Protein WISDOM: A Workbench für<em&gt; In silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Aufbau von Biomolekülen

Zusammenfassung

Wir haben computergestützte de novo Proteindesignmethoden entwickelt, die in der Lage sind, mehrere wichtige Bereiche des Proteindesigns anzugehen. Um diese Methoden zu verbreiten, stellen wir Protein WISDOM vor, ein Online-Tool für Proteindesign (http://www.proteinwisdom.org). Ausgehend von einem strukturellen Template kann das Design von monomeren Proteinen für erhöhte Stabilität und Komplexen für eine erhöhte Bindungsaffinität durchgeführt werden.

Zusammenfassung

Das Ziel der de novo-Protein-Design ist es, die Aminosäure-Sequenzen, die in eine gewünschte 3-dimensionale Struktur mit Verbesserungen in spezifischen Eigenschaften, wie Bindungsaffinität, Agonisten oder Antagonisten Verhalten oder Stabilität gegenüber der nativen Sequenz zu falten finden. Protein-Design liegt in der Mitte der aktuellen Fortschritte Drug Design und Entdeckung. Nicht nur, dass Protein-Design liefern Vorhersagen für potenziell nützliche drug targets, aber es verbessert auch unser Verständnis der Proteinfaltung Prozess-und Protein-Protein-Interaktionen. Experimentelle Methoden wie die gerichtete Evolution haben Erfolg in Protein-Design gezeigt. Allerdings sind solche Verfahren durch den begrenzten Raum-Sequenz, die tractably gesucht werden kann begrenzt. Im Gegensatz dazu erlauben Computational Design-Strategien für das Screening von einer viel größeren Menge von Sequenzen, die eine breite Vielfalt von Eigenschaften und Funktionalität. Wir haben eine Reihe von Computer-de novo Protein-Design entwickelte methods fähig Bewältigung mehrere wichtige Bereiche der Protein-Design. Dazu gehören die Gestaltung von monomeren Proteinen für erhöhte Stabilität und Komplexe für erhöhte Bindungsaffinität.

Um diese Methoden für eine breitere Verbreitung verwenden wir präsentieren Protein WISDOM ( http://www.proteinwisdom.org ), ein Werkzeug, das automatisierte Verfahren bietet für eine Vielzahl von Protein-Design-Probleme. Strukturelle Vorlagen eingereicht werden, um den Design-Prozess zu initialisieren. Die erste Stufe der Konstruktion ist eine Optimierung Sequenz Auswahlstufe, die auf die Verbesserung der Stabilität durch Minimierung der potentiellen Energie in dem Sequenzraum soll. Ausgewählte Sequenzen werden dann durch einen Falz Spezifität Stufe und einer Bindungsaffinität Stufe laufen. Ein Rang geordnete Liste der Sequenzen für jeden Schritt des Verfahrens, mit entsprechenden vorbestimmten Strukturen, bietet dem Benutzer eine umfassende quantitative Bewertung der Konstruktion. Hier bieten wir Ihnen die Details of jedes Design-Methode, sowie einige bemerkenswerte experimentelle Erfolge durch den Einsatz der Methoden erreicht.

Einleitung

De-novo-Proteindesign ist die Identifizierung von Proteinsequenzen, die eine gewünschte Tertiärstruktur mit verbesserten Eigenschaften oder Funktionen ergeben. Da die native Faltung eines Proteins die Konformation ist, die am Minimum der freien Energie liegt, sucht das De-novo-Proteindesign nach Sequenzen, die ein Minimum an freier Energie in der Zielfaltung aufweisen. Dieses Problem wurde erstmals von Drexler¹ und Pabo² beschrieben und als "inverses Faltungsproblem" bezeichnet. Im Gegensatz zum Proteinfaltungsproblem, bei dem eine Sequenz nur eine gefaltete Strukturlösung ergeben kann, weist das De-novo-Proteindesignproblem jedoch eine Entartung auf. Viele verschiedene Aminosäuresequenzen können die gleiche Tertiärstruktur und -funktion ergeben.

Während das Proteindesign traditionell experimentell durch rationales Design und gerichtete Evolution durchgeführt wurde, wurden in jüngerer Zeit computergestützte Methoden eingesetzt, um den begrenzten Suchraum experimenteller Methoden zu überwinden. Es wurde eine Vielzahl von Berechnungsmethoden verwendet, darunter deterministische Methoden, stochastische Methoden und probabilistische Methoden. ^3,4 Frühe Berechnungsmethoden verwendeten Fixed-Backbone-Vorlagen, um das Problem leichter zu lösen. ^5-7 Mit dem Aufkommen schnellerer Prozessoren, Hochleistungsrechnen und effizienterer Algorithmen wurde die Backbone-Flexibilität durch die Verwendung eines Ensembles von Fixed-Backbone-Templates^8-14 oder durch die Einbeziehung echter Backbone-Flexibilität durch Ausdrücken der Template in Form von Bereichen von Atom-zu-Atom-Abständen und Flächenwinkeln integriert. ^15,16

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Dieser Artikel beschreibt detailliert Protein WISDOM, ein Online-Tool, das der akademischen Gemeinschaft zur Verfügung gestellt wurde, um unser computergestütztes de novo Proteindesign-Framework zu nutzen. Dieser Rahmen wurde auf das Design zahlreicher Proteine für therapeutische Anwendungen angewendet, die auf Krankheiten wie HIV, Krebs, Komplementkrankheiten und andere Autoimmunerkrankungen abzielen. Viele der vorhergesagten Peptide wurden experimentell validiert, was die Leistungsfähigkeit der Methode demonstriert. Tabelle 1 enthält eine Zusammenfassung der verschiedenen Proteine, die entworfen wurden, einschließlich der Größe des Proteins oder Peptids, der Anzahl der Vorhersagen und der experimentellen Validierung.

Uhr Uhr

Protein-Design	Proteinlänge	# der rechnerischen Vorhersagen	# der experimentellen Validierungen	Referenz
Vollständiges Sequenzdesign von humanem Beta-Defensin-2	Nr. 41	340		(17)
Compstatin-Inhibitoren von humanem C3	13	28	3/3	(18, 19)
Compstatin-Analoga, die an C3c bei Ratten binden	13	5		(20)
Compstatin-Analoga mit Di-Serin-Erweiterung	Nr. 15	8
Stabilisierende Struktur des Compstatin-Analogons W4A9	13	18
C3a-Rezeptor-Agonisten und -Antagonisten	77	20	4/7	(21)
C5a-Rezeptor-Agonisten und -Antagonisten	74	61	Nr. 2/61
HIV-1 gp14-Hemmer	12	6	4/5	(22)
HIV-1 gp120-Hemmer	9	14
Bak-Inhibitoren von Bcl-x L und Bcl-2	16-18	10	5/5	(23)
Inhibitoren von ERK2	11	25
Inhibitoren von EZH2	21	17	10/10	(24)
Inhibitoren von LSD1 und LSD2	16	Nr. 41	17/20
Inhibitoren von HLA-DR1	13	6		(25)
Inhibitoren von PNP	5	13

Tabelle 1. Zusammenfassung der entworfenen Proteine und Peptide unter Verwendung des de novo Protein Design Frameworks. Die # der rechnerischen Vorhersagen wird als die Anzahl der günstigen Vorhersagen dargestellt (d. h. Faltungsspezifitäten oberhalb eines bestimmten Cutoffs oder approximative Bindungsaffinitäten, die größer als die native Sequenz sind). Die # der experimentellen Validierungen ergibt zwei Zahlen: Die erste ist die Anzahl der Vorhersagen, die experimentell validiert wurden, während die zweite die Gesamtzahl der Vorhersagen ist, die experimentell getestet wurden.

Das Design von human-beta-defensin-2 (hβD-2) wurde durchgeführt, um die antimikrobielle Eigenschaft des Peptids zu verbessern. ¹⁷ Für dieses Design haben wir zwei Fälle berücksichtigt: 1) bis zu 10 Mutationen entlang von hβD-2 und 2) vollständiges Sequenzdesign aller hβD-2-Restpositionen mit Ausnahme der Cysteine (8, 15, 20, 30, 37 und 38). Bei der Konstruktion wurden drei verschiedene Designvorlagen und drei verschiedene Sequenzauswahlmodelle verwendet. Ein hohes Maß an Ähnlichkeit bei den Mutationen wurde sowohl für das 10-Mutations-Design als auch für das vollständige Sequenzdesign zwischen dem gewichteten Durchschnitts- und dem Distanz-Bin-Modell beobachtet. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass eine große Anzahl von Sequenzen günstigere berechnete Faltungsspezifitätswerte aufwies als die native Sequenz.

Komplementsystem-Inhibitoren (von C3, C3a und C5a) wurden entwickelt, um eine Reihe von Immunkrankheiten wie Schlaganfall, Herzinfarkt, Alzheimer, Asthma, rheumatoide Arthritis, Abstoßung von Xenotransplantationen, Atemwegserkrankungen bei Erwachsenen, Psoriasis und Morbus Crohn zu bekämpfen. Drei Compstatin-Inhibitoren von C3c, die durch das Proteindesign-Framework vorhergesagt wurden, sowie drei rational gestaltete Sequenzen wurden experimentell validiert, um bessere Bindemittel als das native Compstatin zu sein. ^18,19

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Weitere Studien untersuchten den Aktivitätsverlust von Compstatin gegen Nicht-Primaten C3c und entwarfen eine Reihe von Kandidaten für Ratten- und Maus-C3c-Inhibitoren. Es wurde gezeigt, dass fünf Sequenzen günstigere Assoziations-freie Energien mit Ratten-C3c aufweisen als die W4A9-Compstatin-Mutante, von der bekannt ist, dass sie C3c hemmt. Dies ist auf eine neue Salzbrückenbildung durch Arg1 zurückzuführen. ²⁰ Acht Sequenzen mit einer N-terminalen Verlängerung wurden als bessere Bindemittel vorhergesagt als W4A9 mit einer di-Serin-Erweiterung. Schließlich wurde vorhergesagt, dass 18 Compstatinsequenzen die gebundene Konformation von W4A9 stabilisieren würden, was starke Kandidaten für C3c-Inhibitoren von Primaten und Nicht-Primaten darstellt.

Zusätzlich zu den C3c-Inhibitoren wurden C3a- und C5a-Rezeptor-Agonisten und -Antagonisten basierend auf den Strukturen von C3a und C5a entwickelt. Sieben vom Modell vorhergesagte C3a-Sequenzen wurden experimentell getestet. Zwei der Sequenzen waren potente Agonisten, während zwei andere partielle Agonisten waren. ²¹ Die beiden potenten Agonisten zeigten eine 58-fache Verbesserung gegenüber einem zuvor entdeckten "Superagonisten". Das Design von C5a-Rezeptor-Agonisten und -Antagonisten lieferte einen Satz von 61 Sequenzen. Alle Sequenzen wurden synthetisiert und zwei von ihnen erwiesen sich als neuartige C5a-Agonisten.

Fusionshemmer von HIV-1, dem Virus, das AIDS verursacht, wurden entwickelt, um zu verhindern, dass HIV-1 Zellen infiziert. Das erste Design zielte auf gp41 ab, ein Hüllglykoprotein von HIV-1. Das Proteindesign-Framework sagte sechs Sequenzen voraus, die bessere Bindemittel waren als die native Sequenz. Vier dieser vorhergesagten Sequenzen wurden experimentell validiert, um HIV-1 zu hemmen, wobei die beste Sequenz einen IC_{von 50} von nur 29 μM aufwies. Diese Sequenz zeigte eine 3- bis 15-fache Verbesserung gegenüber der nativen Sequenz und hatte keinen Aktivitätsverlust gegen einen Enfuvirtid-resistenten Virusstamm. ²² Das zweite Design zielte auf gp120 ab, ein weiteres Hüllglykoprotein von HIV-1. Es wurde vorhergesagt, dass vierzehn Sequenzen Bindemittel von gp120 sind und zusätzliche potenzielle Fusionsinhibitoren von HIV-1 liefern.

Zahlreiche Proteine, die mit Krebs in Verbindung gebracht werden, boten vielversprechende Ziele für Krebstherapeutika. Bcl-2 und Bcl-x_L sind anti-apoptotische Proteine, die den Zelltod verhindern. Inhibitoren dieser beiden Proteine wurden entwickelt, um den Zelltod in Krebszellen zu induzieren. Es wurde vorhergesagt, dass zehn Sequenzen bessere Bindemittel sind als die nativen, und diese Ergebnisse deckten frühere experimentelle und Mutagenese-Ergebnisse zusammen. ²³ Ein weiteres Zielprotein, ERK2, ist an Signaltransduktionskaskaden beteiligt, was es zu einem vielversprechenden Ziel für antiproliferative Krebstherapien macht. Fünfundzwanzig Sequenzen wurden als Inhibitoren von ERK2 vorhergesagt.

Histon-Methyltransferasen und -Demethylasen kontrollieren dynamisch die Histon-Methylierung, die mit vielen Krebsarten in Verbindung gebracht wurde, einschließlich Prostata, Brust, Lymphom, Myelom, Blase, Dickdarm, Haut, Leber, Gebärmutterschleimhaut, Lunge und Magen. Das De-novo-Proteindesign-Framework identifizierte 17 Inhibitoren von EZH2 (einer Lysin-Methyltransferase) und von den zehn experimentell getesteten Inhibitoren wurde festgestellt, dass alle EZH2 hemmen. ²⁴ Das potenteste Peptid hatte einen IC₅₀ von etwa 13 μM, war bei erhöhten Enzymkonzentrationen gleich wirksam und konkurrierte nicht mit dem Cofaktor. Diese Peptide waren die ersten Inhibitoren von EZH2. 53 Inhibitoren von LSD1 (einer Demethylase) wurden durch das Framework vorhergesagt, und von den 20 experimentell getesteten waren 17 Inhibitoren von LSD1 und 18 Inhibitoren von LSD2. Die besten Inhibitoren wiesen IC_50-Werte unter 1 μM auf und waren damit die wirksamsten peptidischen Inhibitoren, die bisher entdeckt wurden.

Die letzten beiden Proteinsysteme lieferten Angriffspunkte für die Behandlung verschiedener Autoimmunerkrankungen wie Zöliakie, Diabetes mellitus Typ 1, systemischer Lupus erythematodes, Sjögren-Syndrom, Churg-Strauss-Syndrom, Hashimoto-Thyreoiditis, Morbus Basedow, idiopathische thrombozytopenische Purpura, rheumatoide Arthritis und Allergien. Keiner dieser potenziellen Inhibitoren wurde experimentell validiert, jedoch sagte das Framework sechs Sequenzen voraus, die an HLA-DR1 binden, und 13 Sequenzen, die an PNP binden.

Tabelle 2 fasst experimentell validierte Inhibitoren und Agonisten zusammen, die mit dem de novo Protein Design Framework vorhergesagt wurden. Die Metrik der approximativen Bindungsaffinität wurde verwendet, um neun der Sequenzen vorherzusagen (Inhibitoren von humanem C3c, HIV-1 gp41, EZH2, LSD1 und LSD2), während die Metrik der Faltungsspezifität verwendet wurde, um vier der Sequenzen (Agonisten/Antagonisten von C3aR) zu identifizieren. Diese Peptide unterstreichen den Erfolg des De-novo-Proteindesign-Frameworks, insbesondere die hinzugefügte Metrik der approximativen Bindungsaffinität. Das Framework ist äußerst vielseitig einsetzbar. Sechs verschiedene Proteine, die mit fünfundzwanzig verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht werden, wurden erfolgreich entworfen und experimentell validiert.

Name	IC50	EC50	Protein-Ziel	Anwendbare Krankheiten
SQ027	0,94 μM		menschliches C3c	Schlaganfall, Herzinfarkt, Alzheimer, Asthma, rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematodes, Multiple Sklerose, Schuppenflechte, Diabetes Typ I, Morbus Crohn, Pankreatitis und Mukoviszidose
SQ086	1,98 μM		menschliches C3c
SQ059	4,73 μM		menschliches C3c
SQ110-4		15,2 nM	C3aR
SQ060-4		36,4 nM	C3aR
Artikel-Nr.: SQ007-5	15,4 nM		C3aR
Artikel-Nr.: SQ002-5	26,1 nM		C3aR
SQ435	29 - 253 μM		HIV-1 gp41	AIDS
SQ037	13,57 μM		EZH2	Prostata-, Brust-, Lymphom-, Myelom-, Blasen-, Dickdarm-, Haut-, Leber-, Gebärmutterschleimhaut-, Lungen- und Magenkrebs
SQ011-1	0,521 μM		LSD1
SQ016-1	0,249 μM		LSD1
SQ026-1	2,51 μM		LSD2
SQ015-1	1,332 μM		LSD2

Tabelle 2. Computergestützt vorhergesagte und experimentell validierte Peptide, die auf verschiedene Krankheiten abzielen.

Protokoll

Methodenübersicht

Der de novo-Design-Rahmen in Protein WISDOM besteht aus zwei Phasen. In der ersten Phase wird eine nach Rang geordnete Liste von Aminosäuresequenzen erzeugt, die in eine vorgegebene Strukturvorlage falten. In der zweiten Phase werden diese Sequenzen validiert, indem entweder die Faltungsselektivität oder die annähernde Bindungsaffinität oder beides berechnet wird. Erstere wird hauptsächlich verwendet, wenn es sich um das Design eines einzelnen Proteins handelt, letztere dagegen, wenn ein Komplex entworfen wird (ein Peptid, das an ein Zielprotein bindet). Abbildung 1 gibt einen Überblick über die im Rahmenverfahren beteiligten Schritte.

Design-Eingaben: Für den de novo-Protein-Design-Rahmen müssen mehrere Eingaben definiert werden. Die erste ist die Designvorlage. Dabei handelt es sich um eine dreidimensionale (3D) Proteinstruktur, die Koordinaten für alle Atome im Protein enthält. Die Struktur kann starr oder flexibel sein. Starre Vorlagen bestehen aus einem festen Satz von Atomkoordinaten und werden aus Röntgenkristallographie-Strukturen gewonnen. Flexible Vorlagen können entweder einen festen Satz von Atomkoordinaten oder obere und untere Grenzen für die Atomkoordinaten umfassen. Solche Vorlagen können aus NMR-Lösungsstrukturen, Molekulardynamik- oder Docking-Simulationen abgeleitet werden.

Die Gestaltungsvorlage wird verwendet, um die erlaubte Mutationsmenge des entworfenen Proteins zu generieren. Diese Menge legt fest, an welchen Positionen der Sequenz Mutationen auftreten können und auf welche Aminosäuren sie beschränkt sind. Die Mutationsmenge wird erzeugt, indem die solventzugängliche Oberfläche (SASA) jedes Rests in der Gestaltungsvorlage berechnet wird. Wenn der Rest zu mehr als 50 % dem Lösungsmittel ausgesetzt ist, ist eine Menge hydrophiler Aminosäuren erlaubt (D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S, T). Wenn der Rest zu weniger als 20 % dem Lösungsmittel ausgesetzt ist, ist eine Menge hydrophober Aminosäuren erlaubt (A, F, I, L, M, V, W, Y). Liegt die Exposition des Rests zwischen 20 % und 50 %, sind alle Aminosäuren erlaubt. Cystein wird typischerweise von der Mutationsmenge ausgeschlossen, es sei denn, experimentelle oder literaturbasierte Daten sprechen für seine Aufnahme. Die kleinen Aminosäuren (A, G, T) werden in der Regel in alle Mutationsmengen einbezogen. Sofern verfügbar, können experimentelle oder literaturbasierte Erkenntnisse genutzt werden, um die Mutationsmengen bestimmter Aminosäurepositionen manuell anzupassen.

Ein Kraftfeld wird ausgewählt, um die paarweise Wechselwirkungsenergie der Sequenzen in der Designvorlage zu berechnen. Obwohl jedes Kraftfeld an den Rahmen angepasst werden kann, wurden zwei abstandsabhängige Kraftfelder entwickelt, die im de novo-Designrahmen weit verbreitet sind. Das erste ist ein hochauflösendes C^α-C^α-Kraftfeld,²⁶ bei dem die Abstände zwischen den C^α-Kohlenstoffatomen der Reste gemessen werden. Das zweite ist ein hochauflösendes Schwerpunkt-Schwerpunkt-Kraftfeld,²⁷ bei dem die Abstände zwischen den Schwerpunkten der Reste bestimmt werden. Die Energieparameter in den Kraftfeldern wurden durch Lösen eines linearen Optimierungsproblems zur Parameterschätzung abgeleitet, wobei gefordert wurde, dass die energetisch günstigen, hochauflösenden Fehlfaltungen für eine große Trainingsmenge von Proteinen energetisch ungünstiger sein mussten als ihre nativen Konformationen. Das hochauflösende Schwerpunkt-Schwerpunkt-Kraftfeld und das C^α-C^α-Kraftfeld wurden beide in früheren Studien am menschlichen Beta-Defensin-2 getestet und validiert.¹⁷ Echte Flexibilität des Proteinrückgrats wird in das Modell eingebaut, indem die Kraftfelder in Abstandsintervalle diskretisiert werden. Der Abstand zwischen einem Paar von Aminosäuren entspricht dann einem bestimmten Abstandsintervall, wodurch einem Bereich von Abständen derselbe Energiewert zugeordnet wird. Dies ermöglicht es dem Optimierungsmodell zur Sequenzselektion, Bewegungen des Proteinrückgrats zu berücksichtigen.

Biologische Einschränkungen in Form von Ladungseinschränkungen oder Inhaltsbeschränkungen können vom Benutzer manuell als zusätzliche Gestaltungsvorgabe eingefügt werden. Ladungseinschränkungen legen eine bestimmte Ladung oder einen Ladungsbereich fest, der für die entworfene Sequenz oder einen Teil der entworfenen Sequenz erfüllt sein muss. Die Ladung wird berechnet als die Summe der positiv geladenen Reste (K und R) abzüglich der Summe der negativ geladenen Reste (D und E). Inhaltsbeschränkungen geben obere und untere Grenzen für das Vorkommen einer bestimmten Aminosäure in der Sequenz vor. Biologische Einschränkungen werden im Allgemeinen durch eine umfangreiche Sequenzalignierung an die native Sequenz definiert. Dies dient dazu, die bekannten biologischen Grenzen bezüglich Ladung und Aminosäuregehalt, wie sie in der Natur für eine Proteinfamilie vorkommen, abzubilden. Weitere Einschränkungen werden manuell durch Analyse bekannter experimenteller Daten festgelegt.

Stufe eins: Sequenzauswahl: Die ursprüngliche Methode zur Sequenzauswahl wurde erstmals von Klepeis et al.^15,16 entwickelt. Sie wählt Aminosäuresequenzen anhand ihrer Energien in der Designvorlage aus und gewichtet sie mithilfe eines ganzzahligen linearen Optimierungsmodells (ILP). Die Methode wurde später verbessert, indem ein recheneffizienteres Modell zur Sequenzauswahl für starre (einfache) Vorlagen verwendet wurde, und durch die Entwicklung von Modellen für flexible Vorlagen erweitert. Dieses globale Optimierungsverfahren basiert nicht auf zufälligen Mutationen und gewährleistet theoretisch die vollständige Durchmusterung des Sequenzraums sowie die Bestimmung einer globalen Lösung. Dies ist ein wesentlicher Vorteil unseres Ansatzes im Vergleich zu allen anderen bestehenden Verfahren.

Einzelmolekül-Strukturmodell: Die ursprüngliche Form des Sequenzselektionsmodells, das von Klepeis et al.^15,16 vorgeschlagen wurde, wurde weiter verfeinert von Fung et al.²⁸. Seine endgültige Form ist in Gleichung 1 angegeben.

Die Indexmenge i=1,...,n definiert die Restpositionen in der Designvorlage. An jeder Position i werden Mutationen durch j{i}=1,...,m_i dargestellt, wobei m_i=20 gilt, wenn die Position i in eine der zwanzig natürlichen Aminosäuren mutieren darf. Die Alias-Mengen k≡i und l≡j mit k>i werden verwendet, um alle eindeutigen paarweisen Wechselwirkungen darzustellen. Binäre Variablen und werden eingeführt, um Aminosäuremutationen zu modellieren. Die Variable nimmt den Wert eins an, wenn das Modell der Position i die Aminosäure j zuordnet, andernfalls den Wert null (analog für ). Die Zielfunktion stellt die Summe aller paarweisen Energiewechselwirkungen in der Designvorlage dar. Der Parameter , der die Energiewechselwirkung zwischen der Position i, besetzt mit der Aminosäure j, und der Position i, besetzt mit der Aminosäure l, beschreibt, hängt sowohl vom Abstand zwischen den α-Kohlenstoffatomen oder den Schwerpunkten der Seitenketten an den beiden Positionen (x_i,x_j,) als auch vom Typ der Aminosäuren j und l ab. Er trägt nur dann zur Zielfunktion bei, wenn sowohl als auch gleich eins sind.

Fung et al.²⁸ stellten fest, dass Formulierung (1) erheblich recheneffizienter ist als zwölf andere äquivalente Modelle quadratischer Zuordnung für die Sequenzauswahl.^28,29 Insbesondere übertraf sie das ursprüngliche Modell von Klepeis et al.^15,16 bei zwei Problemen der Sequenzauswahl für menschliches Beta-Defensin-2: eines mit einer Komplexität von 3,4×10⁴⁵ und ein anderes mit 6,4×10³⁷ sowie 49 zusätzlichen linearen biologischen Nebenbedingungen. Es wurde festgestellt, dass das ursprüngliche Modell von Klepeis et al.^15,16 53.263 Central-Processing-Unit- (CPU-)Sekunden bzw. 4.578 CPU-Sekunden benötigte, um die beiden Probleme mit CPLEX 9.0³⁰ auf einem Pentium-IV-3,2-GHz-Prozessor global optimal zu lösen. Formulierung (1) benötigte lediglich 649 CPU-Sekunden und 14 CPU-Sekunden, um dieselben Aufgaben durchzuführen, was einer Verbesserung der rechnerischen Effizienz um das 82- bzw. 327-fache entspricht.

Gewichtetes Durchschnittsmodell: Fung et al.²⁸ entwickelten zwei Modelle, um den typischen Fall des de novo-Proteindesigns zu behandeln, bei dem die Designvorlage flexibel ist und aus einer Menge von Strukturen besteht. Das Gewichtete Durchschnittsmodell verwendet eine gewichtete Durchschnittsenergie, , anstelle des Energieparameters (x_i,x_k) im Einzelstrukturmodell (Gleichung 1). Die Gewichte wt(x_i,x_k,d) werden durch die Häufigkeiten bestimmt, mit denen der Abstand zwischen x_i und x_k in die Abstandsbinde d in den Vorlagenstrukturen fällt. Die endgültige Form des Gewichteten Durchschnittsmodells ist in Gleichung 2 angegeben.

Abstands-Bin-Modell: Das zweite Sequenzauswahlmodell für flexible Template-Strukturen integriert Abstandsdaten aus mehreren Strukturen, indem eine binäre Variable b_ikd eingeführt wird. Diese Variable hat den Wert eins, wenn der Abstand zwischen x_i und x_k in das Abstands-Bin d fällt, andernfalls ist sie null. Ein weiterer eingeführter Parameter, disbin(x_i, x_k, d), beträgt eins, falls der Abstand zwischen x_i und x_k in einer der Template-Strukturen in das Abstands-Bin d fällt, andernfalls null. Da nur ein Abstands-Bin pro Aminosäurepaar zur Gesamtenergie beiträgt, wird in der Zielfunktion ersetzt durch . Dies führt jedoch eine Nichtlinearität in die Zielfunktion ein. Weitere Einzelheiten zur Linearisierung des Modells sowie zusätzliche für die Durchführbarkeit erforderliche Nebenbedingungen finden sich bei Fung et al.²⁸ Das Abstands-Bin-Modell ist in Gl. 3 angegeben.

Jedes der oben formulierten Probleme der ganzzahligen linearen Optimierung (Integer Linear Programming, ILP)^15-17 kann mithilfe von Branch-and-Bound-Verfahren streng gelöst werden.^28-30 Solche Verfahren garantieren eine konsistente und zuverlässige Konvergenz zur Sequenz mit der global minimalen Energie.

Stufe zwei: Validierung: Abbildung 2 bietet einen detaillierten Überblick über die beiden Ansätze der Stufe zwei. Die Abbildung zeigt die Schritte, die zur Berechnung der endgültigen Rangmetrik erforderlich sind, sowie die Anzahl der in jedem Schritt erzeugten Strukturen.

Falt-Spezifität: Die Falt-Spezifität ist eine Metrik zur Bewertung vorläufiger Entwürfe, die im ersten Schritt erstellt wurden. Ziel der Berechnung ist es, zu ermitteln, wie gut jede Sequenz im Vergleich zur ursprünglichen Sequenz der Vorlage in die Template-Struktur faltet, basierend auf Energieberechnungen. Es gibt zwei Ansätze, um dies durchzuführen, die sich hinsichtlich ihres rechnerischen Aufwands unterscheiden.

Der erste Ansatz wurde von Klepeis et al.^15,16 implementiert. Dieser Ansatz nutzt den Proteinstrukturvorhersage-Algorithmus ASTRO-FOLD, ^26,27,31-47 der auf deterministischer globaler Optimierung basiert. Dieser Ansatz wird derzeit in der Implementierung von Protein WISDOM nicht verwendet, da er sehr rechenaufwendig ist. Angesichts der begrenzten Rechenressourcen und der Notwendigkeit, diese Berechnung möglicherweise an Hunderten bis Tausenden von Sequenzen im Design durchzuführen, schlugen Fung et al.¹⁷ einen effizienteren Ansatz unter Verwendung von TINKER/CYANA^48-50 vor. Der Ansatz beinhaltet die Definition einer flexiblen Strukturvorlage. Die flexible Vorlage kann durch obere und untere Grenzen für die Abstände zwischen C^α Atomen sowie für die ϕ- und ψ-Winkel der Reste definiert werden. Für eine einzelne Struktur werden die anfänglichen Abstände und Diederwinkel verwendet, und die Grenzen werden entweder als fester Abstand oder als Prozentsatz festgelegt. Die Standardgrenzen betragen ±10 % für C^α-Abstände oder ±10° für Diederwinkelgrenzen. Für eine flexible Vorlage können die Grenzen aus den Maximal- und Minimalwerten abgeleitet werden, die über alle als Eingabe für das Design bereitgestellten Vorlagenstrukturen beobachtet wurden. Sobald die anfänglichen Grenzen für jede Sequenz definiert sind, werden Ensembles mit Hunderten von Konformeren mittels CYANA 2.1^48,49 erzeugt. Die Konformere werden mithilfe eines Torsionswinkeldynamik-Simuliertes-Annealing-Protokolls in CYANA generiert, bei dem das Protein schnell erhitzt und langsam abgekühlt wird, wobei die abgetasteten Konformationen verfolgt werden. Nach dem simulierten Annealing wird eine lokale Energie-Minimierung durchgeführt, um Kollisionen durch überlappende Van-der-Waals-Radien sowie Verletzungen der Abstands- und Winkelbedingungen zu minimieren. Standardmäßig werden 500 finale Strukturen erzeugt. Jede Struktur im Ensemble für jede Sequenz wird einer lokalen Minimierung in TINKER 3.6⁵⁰ unterzogen, wobei das AMBER-Kraftfeld⁵¹ verwendet wird. Die endgültige Potentialenergie jeder minimierten Struktur wird tabelliert. Dieser gesamte Ansatz wird sowohl für die Ausgangssequenz als auch für jede mutierte Kandidatensequenz durchgeführt. Anschließend kann die Faltungs-Spezifität jeder mutierten Sequenz bezüglich der Zielstruktur im Vergleich zur nativen Sequenz anhand der folgenden Boltzmann-Verteilung (Gleichung 4) berechnet werden.

Annähernde Bindungsaffinität: Die Methode zur Berechnung der angenäherten Bindungsaffinität wird verwendet, um die entworfenen Sequenzen, die in Komplex mit einem Zielprotein vorliegen, zu bewerten. Diese Berechnungen können direkt mit den Sequenzen aus Phase Eins durchgeführt werden oder mit den Sequenzen hoher Faltungsselektivität, die aus dem Schritt zur Faltungsselektivität stammen.

Lilien et al.⁵² schlugen einen Ansatz zur Berechnung von approximativen Bindungsaffinitäten von Protein-Ligand-Komplexen vor. Dieser basiert darauf, rotamerbasierte Ensembles des Proteins, des Liganden und des Protein-Ligand-Komplexes zu erzeugen und diese Ensembles zur Berechnung von Zustandsfunktionen zu verwenden. Diese approximative Bindungsaffinität wird mit K* bezeichnet und ist durch Gleichung 5 definiert.

Hier q_PL ist die Zustandssumme des Protein-Ligand-Komplexes, q_b ist die Zustandssumme des freien Proteins, und q_L ist die Zustandssumme des freien Liganden. Die Zustandssummen sind in Gleichung 6 definiert, wobei die Mengen B, F und L enthalten die rotamerisch basierten Konformationen des gebundenen Protein-Ligand-Komplexes, des freien Proteins und des freien Liganden jeweils. E_n ist die Energie der Konformation n, R ist die Gaskonstante, und T ist die Temperatur.

Strukturvorhersage: Um die Berechnung von K* zu beginnen, wird eine dreidimensionale Struktur jeder Sequenz benötigt. Dies erfolgt mithilfe der Rosetta-AbRelax-Funktion,^53–55 die Teil des Rosetta-3.4-Softwarepakets ist. Die Strategie hinter dem AbRelax-Algorithmus basiert auf der experimentellen Beobachtung, dass die lokale Struktur des Proteins durch die lokale Sequenz beeinflusst, aber nicht eindeutig bestimmt wird. Ein Monte-Carlo-Algorithmus wird verwendet, um lokale Proteinstrukturen durch sequenzbasierte Strukturfragmente zu ersetzen. Diese Methode erzeugt letztlich kompakte Proteinstrukturen, die nichtlokale Wechselwirkungen berücksichtigen, wie beispielsweise vergrabene hydrophobe Reste, gepaarte β-Fasern und spezifische Seitenkettenwechselwirkungen.

Clusterung: Die Strukturen aus AbRelax werden anschließend anhand ihrer φ- und ψ-Winkel mithilfe von OREO gruppiert.^56,57 Diese Clusterungsmethode verdeutlicht repräsentative Rückgratstrukturen des gesamten Strukturensembles. Die mittleren Strukturen der zehn größten Cluster sowie die Struktur mit der insgesamt niedrigsten Energie werden für das Docking an das Zielprotein ausgewählt. Dies liefert 11 einzigartige Rückgratstrukturen für jede Peptidsequenz und berücksichtigt so die Rückgratflexibilität bei der Ensemblerzeugung.

Dockingsvorhersage: Die Dockingsvorhersage erfolgt mithilfe von RosettaDock.^58-60 Für jede Sequenz wird jede der 11 Peptid-Rückgratstrukturen an das Zielprotein gedockt. Da in diesem Fall die Bindungsstelle bekannt ist, werden die Peptide in deren Nähe platziert und können sich um 3 Å senkrecht zur Bindungsstelle, um 8 Å parallel zur Bindungsstelle verschieben sowie um 8° drehen. RosettaDock verwendet einen Monte-Carlo-Algorithmus für Dockingbewegungen in niedriger und hoher Auflösung. Jeder Dockinglauf erzeugt ein großes Ensemble an Komplexstrukturen. Die zehn Komplexe mit der niedrigsten Energie aus jedem der 11 Läufe werden als Startstrukturen für die abschließende, auf Rotameren basierende Konformeren-Ensemble-Generierung verwendet (110 Startstrukturen pro Sequenz).

Erzeugung des endgültigen Ensembles: RosettaDesign⁶¹ wird verwendet, um das endgültige, auf Rotameren basierende Konformations-Ensemble zu generieren, da damit eine Vielzahl von Strukturen allein durch Anpassung der Seitenketten-Rotamere mithilfe der fixbb-Funktion erzeugt werden kann. RosettaDesign erhält mehrere Startstrukturen, und für jede Struktur wird ein Rest zufällig ausgewählt und das Rotamer über einen Monte-Carlo-Algorithmus verändert. Dieser Vorgang wird so lange wiederholt, bis Tausende von Rotamer-Substitutionen versucht wurden, wodurch eine endgültige Konformation mit niedriger Energie entsteht, die stark zur Zustandssumme beiträgt.

Zur Erzeugung des Peptid-Ensembles werden die zehn Strukturen mit der niedrigsten Energie aus jedem der zehn größten Cluster sowie die insgesamt zehn energetisch günstigsten Peptidstrukturen als Startstrukturen für RosettaDesign verwendet (insgesamt 110 Startstrukturen). Für jede Startstruktur werden 200 Rotamer-Konformere erzeugt, was zu einem endgültigen Ensemble aus 22.000 Strukturen führt (Menge L in Gleichung 6). Das Ensemble berücksichtigt sowohl die Flexibilität des Peptidrückgrats als auch die Rotamer-Flexibilität.

Das komplexe Ensemble wird ähnlich erzeugt, indem die 110 Ausgangsstrukturen aus dem Docking-Vorhersageschritt herangezogen und pro Ausgangsstruktur 200 Rotamer-Konformere generiert werden. Die endgültige Ensemblgröße beträgt 22.000 Strukturen (Ensemble B in Gleichung 6). Die Flexibilität wird durch die verschiedenen Peptid-Rückgratstrukturen, die unterschiedlichen dockenden Konformationen sowie die Rotamer-Konformere für jede Ausgangsstruktur berücksichtigt.

Das Protein-Ensemble wird erzeugt, indem RosettaDesign ausschließlich auf die Zielproteinstruktur angewendet wird. In diesem Fall werden 2.000 Rotamer-Konformationen für die einzelne Startstruktur generiert, sodass die endgültige Ensemblegröße aus 2.000 Strukturen besteht (Menge F in Gleichung 6).

Protein WISDOM

Protein WISDOM, was für Protein-Arbeitsplattform für die in silico de novo-Konstruktion von Biomolekülen steht, ist ein Online-Tool, das der wissenschaftlichen Gemeinschaft benutzerfreundlichen Zugang zu unserem de novo-Proteindesign-Rahmenwerk bietet. Es kann verschiedene häufig auftretende Designziele bewältigen, von der Gestaltung einzelner Proteinketten, die eine Vorlagenstruktur annehmen sollen, bis hin zur Entwicklung neuartiger Peptide, die an ein Zielprotein binden werden. Die nächsten beiden Abschnitte beschreiben die Fähigkeiten von Protein WISDOM im Hinblick auf die beiden Haupttypen von Proteindesignproblemen. Der erste Typ wendet die Sequenzauswahl an, um neuartige Sequenzen zu finden, die in der gegebenen Designvorlage günstig sind, und verwendet anschließend die Faltungspezifität, um die neuartigen Sequenzen zu validieren. Der zweite Typ nutzt die Sequenzauswahl, um neuartige Sequenzen eines in einem Komplex gebundenen Peptids auszuwählen, und verwendet dann sowohl die Faltungspezifität als auch näherungsweise Berechnungen der Bindungsaffinität, um die neuartigen Sequenzen zu validieren.

Nutzerregistrierung

Besuchen Sie die Protein WISDOM-Webseite unter http://www.proteinwisdom.org.

Klicken Sie auf der rechten Seite oben auf der Seite auf die Schaltfläche „Benutzeranmeldung“. Klicken Sie auf „Hier klicken“, um sich zu registrieren.

Füllen Sie die Informationen zur E-Mail-Adresse und zum gewünschten Benutzernamen aus und klicken Sie auf „Weiter“.

Ergänzen Sie weitere Angaben zu Name, Institution, Gruppe und Adresse. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen, um den Nutzungsbedingungen zuzustimmen. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Registrierung absenden“.

Stufe eins: Sequenzauswahl

Einreichung der Proteinsequenz und der Vorlagenstruktur(en)

Klicken Sie auf die Schaltfläche „Benutzeranmeldung“, um das Protein-Design-Experiment zu starten. Dem Benutzer wird seine „Benutzer-Homepage“ angezeigt (Abbildung 3), auf der die Anzahl der eingereichten Aufträge, die Anzahl der hochgeladenen Strukturen (Vorlagen) sowie eine Liste der bisher hochgeladenen Strukturen aufgeführt sind.

Starten Sie einen neuen Designauftrag, indem Sie auf „Neuen Auftrag erstellen“ klicken. Der Benutzer gelangt zur Seite „Auftragsabgabe“ (Abbildung 4). Geben Sie dem Auftrag einen Namen und geben Sie an, ob er auf einem früheren Auftrag basiert (d. h. dieselbe Desigvorlage, Mutations-Sets und biologische Einschränkungen können in einen neuen Auftrag importiert werden; der Benutzer kann jedoch die Mutations-Sets und biologischen Einschränkungen anschließend anpassen). Klicken Sie auf „Weiter“.

Laden Sie die Proteinstruktur(en) der Designvorlage hoch (Abbildung 5). Diese Vorlage muss im standardmäßigen Protein Data Bank (PDB)-Format vorliegen. Es kann sich um eine starre Vorlage (einen einzigen Satz von Koordinaten für jedes Atom) oder eine flexible Vorlage (mehrere Modelle, wie sie beispielsweise aus NMR-Lösungsstrukturen stammen) handeln. Bei der Gestaltung eines einzelnen Proteins darf die Vorlage nur eine Kette enthalten. Der Benutzer kann eine neue Vorlage hochladen oder aus bereits zuvor hochgeladenen Vorlagen auswählen. Optional kann die PDB-ID der Vorlage angegeben werden, falls verfügbar. Falls mehrere Vorlagen hochgeladen werden, muss sichergestellt sein, dass jedes Modell mit „MODEL #“ beginnt und mit „ENDMDL“ endet. Stellen Sie sicher, dass jedes Restmolekül einer natürlichen Aminosäure zugeordnet ist. Klicken Sie auf „Weiter“.

Nach dem erfolgreichen Hochladen der Vorlage zeigt Protein WISDOM die Anzahl der gefundenen Reste, Ketten und Modelle in der Vorlage an, listet die Sequenz auf und fordert den Benutzer zur Überprüfung der Vorlage auf. Bestätigen Sie die Vorlagenstruktur, falls diese korrekt eingegeben wurde, und klicken Sie auf „Weiter“.

Sobald die Vorlage erfolgreich hochgeladen und bestätigt wurde, gelangt der Benutzer auf die „Hauptsteuerungsseite“ (Abbildung 6). Auf dieser Seite kann der Benutzer den Auftragsstatus einsehen, die Mutationsmengen und biologischen Einschränkungen anpassen sowie den Auftrag für Phase Eins: Sequenzauswahl einreichen. Zu diesem Zeitpunkt sind, da Phase Eins noch nicht abgeschlossen ist, keine Optionen für Phase Zwei verfügbar. Diese erscheinen erst, sobald die Ergebnisse aus Phase Eins vorliegen.

Auswahl von Mutations-Sets

Klicken Sie auf den Link „Mutationssätze“ auf der „Hauptsteuerungsseite“, um Mutationssätze zu definieren.

Wählen Sie aus, welche Reste mutieren dürfen, und legen Sie fest, in welche Aminosäuren sie mutieren dürfen (Abbildung 7). Standardmäßig werden die zulässigen Aminosäuren an jeder Position basierend auf der solventzugänglichen Oberfläche (SASA) ausgewählt. Mutationsmengen sind erforderlich.

Klicken Sie auf „Änderungen speichern“, nachdem die Mutations-Sets ausgewählt wurden. Der Benutzer kann wählen, die Bearbeitung des Mutations-Sets fortzusetzen. Wenn die Bearbeitung des Mutations-Sets abgeschlossen ist, klicken Sie, um zur „Hauptsteuerseite“ zurückzukehren.

Auswahl biologischer Einschränkungen

Klicken Sie auf den Link „Biologische Einschränkungen“ auf der „Hauptsteuerungsseite“, um biologische Einschränkungen festzulegen.

Geben Sie Anforderungen bezüglich der Ladung oder des Aminosäuregehalts für das gesamte Protein oder einen Teil des Proteins vor (Abbildung 8).

Beschränken Sie gegebenenfalls die Gesamtanzahl zulässiger Mutationen. Biologische Einschränkungen sind optional. Klicken Sie, um nach Abschluss zur „Hauptsteuerungsseite“ zurückzukehren.

Einreichung von Stufe Eins: Sequenzauswahl

Klicken Sie auf den Link „Beginnen Sie mit Stufe 1“, um den Benutzer zur Seite „Stufe 1 einreichen“ zu navigieren.

Wählen Sie die zu entwerfende Kette (Abbildung 9), die Anzahl der zu generierenden Sequenzen, das abstandsabhängige Kraftfeld und das Modell aus. Falls ein Komplex entworfen wird und eine Berechnung der Faltungs-Spezifität gewünscht ist, muss nur eine einzelne Kette zur Gestaltung ausgewählt werden. Wenn die hochgeladene Vorlage eine einzelne Struktur oder eine „starre Vorlage“ war, ist nur das Einzelstruktur-Modell zulässig. Wenn die hochgeladene Vorlage flexibel ist, kann der Benutzer aus allen drei Modellen wählen: Einzelstruktur, Gewichteter Durchschnitt und Abstandsbin. Beachten Sie die rechnerische Komplexität der zu lösenden Optimierung. Die zulässige rechnerische Komplexität ist auf 20²⁵ begrenzt.

Übermitteln Sie den Auftrag. Der Benutzer wird zurück zur „Hauptsteuerungsseite“ weitergeleitet (Abbildung 10). Der Auftragsstatus wird aktualisiert, um den aktuellen Bearbeitungsfortschritt anzuzeigen. Nach der Übermittlung wird der Auftrag für Bearbeitungen gesperrt.

Nach Abschluss des Auftrags erhält der Benutzer eine E-Mail mit den Ergebnissen, die aus einer Liste entworfener Sequenzen bestehen. Die Ergebnisse sind außerdem auf der „Hauptsteuerungsseite“ einsehbar. Auf der Seite erscheint ein Feld für Stadium 2: Faltungs-Spezifität, das es dem Benutzer ermöglicht, diese Validierung durchzuführen.

Zweite Stufe: Berechnungen zur Faltungsselektivität

Einreichung zur Faltungsspezifität

Klicken Sie auf „Beginne Phase 2: Faltungs-Spezifität“, um die Seite „Aufbau Phase 2“ aufzurufen. Definieren Sie die oberen und unteren Grenzen für den C^α-C^α-Abstand, indem Sie den Vorlagen-Flexibilitätsfaktor entweder als Prozentsatz der Distanz oder als feste Distanz angeben. Legen Sie obere und untere Winkelgrenzen für die φ- und ψ-Diederwinkel fest, indem Sie den Vorlagen-Flexibilitätsfaktor als Prozentsatz angeben. Beachten Sie, dass bei Verwendung einer flexiblen Vorlage die oberen und unteren Abstandsgrenzen als kleinster und größter Abstandswert über alle Vorlagenmodelle hinweg genommen werden. Ebenso werden die oberen und unteren Winkelgrenzen aus den höchsten und niedrigsten Winkelwerten über alle Modelle hinweg abgeleitet.

Klicken Sie auf die Schaltfläche „Submit“.

Geben Sie die Anzahl der pro Sequenz zu generierenden Strukturen an und klicken Sie auf „Weiter“. Beachten Sie, dass die maximale Anzahl der pro Sequenz zu generierenden Strukturen bei 500 liegt.

Klicken Sie auf „Weiter“, um die Absicht zur Einreichung zur Faltungsvalidierung zu bestätigen. Phase Eins und Phase Zwei sind bis zum Abschluss von Phase Zwei für Bearbeitungen gesperrt.

Nach Abschluss des Auftrags wird dem Benutzer eine E-Mail mit den Ergebnissen gesendet. Die Ergebnisse können auf Protein WISDOM auf der „Hauptsteuerseite“ (Abbildung 11) eingesehen werden. Hier können Textdateien mit den entworfenen Sequenzen, den entsprechenden Energie­werten aus Stufe Eins und den Werten zur Faltungs­spezifität aus Stufe Zwei angezeigt und heruntergeladen werden. Zusätzlich kann der Benutzer auf den Link „Ergebnisse anzeigen“ klicken, um eine Tabelle im Browser angezeigt zu bekommen, die die Rangfolgen und Energie­werte aus Stufe Eins sowie die Rangfolgen und Werte zur Faltungs­spezifität aus Stufe Zwei enthält.

Stufe drei: Näherungsweise Berechnungen der Bindungsaffinität für Protein-Peptid-Komplexe

Die Berechnung der ungefähren Bindungsaffinität ermittelt die Affinität des designten Ligandenproteins oder Peptids zur restlichen Komplexstruktur. Diese Berechnungen können direkt nach der ersten Phase oder nach Abschluss der Berechnungen zur Faltungsspezifität durchgeführt werden.

Klicken Sie auf „Sequence #“, um die Sequenz auszuwählen, mit der die näherungsweise Bindungsaffinitätsberechnung beginnen soll. Der Benutzer wird zur Seite „Select Sequence“ weitergeleitet, die eine Liste der entworfenen Sequenzen zusammen mit ihren Rängen bezüglich Sequenzauswahl und Faltungspezifität anzeigt. Es kann jeweils nur eine Sequenz zur näherungsweisen Bindungsaffinitätsberechnung ausgewählt werden, da die Berechnungen sehr rechenintensiv sind. Nach Abschluss einer Sequenz kann der Benutzer eine weitere Sequenz auswählen, deren näherungsweise Bindungsaffinität berechnet wird; dieses Ergebnis wird zum vorherigen Ergebnis hinzugefügt und zeigt die näherungsweise Bindungsaffinität aller abgeschlossenen Sequenzen an. Sobald eine Sequenz ausgewählt und gespeichert wurde, wird der Benutzer zur „Main Control Page“ weitergeleitet.

Klicken Sie auf „Beginnen Sie Phase 2: Näherungsweise Bindungsaffinität“, um den Auftrag abzuschicken. Nach Abschluss werden die Ergebnisse an den Benutzer per E-Mail gesendet, einschließlich einer Anlage mit der Sequenznummer, der näherungsweisen Bindungsaffinität und den Werten der Zustandssummen in Gleichung 6. Für jeden weiteren Auftrag zur näherungsweisen Bindungsaffinität enthält diese Datei die Ergebnisse für alle abgeschlossenen Sequenzen. Vollständige Ergebnisse (aus Sequenzauswahl, Faltungspezifität und näherungsweiser Bindungsaffinität) können ebenfalls aufgerufen werden, indem die „Hauptsteuerseite“ für den Auftrag geöffnet wird (Abbildung 12).

Ergebnisse

De Novo-Design von Entry-Inhibitoren für HIV-1

Der in Protein WISDOM implementierte de novo-Design-Rahmen wurde für die Entwicklung von Inhibitoren-Peptiden für mehrere wichtige therapeutische Systeme verwendet (Tabelle 1 und 2). Ein bemerkenswertes System ist die Entwicklung von Peptiden zur Hemmung des Eintrags von HIV-1 in den Wirtszellrezeptor CD4, das hier als repräsentatives System dient, um die praktische Anwendung der Protein-WISDOM-Oberfläche zu demonst...

Diskussion

Das De-novo-Proteindesign-Framework besteht aus zwei Phasen, einer Sequenzauswahlphase und einer Validierungsphase. Das Framework ist robust genug, um starre und flexible Designvorlagen zu verarbeiten, und kann auf das Design einzelner Proteine oder komplexer Proteine angewendet werden. Das Framework wurde erfolgreich auf zahlreiche Proteinsysteme mit Anwendungen auf Dutzende von Krankheiten angewendet. Eine Reihe der Designs wurde experimentell validiert und liefert die wirksamsten Inhibitoren oder Agonisten ei...