Acquiring Fluoreszenz Zeitraffer-Filme von Bäckerhefe und Analysieren von Einzel-Zell-Dynamics mit Transplantaten

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein einfaches Protokoll zur Fluoreszenzmikroskopie Filme von wachsenden Hefezellen und eine GUI-basierte Software-Paket, um Single-Cell-Zeitreihen extrahieren zu erhalten. Die Analyse umfasst automatisierte Linie und Teilung Zeitzuweisung mit Sichtprüfung und manuelle curation der verfolgten Daten integriert.

Zusammenfassung

Fluoreszenz-Zeitraffer-Mikroskopie hat sich zu einem mächtigen Werkzeug für die Untersuchung vieler biologischer Prozesse auf der Ebene einzelner Zellen. Insbesondere bieten Filme Darstellung der zeitlichen Abhängigkeit der Genexpression Einblick in die Dynamik seiner Regelung, aber es gibt viele technische Herausforderungen zu erhalten und zu analysieren Fluoreszenz Filme von Einzelzellen. Wir beschreiben hier ein einfaches Protokoll mit einem kommerziell erhältlichen Gerät mikrofluidischen Kultur, solche Daten zu erzeugen, und ein MATLAB-basierte, grafische Benutzeroberfläche (GUI)-basierten Software-Paket, um die Fluoreszenz-Bildern zu quantifizieren. Die Software-Segmenten und Spuren Zellen, kann der Benutzer visuell kuratieren Fehler in den Daten und ordnet Linie und Teilung Zeiten. Die GUI weitere Analysen der Zeitreihe Ganzzell Spuren sowie deren erste und zweite zeitliche Ableitung zu erzeugen. Während die Software wurde entwickelt, S. cerevisiae, sollte seine Modularität und Vielseitigkeit ermöglichen es to dienen als Plattform für die Untersuchung anderer Zelltypen mit wenigen Änderungen.

Einleitung

Einzel-Zell-Analyse der Genexpression gefördert hat unser Verständnis vieler Aspekte der Genregulation. Statische Schnappschüsse von fluoreszierenden Reporter Expression mittels Durchflusszytometrie oder Mikroskopie bieten nützliche Informationen über die Verteilung der Single-Cell-Ausdruck, aber es fehlt die Geschichte und Entwicklung der Zeitreihen erforderlichen Daten direkt informieren Genexpression Dynamik. Fluoreszenz-Zeitraffer-Mikroskopie stellt ein Mittel, um sowohl Single-Cell-Messungen und ihre Geschichte zu erhalten. Verschiedene experimentelle und analytische Techniken entwickelt worden, zu erhalten und zu quantifizieren Filme von fluoreszierenden Reporter Ausdruck verleihen somit Einblicke in Genregulation Features (siehe ¹ für eine Übersicht) wie Zell-zu-Zell-Variation ^2,3, bakterielle persister Bildung ^4, Transkription Initiierung und Dehnung ^5, Transkriptions Platzen ^6,7, Zellzyklus-Abhängigkeit ^8,9 und ¹⁰ Erblichkeit. Allerdings obtaining Qualität Single-Cell-Fluoreszenz Zeitreihen mit erheblichen technischen Herausforderungen bei der Kultivierung eine Monoschicht von Zellen in einer kontrollierbaren Umgebung und in High-Throughput-Quantifizierung der Fluoreszenz erworbenen Filme. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Beschaffung und Analyse von Filmen Fluoreszenz S. cerevisiae ohne erforderliche Erfahrung in der Zellkultur Gerät Herstellung oder in der Software-Entwicklung (Abbildung 1).

Erstens, wir ausführlich ein Beispiel-Protokoll zur Fluoreszenz Zeitreihen filme für Bäckerhefe, die ein oder mehrere fluoreszierende Reporter erzeugen. Obwohl maßgeschneiderte mikrofluidischen Kultur Kammern errichtet worden sind und erfolgreich eingesetzt zuvor ^11-13, verwenden wir einen handelsüblichen Mikrofluidikvorrichtung von CellAsic (Hayward, CA). Das System beschränkt Zellen Monoschicht Wachstum und ermöglicht kontinuierliche Kontrolle der Perfusion Umwelt. Die Mikroskopie Protokoll präsentieren wir ein einfaches Mittel, um fluoresz erhaltenENCE Filme von Bäckerhefe, aber jede Änderung experimentelle Protokoll (eine angepasste Kultur Gerät, alternative Medien Bedingungen, etc.), was ähnliche Fluoreszenz Filmdaten einzelner Hefezellen substituiert sein kann.

Nächstes skizzieren wir die Analyse der Filme über eine grafische Benutzeroberfläche (GUI)-basierten Software-Paket in MATLAB (MathWorks, Natick, MA), nannte die GUI für die schnelle Analyse von Fluoreszenz Time Series (Transplantate), um Zeitreihen zu extrahieren für einzelne Zellen. Transplantate hat ähnliche Eigenschaften der vielseitigen, Open-Source-Software-Paket Handy-ID ¹⁴ in Segmentierung und Tracking-Zellen und bei der Gewinnung Fluoreszenzintensität und geometrischen Informationen. Allerdings sieht Transplantate wichtige zusätzliche Funktionen. Erstens bietet es einfach interaktive Bearbeitung der Segmentierung und Tracking-Ergebnisse zu Genauigkeit der Daten, anstatt nur statistische Ausreißer Gating der Region Spuren nach der Analyse zu überprüfen. Darüber hinaus erstreckt sich die Analyse auf automatically bezeichnen Abstammung und Zellzyklus-Sehenswürdigkeiten in der Nähe von Bäckerhefe. Festlegen, wann Mutter und Tochter, zwei unabhängige Zelle Regionen bilden teilen ist entscheidend für die Bestimmung ganzen Zelle (Mutter einschließlich damit verbundener bud) Messungen während des Zellzyklus ^8. Die Suite besteht aus drei Modulen, um diese Aufgaben zu erfüllen. Die ersten Segmente Zelle Regionen auf dem Kontrast zwischen Schärfe und Unschärfe Hellfeld Bildern basiert, und ermöglicht es dem Benutzer zu definieren und zu testen visuell Segmentierung Parameter. Der zweite Titel (. Verwendung Blair und Dufresne MATLAB Umsetzung der Crocker et al IDL Routine, verfügbar unter: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) und misst Zelle Regionen durch die Zeit; vergibt automatisch Linien und ermöglicht die visuelle Inspektion und Fehlerkorrektur. Eine einfache Plotten GUI wird zur Abfrage Single-Cell-Eigenschaften enthalten. Das dritte Modul schreibt Knospe Entstehung und Teilung times und gibt Ganzzell Zeitreihendaten sowie deren erste und zweite zeitliche Ableitung (wie in ⁹ beschrieben). Das Analyse-Modul gibt die Daten als durch Leerzeichen getrennte Textdatei für die nachfolgende Studie in der Statistik-Software der Wahl. Somit ermöglicht das Paket dem Anwender, qualitativ hochwertige Zeitreihendaten über eine grafische Schnittstelle zu extrahieren. Wir haben diese Methode verwendet, um Echtzeit-Transkription Preise in einzelnen Hefe-Zellen als Funktion des Zellzyklus ⁹ schätzen. Während die Module für Hefezellen, die Parameter oder optimiert worden sind, falls erforderlich, die frei verfügbare Code kann für andere Organismen und Bildtypen angepasst werden. Segmentierung, Tracking und Linie Zuordnungsalgorithmen kann spezifisch für Arten der Bildgebung zugewiesen und den Organismus in Frage. Die bestehenden Algorithmen konnte ersetzt werden, aber immer noch die GUI-Schnittstelle, die benutzerfreundliche visuelle Kontrolle und Korrektur der Segmentierung und Tracking-Fehler, die unweigerlich Berufs erlaubtr mit einem Algorithmus.

Protokoll

1. Erhalten Fluoreszenzmikroskopie Filme von Einzel-Hefe-Zellen, die in einer mikrofluidischen Kammer

1. Impfen 1 ml SC Medien (synthetische definierten Medien mit 2% Glukose und vollständiges Komplement von Aminosäuren) mit Zellen aus einer frisch wachsenden Platte und bebrüten die Kultur über Nacht ca. 16 Stunden auf einer Bandage bei 30 ° C. Bereiten Sie die Kultur, so dass die endgültige OD _600nm ~ 0,1 für frühe log-Wachstumsphase ist.
2. Verdünnen Sie die Starter-Kultur nach Bedarf und nachwachsen 1 ml in ein frisches Reagenzglas eine zusätzliche 6-8 Stunden bis OD _600nm = 0,1. Dies bietet wachsenden Zellen in einem nährstoffreichen eingeschwungenen Zustand bei einer Dichte sich zum Laden in der mikrofluidischen Vorrichtung. (Alternativ ersetzen Schritte 1.1-1.2 dem Verfahren notwendig, um Zellen herzustellen, wie für das Experiment erforderlich.)
3. Bereiten Sie eine Y04C mikrofluidischen Kultur Platte von CellAsic: Entfernen Sie den Transportschutz Lösung; spülen Sie die Vertiefungen mit sterilem Wasser, und mit der ONIX Perfusion System fließenWasser durch Brunnen 1-6 bei 6 psi für 5 min, um die Kanäle zu spülen. Dann Flow aus dem Laden gut 8 bei 6 psi für 10 sec (das Laden Kanal hat viel höhere Flussraten und sollte separat gespült werden).
4. Entfernen von Wasser aus allen Vertiefungen und ersetzen mit 250 ul SC in den Einlass Brunnen 1-6 und 50 ul der Kultur aus Schritt 1.2 in Zelle Laden gut 8. (Alternativ legen Sie die gewünschten Medien in den Einlass Brunnen 1-6 für Experimente erfordern Umschalten zwischen verschiedenen Bedingungen.)
5. Verschließen Sie die ONIX Krümmer an der Platte, und beginnen Priming die Kanäle und Kultur Kammer fließt vom Einlass Brunnen 1-6 bei 6 psi für 2 min um mindestens 5 min bei 6 bar ab dem Einlass und Halten der Ausgangspunkt für die Medien gefolgt Experiment. Fließen diese kontinuierlich bis Schritt 1.7.
6. Bereiten Sie das Mikroskop für das Experiment. Wir verwenden eine Zeiss Axio Observer.Z1 Weitfeld Mikroskop mit einem Cascade II hinten beleuchteten EMCCD Kamera (Photometrics, Tuscon, AZ) und ein Lumen 200 Metall-Halogen-BogenLampe (Prior Scientific, Rockland, MA) zur Fluoreszenzanregung abgeschwächt auf 10% bis Ausbleichen zu verhindern. Um die Schaltzeit benötigt, um in mehreren fluoreszierenden Kanäle erwerben zu minimieren, haben wir eine paar Einzel-, Dreibett-Bandpass dichroitischen Filter cube entsprechende Anregung / Emission Filter für CFP, YFP und RFP (Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT; Set 89006) gesetzt in externen, schnell schaltende Filter Räder (Ludl Electronic Products, Novato, CA).
7. Legen Sie ein paar Tropfen Immersionsfluid auf das Ziel (wenn nötig, verwenden wir ein Zeiss Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC), und montieren Sie das Gerät sicher in mikrofluidischen der Bühne des inversen Mikroskop. Sicherstellung der Platte überhaupt nicht verschieben in der Bühne während des Experiments verbessert die Zell-Tracking während Datenanalyse. Wir kleben einfach die Platte auf die Bühne zu seiner Halterung Verschiebung zu verhindern.
8. Konzentrieren Sie sich auf der linken Drittel der ersten Kultur Kammer (wo die Kammer Höhe kleinste ist) mit einer der Embedded Positiontion Marker. Deaktivieren Sie das Flow aus der Medien-und Einlass und Flow aus der Zelle Laden gut 8 bei 6 bar in 5 sec platzt. Bewegen Sie die Bühne, um rund um die Kultur Kammer für Zellen aussehen. Steigern Laden Strömung Zeit und Druck, bis die gewünschte Zelldichte erreicht ist, aber nicht zu überlasten und Verstopfen der linken Schranke, wo frisches Medium in die Kammer.
9. Beginnen Sie, die sich aus den Medien Einlass auch mit den Medien ab bei 6 psi.
10. In MetaMorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) oder andere Mikroskopie Automatisierungs-und Steuerungs-Software, Setup eine mehrdimensionale Erfassung mehrere Bilder mehrstufige Positionen im Laufe der Zeit zu nehmen. Legen Sie die Anzahl von und Intervall zwischen den Zeitpunkten. Wählen Sie mehrere Positionen Bühne mit ~ 10 Zellen, die jeweils (mehr schnell überladen). Wir verwenden in der Regel 5 Minuten-Intervallen und Bild bis zu 16 Positionen, die jeweils ca. 11 Sekunden dauern für den Erwerb zu jedem Zeitpunkt.
11. Richten Sie den Erwerb, so dass in jedem Stadium Position zu jedem Zeitpunkt thE-Programm:, erwerben die BF auf dem Durchlicht-Hellfeld (BF) Bild mit MetaMorph des eingebauten Autofokus-Verfahren (Umsetzung der Autofokus als individuell geschriebenen Zeitschrift zu Beginn jeder Etappe Position bietet eine größere Kontrolle über Fokusgenauigkeit) konzentrieren Bild bei +1 um zur Bildebene (fp); erwerben BF unscharf (BFOOF) Bild bei -4 um den fp (benutzerdefinierte geschriebenen Zeitschriften, um den Fokus zu ändern, wie zwischen den Bildern erforderlich); und erwerben ein Graustufen Bild für jedes fluoreszierenden Reporter bei der fp mit den Einstellungen für die schnelle Übernahme mit minimalen Photobleichung optimiert.
12. Gegebenenfalls erhalten Hintergrund und Shading-Korrektur Bilder für jeden fluoreszierenden Reporter in einem Bereich der Zellkulturkammer ohne Zellen.
13. Bereiten Sie den Flow-Programm für das Experiment in der ONIX-Software. Gleichzeitig beginnen die Übernahme Programm in MetaMorph und die Strömung Programm im ONIX-Software.
14. Am Ende des Experiments zu korrigieren unauch Hintergrund und Schattierung in den fluoreszierenden Bilder (wenn nötig) und gegebenenfalls kombinieren. tif Dateien für jedes Bild Kanal in jeder Phase in eine. stk Filmdatei (zB create BF, BFOOF, CFP, YFP und RFP Filme für Position 1 ).

2. Format und Segment Daten für Tracking mit Hilfe der GUI FormatData in MATLAB (Abbildung 2)

1. Führen Sie die Datei in MATLAB FormatData.m die Dateneingabe GUI zu öffnen. An der Spitze, geben oder suchen Sie den Ordner mit den Bilddateien, um die Daten-Verzeichnis gesetzt, und verwenden Sie dann die GUI, die Datentypen und Bilddateien im Experiment aufgezeichnet angeben.
2. Auf der rechten Seite, wählen Sie den Radio-Button neben "Zeitraffer", um anzuzeigen, welche Art Analyse durchzuführen. "Time-Lapse" behandelt die Bilderserie als Zeitreihe (zB ein Film von Zellen wachsen in einem mikrofluidischen Kammer). "Static" wird jedes Bild Serie als eine Reihe von Momentaufnahmen aus einer Population (zB mehrere Bilder ver taken on behandelnschiedenen Positionen auf einer einzelnen Folie Probe). In dieser Transplantate Version können Zeitraffer-Daten für mehrere Positionen aber als separate Datei für jede Position (siehe Schritt 2.14) verarbeitet werden.
3. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Bild, um Anmeldung für ungenaue Bühne Bewegungen, indem jedes Bild in den Filmen scheinbare Bewegung der Zellen innerhalb des Rahmens zu minimieren korrigieren. Wir empfehlen dringend, das, wie es stark verbessert Tracking (Reduzierung manueller Spur curation später), wird aber gelegentlich, "white noise" Pixelwerte in den in dem Bilder wurden an der Grenze verschoben worden zu füllen. Es könnte auch nach dem Betrachten segmentierten BF Bilder in Schritt 2.7 oder an jedem beliebigen Punkt bis 2.13 Schritt ausgewählt werden.
4. Überprüfen Sie die "Hellfeld"-Box in der "Data Channels"-Panel. Klicken Sie auf "Select" auf der rechten Seite, um die Bilder zu laden BF. Für *. TIF-Dateien, wählen Sie alle BF Bilder entsprechend einem einzigen Film, indem Sie die Shift-Taste gedrückt, während Sie, klicken Sie dann auf "Öffnen". Für *. STK Dateien, wählen Sie einfach die BF Stapel von Interesse. Sind die Bilder Erfolgin vollem Umfang anerkannt, werden die Dateinamen in dem Popup-Menü auf der rechten Seite werden in der "Data erkannt" Systemsteuerung aufgeführt. . Für * TIF-Dateien, müssen Sie die Datei-Namen werden in der richtigen Reihenfolge (Speichern von Dateien mit sequentieller Namen während der Erfassung - BF_t001, etc.).
5. Überprüfen Sie die "Hell Field (out of focus)" ein und verwenden Sie die "Select"-Taste wie in Schritt 2.4 die BFOOF Dateien, die in der Pop-up auf der rechten Seite aufgelistet werden geladen. (BFOOF als BF -4 um gegenüber dem fp bei 63X Segmente gut erhalten.)
6. Überprüfen Sie die "Cell Mask"-Box. In der "Mask Source"-Panel, wählen Sie den Radio-Button neben "Segment BF". Drücken Sie die Schaltfläche "Parameter", um die Segmentierung GUI zu öffnen. (Alternativ können Sie auch eine vorsegmentierte Maske Film, indem Sie den Radio-Button neben dem "Select Mask File"-Taste drücken, das letztere, und wählen Sie den Film, wie in Schritt 2.4. In diesem Fall wird ein BFOOF Film ist nicht erforderlich, und überspringen können auf 2,8 fort.)
7. Stellen Sie die verschiedenen Parameter Segmentierung (Beschreibungen der einzelnen werden sehened durch Drücken der "Beschreibung der Parameter"), und testen Sie die Qualität der Segmentierung, indem Sie auf "Test" (Abbildung 3). Erfolgreich segmentierten Regionen werden grün mit magenta Grenzen. Achten Sie darauf, den Schieberegler verwenden, um mehreren Zeitpunkten in dem Film zu überprüfen. Wenn die Segmentierung zufriedenstellend ist, wählen Sie "Fertig", um die Parameter für die Segmentierung FormatData GUI zurückzukehren.
8. Überprüfen Sie die "Color Images"-Box. Geben Sie den Namen der Farbe der ersten fluoreszierenden Bild Kanal im Text Eingabefeld ein, und drücken Sie dann "Hinzufügen und wählen", um die Farb-Dateien wie in Schritt 2.4 laden. Die Farbe Name wird dem Listenfeld auf der linken Seite hinzugefügt werden, und die Dateinamen werden in der Tabelle auf der rechten Seite hinzugefügt werden. Wenn ein Fehler beim Laden der Farbe Dateien vorgenommen wird, wählen Sie den Namen der Farbe in der Liste auf der linken Seite und klicken Sie auf "Entfernen Color", um die Dateien zu entfernen. Wiederholen Sie dies für jeden Farbkanal.
9. Wenn zusätzliche Sub-Region Masken auf einem der fluoreszierenden Farben (z. B. fluoreszenzmarkierten Kern → nucl BasisOhrregion Maske) gewünscht werden, überprüfen Sie die "Color Mask"-Box. Wenn nicht, fahren Sie mit Schritt 2.12. In der "Color Mask Source"-Panel, geben Sie die Sub-Region Maske in das Textfeld Eingabefeld ein. Wählen Sie eine Farbe aus dem Popup-Menü in der "Color Mask Source"-Panel (erfordert die Farbe in Schritt 6 hinzugefügt wurden) und drücken Sie "Parameter", um eine Schwelle testen GUI zu öffnen.
10. Drücken Sie die "Auto-Schwelle", um automatisch die Schwelle mit Otsu-Verfahren ^15, und das Bild wird die Bereiche oberhalb der Schwelle (Abbildung 4) erhalten zu markieren. Die Schwelle kann manuell eingestellt werden mit dem Eingabefeld. Verwenden Sie die Bildlaufleiste, um zu bestätigen die Schwelle ist für alle Zeitpunkte. Wenn Sie damit zufrieden, "Fertig" Push-to-die Schwelle zur FormatData GUI zurückzukehren.
11. Drücken Sie "Hinzufügen und Segment", um die Sub-Region Maske mit dem Schwellenwert-Modul für das ausgewählte Farbbilder erzeugen. Die Farbe Maske Name und Quelle werden in der Tabelle auf der linken Seite angezeigt werden, mit den entsprechenden recognized Dateinamen in der Tabelle auf der rechten Seite. (Alternativ drücken Sie "Hinzufügen und wählen", um vorgefertigte Teilbereich Maske Dateien zu laden.)
12. An der Unterseite geben oder suchen Sie den gewünschten Ordner, der als save-Verzeichnis verwendet werden.
13. Drücken Sie auf "Format Data", um die Image-Dateien (mit der tiffread2.m Code von Francois Nedelec entwickelt, abrufbar unter: lesen http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298 ), die Daten verarbeiten, und erstellen Sie eine * . mat-Datei in den angegebenen Ordner. Diese Datei wird als Eingabe für die ProcessTimeSeries GUI dienen.
14. Wiederholen Sie Schritt 2,4 bis 2,13 für den Satz von Filmen für jede Stufe Position.

3. Titel Cells und Linien durch die Zeit mit ProcessTimeSeries GUI und Curate ID und Lineage Assignments (Abbildung 5)

1. Führen Sie die Datei in MATLAB ProcessTimeSeries.m den Tracking-GUI zu öffnen. Stellen Sie die folgenden Parameter nach dem Öffnen derGUI:
   • "Chamber Höhe" ("Datei-I / O"-Panel, oben links) - dies zeigt die Höhe der Kammer, in der die Zellen gefangen. Es wird als ein Hindernis bei der Angleichung Zellvolumen als 3D-Ellipsoid auf der Haupt-und Nebenachse der Zelle Region in ^8, verwendet wird.
   • "Um / Pixel" ("File I / O"-Panel) - der Umrechnungsfaktor Pixels um Abstand kalibrieren in den Bildern so Querschnittsfläche und Volumen um ² und um ³ berechnet werden kann, beziehungsweise.
   • "Filter-Panel" (siehe unten "Datei-I / O"-Panel) - set minimalen und maximalen Parameter herauszufiltern Junk-Regionen in der Maske: "Area" - Region in Pixeln; "ECC" - Exzentrizität Faktor, mehr kreisförmig → 0 ; "SF" - Formfaktor, mehr kreisförmig → 1.
2. Klicken Sie "Load Images" in der "File I / O"-Panel, und wählen Sie die *. Mat Datendatei von Interesse Ausgang vom FormatData GUI. Die Region Maske (und alle Sub-Region Masken) für jeden Farbkanal angelegtUnd eine Reihe von verschiedenen Messungen werden (Tabelle 1). Die Datei wird dann gespeichert. (Wenn das Laden einer Datei in ProcessTimeSeries von einer früheren Sitzung, wird er fragen, ob die Analyse von Anfang an neu gestartet werden soll. ACHTUNG:. Dadurch wird jede Spur curation bereits abgeschlossen zu löschen und die Daten zu behandeln, als ob es frisch aus dem FormatData GUI waren Wenn versehentlich neu gestartet wird, schnell getroffen Strg + C in der MATLAB-Befehlsfenster, um die zuvor kuratiert *. mat-Datei nicht überschrieben werden kann.)
3. Weiter, verfolgen die Zellen. Im "Track Cells"-Panel (neben dem "Filter"-Feld), setzen Sie die folgenden Parameter:
   • "Max Displacement" - der maximale Abstand in Pixel eine Zelle zwischen benachbarten Bildern, bevor sie als eine andere Zelle markiert reisen können. Höhere Verschiebung bedeutet, kann der Algorithmus für Zellen bewegen mehr ausmachen, aber es erhöht auch die Komplexität der passenden Zelle Regionen in Massen. Wir beginnen bei 12 und ab, wenn ein Fehler in Verfolgung (siehe Schritt 3.4).
   • "Minimum Länge" - Mindestanzahl der Vorkommen für eine Zelle Spur als gültige Datenreihen werden. Wir verwenden 1 bis Entfernung jeglicher realen Spuren zu verhindern, aber das kann, wenn die Segmentierung führt zu kurzlebig, falsche Spuren Region erhöht werden.
   • "Frame Memory" - maximale Anzahl von aufeinanderfolgenden Frames ein Zellbereich verschwinden können und angesichts der gleichen ID, wenn er zurückkehrt. Wenn es länger als "Frame Memory" verschwindet, wird es eine neue ID bei der Rückkehr gegeben werden. Wir verwenden 2 um Regionen durch Segmentierung für 2 Frames vor der Rückkehr verpasst werden.
4. Klicken Sie "Track Cells" in Regionen von einem Frame zum nächsten Track über die Region Schwerpunkte (Dufresne Blair und MATLAB Umsetzung der Crocker, Grier und Wochen IDL Routine, verfügbar unter: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) , um Linien für neu auftretende Knospen zuweisen und die Daten speichern. Stammbaum werden automatisch von min zugewiesenimizing Abstände zwischen mutmaßlichen Knospen und potenzielle Mütter in jedem Rahmen. (Wenn ein Fehler in der MATLAB-Befehlsfenster durch "schwierige Kombinatorik", zu verringern "Max Displacement" und wiederholen Sie Tracking-Systems.) Ändern Sie die Parameter in den Popup-Fenstern, wie es für Ihre Daten.
5. Curate schlecht segmentierten Regionen und Irrtümer in ID oder Abstammung Zuweisungen über die verschiedenen GUI-Tools oder Tastenkombinationen (in einem Popup-Fenster durch Drücken der Taste oben "gewählte Zelle Information"-Panel).
   • Slider, "Prev Bild", "nächstes Bild" (Strg + links / rechts) - zu verwenden, um anzuzeigen, und bewegen sich zwischen Frames in der Bilderserie.
   • "Bild #" - zeigt die Frame-Nummer des aktuellen Bildes in der linken und rechten Achsen. Gehen Sie zu einem festgelegten Rahmens durch Eingabe seiner Nummer in der rechten "Bild #" ändern.
   • "Delta frame" - zeigt den Unterschied in Frame-Nummer zwischen den rechten und linken Achsen (Δ = rechts - links).
   • "Hide Text" (Strg + T) - Schaltet zwischen der Anzeige der Zelle IDs indie richtigen Achsen oder nicht.
   • "Hide Labels" (Strg + L) - wechselt zwischen der Anzeige der Zelle IDs in der linken Achsen oder nicht.
   • "Mask" Popup-Menü - wählen Sie zwischen der Anzeige keine Maske, die zelluläre Maske oder keine benutzerdefinierten Sub-Masken für die Anzeige im linken Bereich.
   • "Overlay" Popup-Menü (Strg +1-9) - wählen, BF und Farbschichten im linken Frame angezeigt werden soll. Zeige BF ist die einzige, die die BF Schicht schaltet ein oder aus in beiden Achsen. Umschalten zwischen Display oder nicht, indem Sie das Overlay-Namen im Menü wieder ("*" bezeichnet Overlay angezeigt wird). Strg +1 schaltet BF Overlay, mit 2-9 Umschalten der Farbüberlagerungen in Ordnung.
   • "Set Colors" - verwenden, um Farbe für Overlay-Anzeige bestimmen. Ein Popup-Fenster wird abgefragt, welche Fluoreszenz Kanal zu setzen, und dann die Farbpalette wird für Benutzer-Definition erscheinen.
   • "Ändern Regionen und Tracks"-Panel - das steuert Wirkung Änderungen auf dem Zellbereich Maske und Trace-Informationen:
     • "Update tracks" (Strg + U) - nutzen, um wiederzuweisen Zelle IDs. Wenn keine Zellen in der rechten Achsen ausgewählt, wird die GUI Eingabeaufforderung für eine Zellen-ID zu ändern. Wenn ID X zu Y geändert wird, werden alle zukünftigen Instanzen von X auf Y geändert werden, und alle zukünftigen Instanzen des aktuellen Y, X. wird umgeschaltet werden (gelegentlich einer Zelle wird hin-und herschalten zwischen 2 IDs, wiederholt. Dieser ist aufgrund der Tracking-Versuch, mehrere IDs in einer Region oversegmented anstatt einen Fehler in der Update-ID-Funktion aufnehmen.) Mehrere Zellen können ausgewählt werden und ihre IDs gleichzeitig geändert, aber sicher sein, geben jeder eine eindeutige ID. Um eine Region zu einer ID, die nicht existiert in der aktuellen Datei zuzuweisen, geben Sie "0" ein und generiert werden. Verwenden Sie Strg + W, um die IDs von zwei markierten Zellen tauschen.
     • "Delete Selected Tracks" (Strg + D) - zu verwenden, um die ausgewählte Zelle oder mehrere Zellen Regionen in der aktuellen rechten Achsen Rahmen löschen. (Wenn keine Zellen ausgewählt sind, wird für ID gefragt.) So löschen Sie alle Instanzen eines ID-Spur, aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben dem Delete Ausgewählte Tracks Taste (Text ändert sich zu "ALL Löschen"). Dies ist nützlich für das Loswerden von persistenten Junk-Regionen, aber zunächst prüfen zukünftigen Rahmen sicherstellen, dass die ID nicht auf eine gültige Zelle oder Knospe Region wechseln.
     • "Merge Regionen" (Strg + A oder M) - glättet und verbindet Zelle Regionen. Klicken Sie auf eine Zelle oder Zellen in den richtigen Achsen zu wählen (Region wird rot, wenn ausgewählt). Zusammenführen auf eine Region wird morphologisch nahe in kleine Risse oder fehlende Stücke mit einem scheibenförmigen Element zu füllen. Zusammenführen von zwei oder mehr benachbarten Regionen wird sie in einer Region zu verbinden und geben den niedrigsten ID, um die neue Region. Dies ist nützlich für over-segmentierten Regionen (oft, wenn die Zellen große Vakuolen haben).
     • "Zeichnen Region" - mit der Maus auf einen Bereich in der rechten Achsen an der gewünschten Stelle und klicken Sie doppelt zu beenden. Geben Sie einen eindeutigen ID nicht im Datensatz (zwischen 1 und 65535). Abbrechen, indem Sie auf der Tastatur löschen.
   • "Lineage-Tracking"-Panel - nach Verfolgung,Linie Zuweisungen werden automatisch generiert. Wenn neue ID Regionen erscheinen, wird der neue Cell-ID in rosa und eine rote Linie wird an die Mutter Region gezogen. Neue Regionen zu groß, um Knospen sein oder zu weit entfernt von potenziellen Mütter erscheinen in grün werden und eine Mutter ID "NaN" ("not a number", siehe Tabelle 2). Regionen bestehenden ersten Zeitpunkt eine Mutter-ID "0". Um einzelne Aufgaben zu beheben, geben Sie die Mutter und Knospe-IDs in den Text zu bearbeiten Felder und klicken Sie auf "Fix". Um eine Zelle der Mutter löschen, geben Sie "0" als seine Mutter. Eine schnellere Methode ist, um zwei Regionen im rechten Bild aus und drücken Sie Strg + F. Dadurch wird automatisch die älteren Region als Mutter und dem neueren Bereich als Tochter, während des Löschens alle vorher vorhandenen Zuweisungen Mutter für die Tochter Zelle. VORSICHT: Ein Klick auf "Berechnen Stammbaum" jederzeit neu berechnet werden alle Zuordnungen Abstammungslinie, einschließlich derer der Benutzer zuvor kuratiert.
   • "Selected Handy Information" panel - "Get Info "zeigt einige Messungen der Regionen in der rechten Achsen ausgewählt." Messungen ... "kann der Benutzer bestimmen, welche Messungen angezeigt werden (ebenso wie definieren Sie den Standard-Liste für andere Operationen wie" Daten exportieren "). Kann verwendet werden eine korrekte IDs und Linien (z. B. wenn die Zelle X eine Knospe zum Zeitpunkt t, es sehr wahrscheinlich, keinen anderen Keim zum Zeitpunkt t + 5 min) zu bestimmen.
   • "Änderungen speichern" (Strg + S) - aktualisiert die * mat Datei Benutzer Änderungen widerzuspiegeln.. Häufig verwenden (es gibt keine Undo-Funktion)!
   • "Generieren Grundstücke" - öffnet die GeneratePlots GUI. Wird verwendet, um schnell plotten gewählt variablen Informationen und einfache Berechnungen für Single-Cell-Regionen in der rechten Achsen der ProcessTimeSeries GUI, deren Mittelwert oder Mittelwert aller Regionen in jedem Rahmen hervorgehoben. Diese GUI berechnen kann rau ersten Ableitungen, aber sicher sein, den richtigen Zeitintervall in der oberen linken angeben. Grundstücke kann die Ausgabe in eine Figur für das Speichern durch Drücken von "Generieren Figur" sein.
6. Um richtig zu kuratieren Daten: zusammenführen keine oversegmented Regionen; löschen Sie alle Regionen sie nicht die ganze Zelle; sicher sein, Mutter-bud Beziehungen richtig zugeordnet sind (eine rote Linie erscheint zwischen ihnen zum Zeitpunkt der Entstehung Knospe, wenn die Knospe rosa ID, siehe Tabelle 2); und beseitigen alle grünen IDs durch die Festsetzung der ID, ​​die Zuweisung der Region eine Mutter, die Zuweisung keine Mutter ("0") oder das Löschen der Region. Bud Daten werden, dass der Mutter während der abschließenden Analyse hinzugefügt werden, damit nicht fusionieren eine Knospe Region zu seiner Mutter (es wird zu ungenauen Schätzung führen Volumen).
7. Sichtprüfung Daten für jedes Bild bis zum letzten Mal von Interesse, aber es ist nicht der gesamte Zeitreihe erforderlich, wenn nicht mit den späteren Bildern.
8. Achten Sie darauf, die Änderungen zu speichern.
9. Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,7 für die *. Mat-Datei für jede Stufe Position.

4. Exportieren von Daten für die Analyse

1. Um einfach exportieren roh Region Messungen für jede Zelle durch time, drücken Sie "Daten exportieren". Die Messungen von Interesse kann in der GUI, das sich öffnet ausgewählt werden, und sie werden ausgegeben in einer durch Leerzeichen getrennten *. Txt-Datei mit variablem Namen als Spaltenüberschriften.
2. Um die Zeitreihen für ganze Zellen im Laufe der Zeit zu analysieren, berechnen Zellzyklus-Informationen, und nehmen Derivate, drücken Sie "Time Series Analysis". Ein Fenster wird geöffnet, in dem die Auswahl der Messungen von Interesse und Eingang der Analyse-Parameter (Abbildung 6).
3. Geben Sie die letzte Zeitpunkt in der GUI (alle nachfolgenden Frames werden ignoriert) kuratiert. Die Standard-Glättung und Zellzyklus-Zuordnungsparameter funktionieren gut für unsere haploiden und diploiden Stämme in 5 min Intervallen abgebildet, aber diese müssen möglicherweise für die besten Ergebnisse variiert werden. (Prüfen Sie, ob die Parameter geeignete Werte durch manuelle Bestimmung Knospung und Teilung Zeit für einen Test-Datensatz und im Vergleich zu der Leistung des automatisierten Algorithmus sind.)
4. Wenn alle Parameter eingestellt sind, drücken Sie auf "Analyze" an:
   1. Construct Arrays für jede Rohmessung und Subtrahieren der Hintergrund (gemessen als mittlere Intensität des nicht-Zelle des ersten Rahmens in jedem fluoreszierenden Film oder werden können, um für den durchschnittlichen Autofluoreszenz pro Zelle Pixel angegeben werden).
   2. Fit eine glättende Spline den ausgewählten Messungen hochfrequenten Messrauschen (wie in ⁹ beschrieben) zu beseitigen.
   3. Automatisches Bestimmen Knospe Entstehung und Zellteilung Zeiten für jede Zelle auf Änderungen in der Steigung der Volumen-Zeit-Reihe, wie in ⁹ beschrieben berechnet. Die Knospe Messungen werden dann zu der Mutter Messungen zwischen Entstehung und Teilung jedes Zyklus für einen zusammenhängenden ganze Zelle Zeitreihen hinzugefügt werden. Eine normalisierte Zellzyklus wird ebenfalls berechnet, die von 0 bis 2 von divisional werden.
   4. Fit eine Glättung Spline um stabile ^1. und ^2. Ableitungen der gewählten Messungen. (Für die Zwecke der definierten Derivate Zeitreihenhergestellt werden kontinuierlich über Division durch Verschieben von Daten die folgenden Zellzyklus, um den Endpunkt des vorhergehenden Zyklus entsprechen.)
   5. Roh-und Output geglättete Zeitreihe für alle Regionen und ganze Zelle geglättete, kontinuierliche und differenzierte Zeitreihe als ein Array für jede Messung. Das erste Element ist eine Farbzahl nach Abzug des Hintergrunds, hält der Rest der ersten Reihe Zellidentifikationen, der Rest der ersten Spalte die Rahmennummer ist, und die übrigen Elemente halten die Zeitreihen für jede einzelne Zelle in einer Spalte, wobei jede Reihe der sich der Rahmen in der ersten Spalte. Eine ähnliche Anordnung von Zellzyklus-Progression Zeitreihen und Herkunftsinformationen wird auch ausgegeben werden. Das Array "LineageArray" enthält eine Tabelle mit jeder Zeile, die eine Mutter-bud Beziehung und den ersten bis fünften Spalten sind Mutter ID, ID Knospe, Rahmen erste Knospe Region geschätzt angehende Rahmen, und die geschätzte Aufteilung Rahmen. Die Daten werden in einer *. Mat-Datei (MATLAB-Datei) exportiert.

Ergebnisse

Eine erfolgreich durchgeführt und analysiert Experiment wird meist kontinuierliche Zeitreihen für einzelne ganze Zellen mit realistisch zugeordnet Knospe Entstehung und Teilung Zeiten ergeben. Als Beispiel führten wir das obige Protokoll mit einem haploiden Hefestamm Expression eines integrierten Kopie Cerulean fluoreszierendes Protein (GFP) vom konstitutiven ADH1 Promotor angetrieben wird, um zu beobachten, wie Wachstum und die globalen Expression im Laufe der Zeit in einzelne Zellen (Tabelle ...

Diskussion

Das obige Protokoll beschreibt eine einfache Methode zu erhalten und zu analysieren Fluoreszenz Zeitreihendaten mit wenig Erfahrung in der Mikrofluidik oder in der Softwareentwicklung. Er erlaubt es, Zeitraffer-Filme Fluoreszenz einzelner Hefezellen erhalten; extrahieren relevante Größe der Zellen und die Expression Messungen; Pfarrer Tracking und Abstammung Zuweisungen und analysieren das Verhalten ganzer Zellen im Laufe der Zeit mit einem handelsüblichen Gerät mikrofluidischen Kultur und eine vielseitige grafische Ben...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Y04C Hefe-Perfusionsplatte	CellAsic	Y04C-02
ONIX Mikrofluidische Perfusionsplattform	CellAsic	EV-262
Axio Observer.Z1 Mikroskop	Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 Öl DIC Objektiv	Zeiss	440762-9904-000
Cascade II EMCCD Kamera	Photometrie
Lumen 200 Metallhalogenid-Bogenlampe	PRIOR Scientific
Siegro-Bandpass-Filterwürfel und Anregungs- und Emissionsfilterset	Chroma Technology Corp	Set #89006	Verwendet für YFP (Venus/Citrin), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 Controller und Filterräder	Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a	Mathworks		Die 64-Bit-Version verarbeitet große Datendateien besser als die 32-Bit-Version