Humanen Cytomegalovirus (HCMV)-Infektion des Neugeborenen stellt eine wichtige Ursache für geistige Behinderung, aber die molekularen Ereignisse, die zum Virus-induzierten Pathogenese sind noch weitgehend unverstanden. Um die Dynamik der Infektion des Gehirns zu untersuchen, passten wir Ganzkörper-Tier In vivo Bildgebung durchführen Zeitverlauf Analyse der Neugeborenen mit einem Luciferase-rekombinanten Virus infiziert.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Humanen Cytomegalovirus (HCMV oder HHV-5) ist eine lebensbedrohliche Erreger in immungeschwächten Personen. Upon angeborenen oder neonatalen Infektion, kann das Virus infizieren und zu replizieren in das sich entwickelnde Gehirn, die schweren neurologischen Schäden, einschließlich Taubheit und geistige Retardierung induzieren, kann. Ein Hindernis für die Schwere der Symptome, die therapeutischen Möglichkeiten der Nichtverfügbarkeit eines Impfstoffs und das Fehlen eines spezifischen antiviralen Therapie begrenzt. Weiterhin ist ein genaue Beschreibung der molekularen Ereignisse vorkommenden während der Infektion des zentralen Nervensystems-System (CNS) noch fehlt seit Beobachtungen meist aus dem Autopsie der infizierten Kinder abzuleiten. Mehrere Tiermodellen, wie Rhesusaffen CMV, wurden entwickelt und lieferte wichtige Einblicke in CMV Pathogenese im ZNS. Doch trotz seiner evolutionären Nähe mit Menschen wurde dieses Modell durch den intrakraniellen Impfung Verfahren verwendet werden, um die Tiere und Nachteile infizieren begrenztistently induzieren ZNS-Infektion. Darüber hinaus haben ethische Überlegungen die Entwicklung alternativer Modelle gefördert, unter denen Neugeborenen Infektion von neugeborenen Mäusen mit Maus Cytomegalovirus (MCMV) hat vor kurzem zu bedeutenden Fortschritten geführt. Zum Beispiel wurde berichtet, dass intraperitoneale Injektion von MCMV in Balb / c Neugeborenen zur Infektion von Neuronen und Gliazellen in bestimmten Bereichen des Gehirns führt. Diese Befunde legen nahe, dass die experimentellen Impfung von Mäusen könnten die Defizite durch HCMV-Infektion bei Kindern induziert rekapitulieren. Dennoch ist eine dynamische Analyse der MCMV Infektion von Neugeborenen schwierig durchzuführen, weil klassische Methodik erfordert das Opfer einer erheblichen Anzahl von Tieren zu unterschiedlichen Zeitpunkten, um die virale Belastung und / oder immun-Parameter zu analysieren. Um diesen Engpass zu umgehen und künftigen Untersuchungen von seltenen mutierten Tiere zu ermöglichen, verwendeten wir in vivo Imaging-Technologie, um eine Zeit-Gänge Analyse der vira durchführenl Verbreitung im Gehirn bei peripherer Injektion eines rekombinanten MCMV Luciferase zu C57BL / 6 Neugeborenen.
Einleitung
Menschliches Cytomegalovirus (HCMV/HHV-5) ist ein Mitglied der β-Herpesvirus-Familie. HCMV ist eine sehr weit verbreitete, opportunistische Erreger, die normalerweise während der frühen Leben als asymptomatische Infektion 1 erworben. Wie alle Herpesviren bleibt HCMV über die gesamte Lebensdauer des Wirts, deren Immunsystem dicht steuert virale Replikation. Folgen der viralen Reaktivierung meist bei immungeschwächten Personen wie Transplantation Patienten, die Medikamente zur Verhinderung der Abstoßung von 2 auftreten. Bei Erwachsenen wurde HCMV auch Glioblastome 3 in Verbindung gebracht worden. Darüber hinaus ist HCMV ein prominenter ....
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Protokoll
1. Herstellung von Viral Suspension
- Besorgen Sie sich die Smith Stamm von MCMV Ausdruck Luciferase (MCMV-Luc 15) von Ulrich Koszninowski Labor. In diesem rekombinanten wird die Luciferase-Gens in der ie2 Ort der MCMV-Genoms inseriert.
- Um MCMV-Luc verstärken, infizieren murinen Knochenmark Stroma-Zelllinie (M2-10B4, ATCC # CRL-1972) mit MCMV bei unterschiedlichen Multiplizität der Infektion (MOI, 0,001 bis 1) 16. Dazu hinzuzufügen Virus kultivierten Zellen in serumfreiem Medium bei 37 ° C. Nach einer Stunde, den Überstand entfernen und ersetzen Sie es mit DMEM mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) ergänzt. Fünf Tage spät....
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Ergebnisse
Ein repräsentatives Experiment ist in Abbildung 1 dargestellt. Upon intraperitoneale Injektion von 50 PFUs von MCMV-Luc (Das Bedienfeld A zeigt eine ähnliche Injektion mit Methylene blau durchgeführt, um die subkutane Route der der Nadel visualisieren), waren Neugeborenen anästhesiert und empfangenen gleichzeitig 0,3 mg des Luciferase-Substrat (Luciferin, Caliper). Fünfzehn Minuten später wurden die Tiere Bauchseite nach oben in den Erwerb Kammer des IVIS 50 (In-vivo-Imaging System, Caliper) und das Lic.......
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Diskussion
Mit In-vivo-Imaging-Technologie MCMV-Luc Verbreitung in Mäusen Neugeborenen zu überwachen, waren wir in der Lage, die Ausbreitung des Virus in das Gehirn von mutierten Tieren, wie zum Wildtyp Gegensatz zu beobachten. Weitere Präparation des Tieres und ex vivo Bildgebung des Gehirns bestätigte die Anwesenheit von Lumineszenz-Virus in das zentrale Nervensystem. Darüber hinaus haben wir auch durchgeführt Immunhistochemie (nicht gezeigt) auf Gehirn dünne Abschnitte mit einem Antikörper spezifisch für MCMV .......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanzielles Interesse.
Ethik-und Verlustrechnung
Die Tiere wurden unter pathogen-freien Bedingungen in der Tierpflege Anlage des Institut d'Immunologie et d'Hématologie gepflegt. Handhabung von Mäusen und experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Französisch Gesetz zum Schutz von Labortieren durchgeführt. Das Verfahren wurde durch den Dienst VETERINAIRE de la Préfecture du Bas-Rhin (Frankreich) unter der Zulassungsnummer A-67-345 genehmigt.
Danksagungen
Wir danken Lee Tuddenham (IBMC, Straßburg) zum Verstärken und Titration MCMV-Luc und Thomas Baumert (INSERM U748, Strasbourg) für die Erlaubnis, die Tierhaltung des Instituts für Virologie verwenden. Finanzielle Unterstützung von INSERM, Université de Strasbourg und Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-MIEN-005-01) anerkannt wird. Die anfängliche Beteiligung von Sonia Beroud und Laetitia Lelieur während ihres Master-Projekt wird auch anerkannt.
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Materialien
Equipment
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Reagenz/Material | |||
| DMEM | Fisher Scientific | W3523A | |
| Methylenblau | Sigma Aldrich | 319112 | |
| Insulinnadeln | VWR | 613-4897 | |
| Ketamin | CentraVet | Ket 201 | |
| Xylazin/Vetranal | Sigma Aldrich | 46995 | |
| DPBS | DUTSCHER | P0436500 | |
| Luciferin | Caliper | 760504 | |
| Gentamycin | Sigma Aldrich | G1272 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| Carboxymethylcellulose | Sigma Aldrich | C4888 | |
| Formaldehyd | Sigma Aldrich | F8775 | |
| crystal violet | Sigma Aldrich | C3886< | |
| IVIS 50 | Caliper/Perkin Elmer |
Referenzen
- Loewendorf, A., Benedict, C. A. Modulation of host innate and adaptive immune defenses by cytomegalovirus: timing is everything. J. Intern. Med. 267, 483-501 (2010).
- Lischka, P., Zimmermann, H. Antiviral strategies to combat cy....
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Nachdrucke und Genehmigungen
