Methodenartikel

RNAi-vermittelte Gene Knockdown Doppelzimmer und Gustatorisch Perception Measurement in Honey Bees (

DOI:

10.3791/50446

⸱

25. Juli 2013

 ,  , 
1School of Life Sciences, Arizona State University , 2Department of Chemistry, Biotechnology, and Food Science, Norwegian University of Life Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In diesem Protokoll beschreiben wir zwei Strategien, die gleichzeitig zwei Gene unterdrücken (doppelte Gen Knockdown) in Honigbienen. Dann präsentieren wir, wie die Rüssel extension response (PER) Test, um die Wirkung der doppelten Gen Knockdown auf Honigbiene geschmacklichen Wahrnehmung studieren verwenden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Video zeigt neue Techniken der RNA-Interferenz (RNAi), die zwei Gene gleichzeitig herunterreguliert in Honigbienen mit doppelsträngigen RNA (dsRNA) Injektionen. Es stellt auch ein Protokoll der Rüssel extension response (PER) Assay zur Messung geschmacklichen Wahrnehmung.

RNAi-vermittelte Gene Knockdown ist eine effektive Technik Herunterregulieren Ziel Genexpression. Diese Technik ist in der Regel für einzelne Genmanipulation verwendet, aber es hat seine Grenzen Wechselwirkungen und gemeinsame Wirkung von Genen nachzuweisen. Im ersten Teil dieses Video präsentieren wir zwei Strategien gleichzeitig niederzuschlagen zwei Gene (so genannte Doppel-Gen Knockdown). Wir zeigen beide Strategien sind in der Lage, effektiv zu unterdrücken zwei Gene, Vitellogenin (vg) und Ultraspiracle (usp), die in einer regulatorischen Rückkopplungsschleife sind. Diese doppelte Gen Knockdown Ansatz kann verwendet werden, um Zusammenhänge zwischen Genen sezieren und kann leicht in angewendet werdenverschiedene Insektenarten.

Der zweite Teil dieses Videos ist eine Demonstration der Rüssel extension response (PER)-Assay in Honigbienen nach der Behandlung von Doppel-Gen Knockdown. Die PER-Assay ist ein Standard-Test zur Messung geschmackliche Wahrnehmung in Honigbienen, die ein wichtiger Prädiktor für wie schnell eine Honigbiene Verhaltens Reifung ist. Größere Geschmacks Wahrnehmung Nest Bienen zeigt erhöht Verhaltensstörungen Entwicklung, die oft mit einem früheren Alter bei Beginn der Futtersuche und Futtersuche Spezialisierung in Pollen assoziiert ist. Darüber hinaus können pro Test angewendet, um metabolische Zustände der Sättigung oder Hunger in Honigbienen zu identifizieren. Schließlich PER-Assay mit verschiedenen Paarung Geruch Reize für die Konditionierung die Bienen auch weit verbreitet ist für Lernen und Gedächtnis in Studien Honigbienen kombiniert verwendet.

Einleitung

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RNA-Interferenz (RNAi) RNA ist auf post-transkriptionale Gen-Silencing, das in einer Vielzahl von eukaryotischen Organismen auftritt. Verfahren nach RNAi durch endogene oder exogene doppelsträngige RNA (dsRNA)-Vorstufen ausgelöst. Die dsRNA aktiviert das Protein Ribonuclease Dicer bindet und spaltet die dsRNA zu kleine Fragmente (20-25 bp). Dann werden die kleinen Fragmenten der dsRNA Führung eine Erkennung und Spaltung der komplementären mRNAs durch argonaute Proteine ​​eine katalytische Komponente des RNA-induced silencing complex (RISC) 1. Bei Säugetieren aktivieren dsRNAs länger als 30 nt, eine antivirale Reaktion (Interferon-Antwort, IFN), die unspezifische Abbau von RNA-Transkripte 2 führt. Allerdings haben lange dsRNAs als wirksam erwiesen und spezifische in Insekten, da ein Mangel an diesem IFN 3.

Lange dsRNAs haben Herunterregulation der Zielgene wurde in verschiedenen Insektenarten verwendet. Honigbienen sind eine der pionEER Insekten Organismen, in denen viele wichtige Funktionen der Gene in der Entwicklung und das Verhalten haben mit dsRNA 4,5 offenbart worden. Mehrere dsRNA Versandmethoden haben in Honigbienen durchgeführt: dsRNA Fütterung effizient herunterreguliert Ziel Genexpression in Honigbienenlarven 6, während dsRNA Injektion ist ein wirksamer Ansatz für die Gen-Knockdown in Honigbiene Embryonen 4 und erwachsenen Bienen 7,8.

Gene Knockdown durch das Aufbringen von dsRNA Insekten ausgestellt sind vorübergehend und lokalisiert. Studien haben gezeigt, dass beide Bauch dsRNA Injektionen und Brust-dsRNA Injektionen wirksam unterdrücken Ziel Genexpression in Bauchfett Körperzellen von Insekten 9,10. DsRNA in Bauch-und Brusthöhle und fetten Körper Zellen injiziert sind in der Lage, sich der dsRNA aus der Hämolymphe, wo die Zellen 10 gebadet werden. Allerdings können Gene in anderen Organen, wie Eierstöcke und Gehirn, nicht entweder gezieltBauch-oder Brust-Injektionen. Um Gene in Honigbiene Gehirn zielen, hat Gehirn Injektion von dsRNA auch durchgeführt worden, die effektiv beeinflusst Zielgenexpression in lokalen Hirnareale 11. Hier haben wir nur dokumentieren Bauch dsRNA Injektion, die häufiger verwendet wird, ist bei erwachsenen Bienen.

RNAi wurde in erster Linie verwendet, um ein einzelnes Gen gezielt und ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Genfunktion zu offenbaren. Allerdings ist jedes Gen nicht isoliert von den anderen, es ist in komplexen regulatorischen Netzwerke. Ein Schlüssel für einen biologischen Prozess zu verstehen ist, sezieren, wie Gene miteinander, die eine gleichzeitige Manipulationen von mehreren Genen, anstatt ein einzelnes Gen Knockdown erfordert interagieren. In Säugerzellen, haben Wissenschaftler in gleichzeitig hemmen zwei oder drei Gene mithilfe Delivery-Systeme 12 oder multi-microRNA (miRNA) Haarnadel Designs 13 gelungen. Aber in Insekten, sind mehrere Gen Niederschlägen noch ungetestet. Hier presen wirt verschiedene Injektions-Strategien, die eine doppelte Gen Knockdown erreichen können. Wir haben das Ziel zwei Gene: vitellogenin (VG), die eine Vorläufer-Protein kodiert, Eigelb und Ultraspiracle (USP), die eine putative Rezeptor für Juvenilhormon (JH) codiert und als ein Transkriptionsfaktor Vermittlung antwortet JH 14 in Honigbienen dienen. Vg und JH regulieren sich gegenseitig in einer Rückkopplungsschleife 15 und sind in Honigbiene Verhaltensregulation 9 beteiligt. Mit dem Doppel-Gen Knockdown, entdecken wir stören sowohl Vg und JH Wege, und wie sie gemeinsam beeinflussen Honigbiene Verhalten und Physiologie und wie vg, usp und JH interagieren 9.

Gustatorisch Wahrnehmung ist ein Verhaltens-Prädiktor für die Honigbiene Sozialverhalten 16. In Bezug auf die Entwicklung des Verhaltens, nest Bienen mit hohen geschmacklichen Wahrnehmung behaviorally reifen schnell, und in der Regel Futter früh im Leben und es vorziehen, Pollen sammeln 16,17. Obwohl regulatorische mechanisms zugrunde geschmacklichen Wahrnehmung sind noch unklar, Studien haben gezeigt, dass geschmackliche Wahrnehmung der internen Energiestoffwechsel 9, Hormonausschüttung 18,19 und biogenetische Amin Signalwege 20 verbunden ist. Sowohl Vg und JH sind wichtige hormonellen Regulatoren modulierenden geschmacklichen Wahrnehmung 7,21. Im Labor kann eine Variation der geschmacklichen Wahrnehmung in Honigbienen durch die Prüfung der Rüssel extension response (PER) zu verschiedenen Saccharoselösungen ausgewertet werden. Jede Biene durch Berühren sowohl ihre Antennen mit Wassertröpfchen durch einen aufsteigenden Konzentrationsreihe von 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% Saccharose gefolgt getestet. Eine positive Antwort wird darauf hingewiesen, wenn eine Biene voll streckt ihre Rüssel, wenn ein Tröpfchen von Wasser oder Saccharose zu jeder Antenne berührt wird. Basierend auf der Anzahl der positiven Reaktionen auf der Lösungen kann die geschmackliche Wahrnehmung Ebene der einzelnen 16 bestimmt werden. Jedoch ist die Anwendung der PER nicht auf die Messung begrenzt gustatory Wahrnehmung. Die PRO ist auch eine wirksame Methode, um den metabolischen Zustand der Bienen wie Sättigung gegen Hunger testen. Die Bienen mit mehr Antworten auf Saccharose sind hungriger im Allgemeinen (Wang und Amdam, unveröffentlichte Daten). Darüber hinaus kann die PER Paradigma auch in assoziativen Lernen und Gedächtnis in Honigbienen verwendet werden. In diesem Fall Bienen ausgebildet, um die Gegenwart von Saccharose Wasser mit einem Duft zu assoziieren werden. Wenn die Bienen den Verein zu erfahren, können nur die Anwesenheit des Geruchs eine positive Antwort ohne Rüssel belohnte sie mit dem Saccharose 22,23 evozieren. In diesem Video zeigen wir, wie Sie ausführen PER gustatory Wahrnehmung, die mit vg und usp Doppel Knockdown in einer früheren Studie 9 angeschlossen wurde evaluieren.

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Protokoll

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Teil 1: RNAi-vermittelte doppelte Gen Knockdown

1. dsRNA Synthese

  1. Design-Primer dsRNAs Targeting vg, usp und ein Kontroll-Gen kodiert grün fluoreszierendes Protein (GFP), die nicht in der Honigbiene Genom: Primer wurden mit Online-freie Software Primer3 ( http://frodo.wi.mit.edu/ ) .
  2. dsRNA-Synthese für vg, usp und GFP: Verwendung RiboMax T7-RNA-Produktion-System von Promega für in-vitro-Transkription.
  3. dsRNA Reinigung:
    1. Denaturierung und Renaturierung: Wärme die dsRNA bis 85 ° C für 5 min und abkühlen lassen bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
    2. DNase I Behandlung: add 1 ul DNase I in jeder dsRNA Reaktion und mischen sie durch Schwenken der Röhrchen. Inkubieren für 15 min bei 37 ° C.
    3. In 150 ul Nuklease-freies Wasser und 750 ul TRIzol - LS in jeder Reaktion und vorsichtig mischen sie von inverting die Röhre. Inkubieren der Proben 5 min bei 30 ° C.
    4. In 200 ul Chloroform in jeder Probe. Mischen Sie kräftig für 20 Sekunden. Zentrifugieren Sie die Proben für 15 min bei 12.000 xg bei 4 ° C.
    5. Den Überstand Phase zu jedem neuen Rohr und fügen Sie 500 ul Isopropanol in jedes Röhrchen. Mischen Sie sie durch Invertieren des Röhrchens. Inkubieren des Gemisches für 20 min bei -20 ° C. Zentrifuge für 10 min bei 12.000 xg bei 4 ° C.
    6. Entfernen Sie den Überstand und benutzen 1.000 ul 75% Ethanol, um das Pellet zu waschen. Nach Zentrifugieren der Röhrchen 5 min bei 7.500 xg bei 4 ° C, Luft trocknen die dsRNA Pellet, und verwenden Nuklease freiem Wasser, um das Pellet zu lösen. Um die Wirksamkeit von Gen Down-Regulation zu gewährleisten, sollte die Konzentration dsRNA rund 9 -10 ug / ul sein.

2. dsRNA Bauch-Injection

Für Doppel-Gen Knockdown, gibt es zwei Strategien: 1) einzelne Injektion: mix dsRNA von zwei Genen und inject die Mischung, 2) zweitägigen Injektion: Injektion der ersten dsRNA Targeting ein Gen am ersten Tag, und injizieren das zweite dsRNA in die gleichen Bienen am zweiten Tag.

  1. Gefühlt neu geschlüpfte Bienen in einem 4 ° C Kühlschrank für 1-2 min. Wenn die Bienen immobilisiert sind, montieren Sie 3-4 Bienen parallel auf Petrischalen voller festes Wachs mit Insektennadeln zwischen ihren Bäuchen und thoraces gekreuzt.
  2. Kühlen Sie die Bienen wieder in einem 4 ° C Kühlschrank. Sicherstellen, dass die Bienen sind völlig unbeweglich. Es dauert ca. 1-2 min. Die Bienen aussehen sollte locker. Wenn die Bienen gewellt oder verdreht werden, bedeutet dies, sie zu lang, die vermieden werden sollte gekühlt. Erholung zu viel verursacht hohe Sterblichkeit, vollständige Immobilisierung ist jedoch wichtig, da jede Bewegung erhöht die Größe der Wunde und Mortalität.
  3. Setzen Sie ein Einweg-30 G-Nadel (BD) auf einer micro Hamilton Spritze. Take 3 ul dsRNA und stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblase in der Spritze. Die Nadel wird auf eine Seite des Bauches eingefügt dama vermeidenGing inneren Organe. Drücken Sie den Kolben der Spritze langsam, damit die dsRNA absorbiert werden. Seit dsRNA sehr zähflüssig ist, dauert es 2-3 Sekunden vollständig aus der Spritze ausgeschlossen werden. Nach dem vollständigen Herunterdrücken des Kolbens, lassen Sie die Nadel in die Wunde für 4-5 sek. Beachten Bienen für 3-5 sec nach den Injektionen. Wenn ein Tropfen Hämolymphe Lecks aus der Wunde, entsorgen Sie die Biene.
  4. Verwenden Sie unterschiedliche Farben, um ihre thoraces entsprechend den verschiedenen Behandlungen zu markieren. Zu diesem Zeitpunkt, wenn der einzelne Injektion Strategie wurde verwendet, können die Bienen zurück in eine Kolonie plaziert werden nach 1 Stunde Beobachtung. Wenn jedoch die zwei Tage Injektion Strategie wurde verwendet, nachdem sie mit dem ersten dsRNA injiziert wird, sollte die Bienen in einem Zylinder Maschenkäfig mit Honig auf der Seite zugeführt gebracht und in einem Inkubator bei 34 ° C gehalten werden und 80% Luftfeuchte .
  5. Am zweiten Tag, befolgen Sie die Schritte 2.2 und 2.3, die den Bienen in den Käfigen Mesh Chillen und montieren sie auf Wachsplatten. Führen Injektionen mit dem zweiten dsRNA, wie es ist beschrieBett in Schritt 2.4.
  6. Lassen Sie die Bienen bei Raumtemperatur für 1 Stunde erholen und führen sie in eine Kolonie.

Hinweis: Knockdown Effekte können durch quantitative RT-PCR (qRT-PCR) und Western Blot nachgewiesen werden. Im Allgemeinen variiert Knockdown Wirksamkeit und hängt von vielen Faktoren ab. In unserer Studie kann die doppelte Gen Knockdown von 7 Tagen nach einzelnen Injektionen und zweitägigen Injektionen nachgewiesen werden.

Teil 2: Rüssel extension response (PER) Assay

1. Sammeln Bienen aus dem Bienenstock

Am 6. Tag nach der Injektion, sammeln behandelten Bienen aus der Kolonie ohne Verwendung eines Rauchers. Sammeln Bienen in Metallgitter Zylinder Käfigen. Halten Sie 3 Bienen in jedem Käfig.

2. Montage Bees für PER

Kühlen Sie die Bienen bei 4 ° C bis sie vollständig immobilisiert. Hängen Sie jede Biene vertikal in einem Kunststoffrohr speziell für PRO entwickelt. Halten Sie den Bauch in der Röhre durch using zwei kleine Stücke des Bandes, und halten Sie den Kopf ragte aus dem Rohr. Setzen Sie die Rohre auf einem Gestell mit zwei Reihen von kleinen Kunststoff-Säulen, und weisen jedes Rohr (bee) mit einer ID-Nummer. Dann legen Sie behandelten Bienen auf den Regalen in einen Inkubator (34 ° C und 80% Luftfeuchte) und halten sie in den Inkubator für 2 Stunden.

3. Vorbereiten einer Reihe von Saccharose Water Solutions

Bereiten 0%, 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% und 30% Saccharose Wasser-Lösungen und laden Sie die Lösungen in die Spritzen mit 15-20 G Nadeln.

4. PER Assay

Berühren Sie die Biene die Antenne mit einer Tröpfchengröße von 0% ige Lösung (Wasser) von 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% und 30% Saccharose Wasser-Lösungen verfolgt. Testen Sie alle Bienen zuerst mit Wasser und lassen Sie mindestens zwei Minuten, wie das Intervall zwischen jeder Lösung verwendet wird. Deshalb haben wir in der Regel mindestens 20 Bienen für jeden Versuch. Wenn eine Biene voll streckt ihre Rüssel wird eine positive Reaktion gewertet.

5.Data Management

Fassen Sie die insgesamt positive Antworten für jeden einzelnen für geschmackliche Antwort Punktzahl (GRS). Führen Sie eine geeignete statistische Analyse der Daten.

Teil 3. Gene Knockdown Validierung

Fat Körper sind aus einem anderen Satz von 7 Tage alten Bienen behandelt seziert. Ein Standard TRIZOL Verfahren zur RNA-Extraktion, die von DNase I-Behandlung 24 gefolgt wird. Vg und USP Genexpression durch eine Zwei-Schritt-PCR qRT. Actin analysiert wird als ein Referenz-Gen verwendet werden, da sie stabil Ausdrücke in verschiedenen Geweben hat von Honigbienen. Veröffentlicht Echtzeit-PCR-Primer für vg und USP-Gens sind in diesem Experiment 24 verwendet. Die Daten werden durch Delta-Delta CT-Verfahren 25 analysiert.

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Ergebnisse

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Sowohl die Single-Einspritzung und zwei Tage Injektion Strategien deutlich vg (One-way ANOVA, p <0,001) (Abbildung 2A) und USP (One-way ANOVA, p <0,001) (Abbildung 2B) reduziert Transkripte in Honigbienen Sechs Tage nach der dsRNA injiziert. Die Unterdrückung der usp Transkript mit dem einzigen Injektion mit dsRNA Mischung und die zweitägige Injektion mit vg ersten und zweiten usp (vg / usp) war signifikant niedriger als der zw...

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Diskussion

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Unsere Studie ist der erste Versuch, gleichzeitig niederzuschlagen zwei Gene in erwachsenen Insekten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die beiden Strategien der dsRNA Injektionen (einzelne Injektion und zweitägigen Injektion) für die doppelte effektive Genunterdrückung und gleichzeitig Gen-Silencing von vg und usp sind, können 6 Tage nach der dsRNA Injektionen in Bienen 8,9 getestet werden. Allerdings variiert Gen Knockdown Wirksamkeit in verschiedenen Insektenarten abhängig Transkript Niveau ...

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Offenlegungen

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Wir haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren bedanken sich für die Unterstützung Erin Fennern Experiment danken. Diese Arbeit wurde von der Research Council of Norway (180504, 185306 und 191699), Pew Charitable Trust und dem National Institute on Aging (NIA P01 AG22500) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
GE Healthcare PCR-Beads in 96-Well-PlattenGE Healthcare27-9557-01
QIAquick PCR-AufreinigungskitQiagen28104
RiboMax T7 RNA-ProduktionssystemPromegaP1300
Trizol LSInvitrogen10296028
Chloroform:Isoamylalkohol 24:1Sigma-AldrichC0549
IsopropylalkoholSigma-AldrichI9516
Hamilton MikrospritzeHamilton80301
30G BD EinwegnadelnBD Biosciences305106
SaccharoseSigma-Aldrich84097
1 ml SpritzeBD Biosciences30960
Stereo-DissektionsmikroskopLeica MicrosystemsS6D
InsektenstifteFine Science Tools26000-25
Wachsplatte

Referenzen

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Injektion von doppelstr ngiger RNAProboscis Extension Response AssayVitellogenin Gen KnockdownUltraspiracle Gen KnockdownGenregulation bei HonigbienenReal time PCR AnalyseTesten mit Saccharosel sungRegulation des Juvenilhormons

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