauchClay AdamPE50-427411
Schlitzschraubendreher N/AN/A
DMEM F-12, ohne PhenolrotGibco21041-025
30,5-Gauge-NadelBD Bioscience305106
5 CC SpritzeBD Bioscience309603
25 ml ErlenmeyerkolbenFischerFB50025
Nylon-Netzfilter Nitex03-150/38150 μm Porengröße
48 Well GewebekulturplatteCostar3548
96 Well Gewebekulturplatte Costar3795
6 Well GewebekulturplatteCostar3506
FlüssigstickstoffMatheson Gas7727-37-9
Zytotoxizitäts-Assay-KitPromegaG1782
Adeno-GFPN/AN/AGeschenk von J. Williams
Equipment
Ringständer mit KlemmenUnited ScientificSET462
PerifusionskammerN/AN/AEntworfen von S.Z.H und Kollegen an der Yale University
VakuumlinieManostat72-100-000
Wasserbad mit ShakerPrecision Scientific51220076
KonfokalmikroskopZeissLSM 710
BioTek Synergy H1 PlattenleserBioTek11-120-534
GewebekulturhaubeNuaireNU-425-600
Gewebekultur-InkubatorThermo3110

Referenzen

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