Humanen Cytomegalovirus (HCMV)-Infektion des Neugeborenen stellt eine wichtige Ursache für geistige Behinderung, aber die molekularen Ereignisse, die zum Virus-induzierten Pathogenese sind noch weitgehend unverstanden. Um die Dynamik der Infektion des Gehirns zu untersuchen, passten wir Ganzkörper-Tier In vivo Bildgebung durchführen Zeitverlauf Analyse der Neugeborenen mit einem Luciferase-rekombinanten Virus infiziert.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Humanen Cytomegalovirus (HCMV oder HHV-5) ist eine lebensbedrohliche Erreger in immungeschwächten Personen. Upon angeborenen oder neonatalen Infektion, kann das Virus infizieren und zu replizieren in das sich entwickelnde Gehirn, die schweren neurologischen Schäden, einschließlich Taubheit und geistige Retardierung induzieren, kann. Ein Hindernis für die Schwere der Symptome, die therapeutischen Möglichkeiten der Nichtverfügbarkeit eines Impfstoffs und das Fehlen eines spezifischen antiviralen Therapie begrenzt. Weiterhin ist ein genaue Beschreibung der molekularen Ereignisse vorkommenden während der Infektion des zentralen Nervensystems-System (CNS) noch fehlt seit Beobachtungen meist aus dem Autopsie der infizierten Kinder abzuleiten. Mehrere Tiermodellen, wie Rhesusaffen CMV, wurden entwickelt und lieferte wichtige Einblicke in CMV Pathogenese im ZNS. Doch trotz seiner evolutionären Nähe mit Menschen wurde dieses Modell durch den intrakraniellen Impfung Verfahren verwendet werden, um die Tiere und Nachteile infizieren begrenztistently induzieren ZNS-Infektion. Darüber hinaus haben ethische Überlegungen die Entwicklung alternativer Modelle gefördert, unter denen Neugeborenen Infektion von neugeborenen Mäusen mit Maus Cytomegalovirus (MCMV) hat vor kurzem zu bedeutenden Fortschritten geführt. Zum Beispiel wurde berichtet, dass intraperitoneale Injektion von MCMV in Balb / c Neugeborenen zur Infektion von Neuronen und Gliazellen in bestimmten Bereichen des Gehirns führt. Diese Befunde legen nahe, dass die experimentellen Impfung von Mäusen könnten die Defizite durch HCMV-Infektion bei Kindern induziert rekapitulieren. Dennoch ist eine dynamische Analyse der MCMV Infektion von Neugeborenen schwierig durchzuführen, weil klassische Methodik erfordert das Opfer einer erheblichen Anzahl von Tieren zu unterschiedlichen Zeitpunkten, um die virale Belastung und / oder immun-Parameter zu analysieren. Um diesen Engpass zu umgehen und künftigen Untersuchungen von seltenen mutierten Tiere zu ermöglichen, verwendeten wir in vivo Imaging-Technologie, um eine Zeit-Gänge Analyse der vira durchführenl Verbreitung im Gehirn bei peripherer Injektion eines rekombinanten MCMV Luciferase zu C57BL / 6 Neugeborenen.
Einleitung
Menschliches Cytomegalovirus (HCMV/HHV-5) ist ein Mitglied der β-Herpesvirus-Familie. HCMV ist eine sehr weit verbreitete, opportunistische Erreger, die normalerweise während der frühen Leben als asymptomatische Infektion 1 erworben. Wie alle Herpesviren bleibt HCMV über die gesamte Lebensdauer des Wirts, deren Immunsystem dicht steuert virale Replikation. Folgen der viralen Reaktivierung meist bei immungeschwächten Personen wie Transplantation Patienten, die Medikamente zur Verhinderung der Abstoßung von 2 auftreten. Bei Erwachsenen wurde HCMV auch Glioblastome 3 in Verbindung gebracht worden. Darüber hinaus ist HCMV ein prominenter Erreger für Neugeborene mit unreifen Immunität 4-6. Die primäre Infektion in den sich entwickelnden Fötus oder Neugeborenen kann schwerwiegende Folgen haben. HCMV-Infektion ist die häufigste infektiöse Ursache der angeborenen Missbildungen und Störungen im Kindesalter in den entwickelten Ländern. Es wird geschätzt, dass die Inzidenz von Neugeborenen HCMV-Infektion 0,5-1% o wirktf alle Lebendgeburten unter denen 5-10% von schweren Symptomen wie Mikrozephalie oder Kleinhirnhypoplasie leiden. Darüber hinaus werden 10% der infizierten Säuglinge mit subklinischen Virusinfektion später entwickeln Folgeerscheinungen führt zu mentaler Retardierung, Hörverlust, Sehstörungen oder Beschlagnahme und Epilepsie 7,8.
Im Gegensatz zu anderen humanen Herpesviren wie Herpes Simplex 1 (HSV-1/HHV-1), die Mäuse über verschiedene Wege der Einspritzung 9 geimpft werden kann, ist im Gegensatz Cytomegalovirus-Replikation artspezifisch. Diese Funktion wurde stark Untersuchungen von HCMV Pathogenese, die in verschiedenen Tiermodellen durchgeführt behindert werden (Maus, Ratte, Meerschweinchen, Rhesusaffen) sowie ihre jeweiligen echten Host-spezifische CMVs. Alle CMVs signifikante Ähnlichkeiten in der Genom-Größe und Organisation, Gewebetropismus und Regulation der Genexpression. Sie induzieren auch ähnliche Pathologien in ihren jeweiligen Gastgeber. Trotz genomischen Vielfalt seinzwischen HCMV-und Maus-Cytomegalievirus (MCMV) (50% der ORFs im menschlichen Virus im murinen CMV identifiziert) hat die Mausmodell kürzlich als vorteilhaft erwiesen, vor allem, weil Mutanten können auf ihre Fähigkeit, virale Kontrolle getestet werden Replikation in vivo. Dies hat zu einer genetischen Bildschirm, die eine Abschätzung der Zahl der Gene der Maus an der erwachsenen Stadium ausgedrückt, die die "resistome" gegen dieses Virus 10 komponieren aktiviert führte. Insgesamt bedeutet dies, dass MCMV-infizierten Mäuse stellen ein attraktives Modell für die Untersuchung von Wirt-Virus-Interaktionen bei Erwachsenen. Die Erforschung der angeborenen CMV-Infektion ist komplexer, weil Unterschiede in der Plazenta Schicht Organisation zwischen Mensch und Maus beeinträchtigen die Mutter-Fötus Übertragung des viralen Infektion in Mäusen. Vor kurzem hat die direkte Injektion von MCMV in der Plazenta an Tag 12,5 der Trächtigkeit Gehirninfektion von Mäusen Neugeborenen, die zu Hörschäden 11 geführt aktiviert. Allerdings sind die meisten investigations jetzt intraperitoneale Injektion von 4-20 hr-alten Neugeborenen auf eine systemische virale Verbreitung potenziell zu hämatogene Infektion des Gehirns, ein Modell, das mehr relevant als die eines intrakraniellen Injektion geben. Dieses Protokoll die wichtige Hinweise auf CMV Pathogenese und insbesondere, dass es MCMV Infektion von Neugeborenen Ergebnisse der viralen Replikation in neuronalen und glialen Zellen in Entzündungsherde, die mit mononukleären Zellen wie Makrophagen infiltriert 12 befinden gezeigt. Dieser Bericht ist auch verändert Morphogenese des Kleinhirns mit verminderter körnige Neuron Proliferation und Migration und die Induktion von Interferon-stimulierten mehrere Gene begleitet beschrieben. Die wesentliche Rolle von CD8 +-T-Zellen zur Kontrolle der MCMV in das zentrale Nervensystem wurde auch von der gleichen Gruppe 13 gemeldet. Ein wichtiger Aspekt bei der Analyse der pathologischen Wirkung einer Mikrobe ist die Dynamik des infizierenion. Im Falle von MCMV, ist es besonders wichtig zu erforschen und zu quantifizieren, das Fortschreiten der viralen Verbreitung in die sich entwickelnde Gehirn, um zu verstehen und zu antizipieren Umfangs des zukünftigen neurobiological Verletzungen. Traditionell erfordert die Quantifizierung der Progression einer Infektion das regelmäßige Opfer der infizierten Tiere den Erreger in Geweben wie dem Gehirn, die sonst nicht zugänglich sind titrieren. Diese Art von Protokoll ist nun durch notwendige Verbesserung des Tierschutzes und der 3R (Reduce, Refine, Replace) 14 Prinzipien in Frage gestellt. Mit In-vivo-Imaging-Technologien gestatten eine drastische Reduzierung der Zahl der Tiere, die notwendig sind, in vivo Infektion Experimente. Hier berichten wir und beschreiben eine zeitliche Verlauf Analyse der viralen Verbreitung in das Gehirn auf intraperitoneale MCMV-Luc Injektion Maus Neugeborenen. Mit den gleichen Tieren, verfolgt und überwacht werden wir in vivo die Websites der intensiven viral Replikation während einer 2-Wochen-Frist.
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Protokoll
1. Herstellung von Viral Suspension
- Besorgen Sie sich die Smith Stamm von MCMV Ausdruck Luciferase (MCMV-Luc 15) von Ulrich Koszninowski Labor. In diesem rekombinanten wird die Luciferase-Gens in der ie2 Ort der MCMV-Genoms inseriert.
- Um MCMV-Luc verstärken, infizieren murinen Knochenmark Stroma-Zelllinie (M2-10B4, ATCC # CRL-1972) mit MCMV bei unterschiedlichen Multiplizität der Infektion (MOI, 0,001 bis 1) 16. Dazu hinzuzufügen Virus kultivierten Zellen in serumfreiem Medium bei 37 ° C. Nach einer Stunde, den Überstand entfernen und ersetzen Sie es mit DMEM mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) ergänzt. Fünf Tage später, ernten das Kulturmedium und speichern Aliquots bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
- Titration des viralen Suspension durch Plaque-Assay.
- Split-3T3-Zellen (ATCC # CRL-1658) in einer Platte mit 24 Vertiefungen mit 40.000 Zellen / Vertiefung in 1 ml DMEM mit 10% FCS enthält, Penicillin (200 IU / ml) und steptomycin (200 mg / ml ergänzt) Und Inkubation 24 h bei 37 ° C.
- Bereiten Reihenverdünnungen (10 -1 bis 10 -8) eines Aliquots MCMV Suspension in DMEM und infizieren Zielzellen (3T3) mit 200 ul einer Verdünnung nach dem Entfernen Zellkulturmedium. Inkubieren Sie 1 hr bei 37 ° C. 1 ml der oben Medium (DMEM 3% FCS, 2% (v / v) Gentamycin, 200 IU / ml Penicillin, 200 mg / ml Streptomycin, 8 g / l Carboxymethylcellulose) und Inkubation 5 Tagen bei 37 ° C.
- Befestigen Sie die Zellen durch Zugabe von 200 ul 10% Formaldehyd (Verdünnung von Formaldehyd mit Wasser sollte in einer chemischen Haube zu toxischen Inhalationen vermeiden geschehen) in jede Vertiefung und Inkubation 6 h bei Raumtemperatur. Entfernen Kulturmedium + Fixateur durch Pipettieren aus und fügen Sie 200 ul Zelle Färbelösung (1% Kristallviolett (w / v) in 20% Ethanol). Vor Gebrauch verdünnen 1 Teil mit 9 Teilen Milli-Q-Wasser. Inkubation 2 min bei Raumtemperatur, waschen Sie die Platte 3-4x durch Einweichen in Wasser, trocknen lassen und zählen die Anzahl der Plaques mit einem Fernglas.
- verdünnen MCMV-Luc in DMEM bis 50 PFUs in 50 ul erhalten und lassen auf Eis bis zur weiteren Verwendung. Mit höheren viralen Impfkulturen induziert Letalität bevor die Neugeborenen 2-3 Wochen alt zu erreichen. Nach unserer Erfahrung induzieren 500 PFUs Letalität in alle Neugeborenen 5-7 Tage nach der Injektion.
2. Die Injektion von Neugeborenen
- Wenn neonates (4 bis 20 hr-alten Mäusen) verfügbar sind, zu manipulieren das Katzenklo und den Kot des Käfigs mit Handschuhen, bevor sorgfältig den Umgang mit den pups um eine Kontamination mit "fremden" Gerüche, die die Mutter betonen, würde und induzieren die Ablehnung der pups zu vermeiden .
- Führen Sie ein intraperitoneale Injektion unter Verwendung von eine Insulin-Spritze (29 G) wie in Fig. 1A gezeigt. Halten Sie die Neugeborenen mit der dorsalen Haut. Mit Bauchseite up, Einführung der Nadel unter dem Vorderbein und drücken Sie sie vorsichtig subkutan in die Bauchhöhle (ein wenig unter dem Nabel) zu erreichen. Wir haben derzeit injizieren 1% Methylenblau in DPBS verdünnt und zu überwachen, um Überleben practice die Technik, bevor Virusinfektionen. Da Methylenblau ist deutlich sichtbar beim Einspritzen, empfehlen wir die Durchführung dieses "Training" injection erste ordnungsgemäße Lieferung der viralen Suspension in der Bauchhöhle zu gewährleisten.
- Beseitigen Sie die winzigen Tropfen Blut, die auftreten können und legen Sie die Neugeborenen in den Käfig zurück.
3. In vivo Imaging
- Am Tag 7, behandeln die Neugeborenen mit dem gleichen Vorsichtsmaßnahmen wie zuvor erwähnt. Spritzen intraperitoneal eine Mischung von Anästhetika (4 mg / ml Ketamin, 0,8 mg / ml Xylazin) und Luciferin (0,15 mg / g Körpergewicht) in 50 ul in jedem Tier. Durchschnittliche Körpergewicht der Tiere beträgt 1-2 g und die Dosis von Anästhetika pro Tier ist: Ketamin 40 ug, Warten Xylazin 8 ug 12-15 min bis Luciferin erreicht ihr Maximum der Emission. Dies hat zu bestimmen vorher und hängt von der Luciferin-Provider und dem Abbildungssystem verwendet wird.
- Während die pups sind anesthetized, markieren Sie sie für zukünftige Identifizierung und ernten ein kleines Stück Gewebe, das dann für zukünftige Genotypisierung kann verwendet werden, wenn mutierten Tiere verwendet werden.
- Legen Sie die Welpen in der Imaging-System und führen Erwerb des Lichts durch den ganzen Körper emittiert. Sieben Tage nach der Infektion ist das Virus in zahlreichen Kopien in Zielorganen wie Leber, Nieren, Lungen und Speicheldrüsen repliziert, weshalb die Dauer der Exposition sollte kurz sein. In unserem Fall, führen wir den Erwerb für 10 bis 20 Sekunden (Abbildung 1B). Die Plattform für den Erwerb Kammer des bildgebenden Gerät muss erhitzt werden, um zu starke Abkühlung der Körpertemperatur von betäubten Tieren zu vermeiden. In Zusätzlich, ist es hilfreich, um Bilder mit niedriger Auflösung von mehrere Tiere innerhalb einer Runde des Erwerbs erhalten, und dann, bewegen Sie up die Plattform näher an der Kamera Linse in, um auf der einen Teil einer bestimmten Tier oder in einen isoliertes Organ im Anschluss an dissection zu konzentrieren. Die Software muss ermöglichen schnelle Änderungenvon den Parametern (Belichtungszeit, Entfernung sample / Linse Empfindlichkeit), Quantifizierung von definierten Bereichen von Interesse und zukünftige Übertragungen von Schnappschuss-Bildern.
- To Licht Signal aus dem Kopf nur erwerben,, decken Sie den Körper von den Neugeborenen liegend seitlich mit einer dicken, dunkel Papier, das den Photonen auf der Ebene der den Organen, wo hohe virale Replikation tritt auf, (Leber, Lunge, Speicheldrüsen) emittierten maskieren wird und führen Sie Akquisition für 5 bis 10 min (Abbildung 1C). Führen Übernahme der gegenüberliegenden Seite des Tieres in den gleichen Bedingungen.
- Reintroduce die Welpen in den Käfig und legen Sie eine Wärmelampe auf eine zu starke Abkühlung der narkotisierten Neugeborenen zu vermeiden. Regelmäßig überwachen post-Anästhetikum Genesung. Mit der angegebenen Dosis, Anästhesie aktuell dauert 30 min.
- Wiederholen Sie den Vorgang an den Tagen 9, 11 und 14. An den Tagen, 11 und 14, ändern Sie die Dosis von Anästhetika (6 mg / ml Ketamin, 1.2 mg / ml Xylazin).
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Ergebnisse
Ein repräsentatives Experiment ist in Abbildung 1 dargestellt. Upon intraperitoneale Injektion von 50 PFUs von MCMV-Luc (Das Bedienfeld A zeigt eine ähnliche Injektion mit Methylene blau durchgeführt, um die subkutane Route der der Nadel visualisieren), waren Neugeborenen anästhesiert und empfangenen gleichzeitig 0,3 mg des Luciferase-Substrat (Luciferin, Caliper). Fünfzehn Minuten später wurden die Tiere Bauchseite nach oben in den Erwerb Kammer des IVIS 50 (In-vivo-Imaging System, Caliper) und das Lic...
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Diskussion
Mit In-vivo-Imaging-Technologie MCMV-Luc Verbreitung in Mäusen Neugeborenen zu überwachen, waren wir in der Lage, die Ausbreitung des Virus in das Gehirn von mutierten Tieren, wie zum Wildtyp Gegensatz zu beobachten. Weitere Präparation des Tieres und ex vivo Bildgebung des Gehirns bestätigte die Anwesenheit von Lumineszenz-Virus in das zentrale Nervensystem. Darüber hinaus haben wir auch durchgeführt Immunhistochemie (nicht gezeigt) auf Gehirn dünne Abschnitte mit einem Antikörper spezifisch für MCMV ...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanzielles Interesse.
Ethik-und Verlustrechnung
Die Tiere wurden unter pathogen-freien Bedingungen in der Tierpflege Anlage des Institut d'Immunologie et d'Hématologie gepflegt. Handhabung von Mäusen und experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Französisch Gesetz zum Schutz von Labortieren durchgeführt. Das Verfahren wurde durch den Dienst VETERINAIRE de la Préfecture du Bas-Rhin (Frankreich) unter der Zulassungsnummer A-67-345 genehmigt.
Danksagungen
Wir danken Lee Tuddenham (IBMC, Straßburg) zum Verstärken und Titration MCMV-Luc und Thomas Baumert (INSERM U748, Strasbourg) für die Erlaubnis, die Tierhaltung des Instituts für Virologie verwenden. Finanzielle Unterstützung von INSERM, Université de Strasbourg und Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-MIEN-005-01) anerkannt wird. Die anfängliche Beteiligung von Sonia Beroud und Laetitia Lelieur während ihres Master-Projekt wird auch anerkannt.
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Materialien
Equipment
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Reagenz/Material | |||
| DMEM | Fisher Scientific | W3523A | |
| Methylenblau | Sigma Aldrich | 319112 | |
| Insulinnadeln | VWR | 613-4897 | |
| Ketamin | CentraVet | Ket 201 | |
| Xylazin/Vetranal | Sigma Aldrich | 46995 | |
| DPBS | DUTSCHER | P0436500 | |
| Luciferin | Caliper | 760504 | |
| Gentamycin | Sigma Aldrich | G1272 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| Carboxymethylcellulose | Sigma Aldrich | C4888 | |
| Formaldehyd | Sigma Aldrich | F8775 | |
| crystal violet | Sigma Aldrich | C3886< | |
| IVIS 50 | Caliper/Perkin Elmer |
Referenzen
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