Bau einer Hohe Auflösung Mikroskop mit Konventionelle und Holographic Optical Trapping Capabilities

Zusammenfassung

Das hier beschriebene System verwendet einen herkömmlichen optischen Falle sowie eine unabhängige holographische optische Trapping Linie, in der Lage ist das Erstellen und Bearbeiten mehrere Fallen. Dies ermöglicht die Erzeugung von komplexen geometrischen Anordnungen der refraktiven Partikel während auch eine gleichzeitige High-Speed, hochauflösende Messungen der Aktivität des biologischen Enzyme.

Zusammenfassung

Hochauflösende Mikroskop Systeme mit optischen Fallen zur exakten Manipulation der verschiedenen Brechungsindex Objekte, wie dielektrische beads ¹ oder Zellorganellen ^2,3, sowie hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung Auslesen von ihrer Lage relativ zu dem Zentrum der Falle. Das hier beschriebene System ist ein solches "traditionelle" Falle bei 980 nm arbeitet. Es ist weiterhin ein zweites optisches System, das Einfangen eines handelsüblichen holographischen Paket gleichzeitig Erstellen und Bearbeiten komplexer Trapping Muster in dem Sichtfeld des Mikroskops ^4,5 bei einer Wellenlänge von 1.064 nm verwendet. Die Kombination der beiden Systeme erlaubt die Manipulation von mehreren brechenden Objekte zur gleichen Zeit, während gleichzeitig leiten hoher Geschwindigkeit und hoher Auflösung Messungen von Bewegung und Kraft Produktion in Nanometer-und Pikonewton Skala.

Einleitung

Optical Trapping ist eine der wichtigsten Techniken in der Biophysik ^6. Ein entscheidender Fortschritt in der optischen Pinzetten wurde die Entwicklung von holographischen Fallen, die für die Erstellung von dreidimensionalen Trapping Muster eher als herkömmliche Punkt Fallen ⁷ zu ermöglichen. Solche holographische Fallen besitzen den Vorteil, Vielseitigkeit in der Positionierung der refraktiven Objekten. Allerdings herkömmlichen Fallen kann leicht angepasst werden, um mehr symmetrische als handelsübliche holographische Kits. Sie erlauben auch für schnelle präzise Abtastung der eingefangenen Objekte. Hier beschreiben wir ein System (1), die die beiden Trapping-Ansätze kombiniert in einem Gerät und ermöglicht dem Benutzer die Vorteile des gegebenenfalls zu nutzen.

Die allgemeinen Erwägungen der Aufbau von optischen Fallen (bezogen auf einzelne oder mehrere Laserstrahlen) werden an anderer Stelle ausführlich diskutiert ^8-10. Hier skizzieren wir die Überlegungen speziell für unsere sETUP und bieten Detail unserer Alignment-Prozedur. So sind Systeme mit zwei optischen Strahlen Trapping bereits beschrieben (zB ref. ^11), typischerweise unter Verwendung eines Laserstrahls zum Erfassen eines refraktiven Objekt und mit der anderen (absichtlich Strahl mit niedriger Leistung) zum Auslesen der entkoppelten Position des eingeklemmten Gegenstandes . Hier müssen jedoch beide Laserstrahlen zu hoher Leistung (300 mW oder mehr), da sowohl zum Einfangen verwendet werden. Für Messungen von biologischen Systemen sollten die Laser zum Einfangen optimal genutzt innerhalb einer bestimmten Wellenlänge NIR Fenster fallen lichtinduzierten Proteinabbau ¹ zu minimieren. Hier haben wir gewählt, um 980 nm Diode und 1.064 nm DPSS-Laser wegen ihrer geringen Kosten, hohe Verfügbarkeit und einfache Bedienung zu verwenden.

Wir haben auch entschieden, eine Licht-Raum-Modulator (SLM) zum Erstellen und Bearbeiten von mehreren Fallen gleichzeitig in Echtzeit ^4,5. Diese Vorrichtungen sind im Handel erhältlichjedoch deren Integration in ein komplettes Setup präsentiert einzigartige Herausforderungen. Hier beschreiben wir einen praktischen Ansatz, diese potenziellen Schwierigkeiten befasst und bietet ein sehr vielseitiges Instrument. Wir stellen eine explizite Beispiel für die spezifische Konfiguration beschrieben, die als Führung für modifizierte Designs verwendet werden können.

Protokoll

Ein. Einbau von 980 nm Wellenlänge einzigen optischen Falle

1. Optical Trapping bei 980 nm Wellenlänge ist oft optimal für Biophysik Experimente und kostengünstige Laserdioden leicht verfügbar mit einer Leistung bis zu 300 mW sind. Es ist bevorzugt, einen Diodenlaser mit polarisationserhaltenden Monomode-Faser mit einer bekannten Modenfelddurchmesser Anschlusslitze werden. Die Faser muss ausreichend lang sein, um als eine Art Filter wirken und in der Regel entweder mit einem FC / PC oder FC / APC Buchse. Davon ist der FC / APC bevorzugt zu minimieren zurück Reflexion von Licht und potenzielle Feedback Instabilitäten.
2. Sichern Sie die 980 nm Laserdiode in einer Halterung, die nach Macht und Temperaturregelung ermöglicht. Es ist am besten, um die Halterung auf einem optischen Tisch fixieren direkt an passive Wärmeableitung zu maximieren und minimieren dadurch die Gefahr der Diode Ausfall aufgrund einer Fehlfunktion des Temperatur-Controller.
3. Montieren Sie den PC / APC Faser-Stecker an den Strahlkollimationsvorrichtung Optik. Es istkritisch, um sicherzustellen, dass die gebündelten Strahl minimal Divergenz haben so einstellbar Glasfaser-Ports am nützlichsten sind. Stellen Sie sicher, dass die gewählte LWL-Port die Modenfelddurchmessers der Diode Pigtailfaservorrat übereinstimmt. Wenn der Strahl gerastert mit akusto-optischen Deflektoren (AOD) oder elektro-optischen Deflektoren werden (EOD), wird der kollimierte Laserstrahl Taille muß auch geringfügig kleiner als die Größe der Öffnung des Deflektors.
4. Sichern Sie die Kollimation Adapter zur optischen Tisch in ausreichender Entfernung vom Mikroskop für Strahl-Routing, Expansion, und die Platzierung der anderen gewünschten Komponenten zu ermöglichen. Stellen Sie die LWL-Port, um konsistente Strahltaille über Distanzen vergleichbar gesamten Strahlengang des Mikroskops zu gewährleisten.
5. Installieren Spiegel in 1 gezeigt. Entfernen Sie das Ziel aus dem Mikroskop und die Spiegel zu routen den Strahl durch die Öffnung in dem Ziel Montage der Bühne. Falls gewünscht, kann die Platzierung des dichroitischen Spiegeln DM1 und DM3 bis entfallenspäter. DM2 und DM3 sind beide Kurzpass und übertragen sichtbares Licht reflektiert, während in der Nähe von IR und höher.
6. Es ist hilfreich, zeitweise einhängen einen Laserpointer anstelle des Ziels, der auf der optischen Achse des Mikroskops ausgerichtet. Eine benutzerdefinierte mechanischen Adapter ist notwendig um die Zentrierung der Laser-Pointer zu gewährleisten. Sichtbar Strahl von dem Laser-Pointer kann dann zurück in die Mitte der Apertur der Faser-Port geleitet werden und kann dann verwendet werden, um die Linsen (siehe unten) zu installieren.
7. Installieren Sie den 980 nm Strahl-Expander (L8 und L9) bei einer geeigneten Abstand von der LWL-Port für zukünftige Einsetzen Lenkkomponenten (AOD oder EOD) nach Bedarf ¹ zu ermöglichen. Der Strahl muss erweitert leicht überfüllen zurück Blendenöffnung des Objektivs. (Hier sind Objektive mit Brennweiten von 125 mm und 60 mm in einer Kepler-Anordnung, um etwa das Doppelte der Strahltaille). Verwenden sichtbaren Laserpointer (siehe Abschnitt 1.6), um die ordnungsgemäße Platzierung Linse und grobe Ausrichtung zu gewährleisten.
8. Install die 980 nm Lenkung Linsen (L2 und L3) in einem Teleskop Anordnung wie angegeben (hier haben beide 60 mm Brennweite) ^1. L3 ist in einer konjugierten Ebene zum Back-Brennebene des Objektivs angebracht ist. Berg L3 auf einer Präzisionswaage XYZ Positionierung der Bühne für Strahlsteuerungseinrichtung ermöglichen. Es ist hilfreich für die XYZ-Bühne zu digitalen Indikatoren für seine Mikrometern aufweisen, so dass für wiederholbare Positionierung und Neupositionierung der Falle. Die 0,5 "-Bereich des Reisens ist in der Regel ausreichend, kann aber mehr Reise für L3 Positionierung entlang der optischen Achse hilfreich sein. Verwenden sichtbaren Laserpointer (siehe Abschnitt 1.6), um die ordnungsgemäße Platzierung Linse und grobe Ausrichtung zu gewährleisten.

2. Installation der Laser-Detektor

1. Installieren des dichroitischen Spiegel DM3 über dem Kondensator, wie in 1 gezeigt. Eine benutzerdefinierte Halterung ist in der Regel erforderlich. Sichern der Quad Photodiode (QPD) oder eine positionsempfindlichen Detektor (PSD) ⁸ an der Seite des Kondensator-Vorrichtung und ensure, dass die 980 nm Laserstrahl reflektiert DM3 trifft es etwa auf Mitte. Bei Verwendung QPD, sicherzustellen, dass es in einem kleinen XY-Tisch angebracht ist, um für die genaue Zentrierung des Sensors auf den Laserstrahl zu ermöglichen.
2. Installieren Sie L1 (in der Regel ein 30-mm-Objektiv) zwischen DM3 und dem Sensor. Position L1, um den Strahl auf einen einzigen Punkt auf dem Sensor zu konzentrieren.
3. Installieren Sie den Notch-Filter, kurz bevor L1 um die 1.064 nm Strahl sowie jede streunende sichtbares Licht Reflexionen aus dem Mikroskopleuchte und Ambientebeleuchtung blockieren.

3. Die Installation von 1.064 nm Wellenlänge Holographic Falle

1. Die holographische Teil des Setups ist um einen kommerziell erhältlichen Hardware / Software-Paket Die holographischen Spiegel in diesem Paket verwendet werden, um eine maximale Leistung von 5 Vorfall oder 10 W / cm ² bewertet werden gebaut. Single-Modus TEM00 Strahlen in diesem Leistungsbereich kann leicht von einem DPSS-Laser bei 1064 nm Wellenlänge bezogen werden.
2. Montieren Sie die 1.064 nm Laser auf einem erhöhtenPlattform, um sich in etwa die Höhe der Strahlengang für die Linie 980 (siehe Abschnitt 1).
3. Wenn nicht direkt steuerbar ist, kann Laserleistung manuell durch den Einbau einer Halbwellenplatte (HWP) und einen Polarisator (PBS) unmittelbar nach Laserausgang Öffnung eingestellt werden. Es ist hilfreich, um den Polarisator in einem Drehtisch montieren zu können holographischen Spiegels Anforderung Strahlpolarisation entsprechen.
4. Installieren Sie die 1.064 nm Beam Expander (L6 und L7). Der Laserstrahl muss Taille erweitert, um die Diagonale des holografischen Spiegel angepasst werden. Bei großen Expansionsverhältnis (über 10fach) kann es ein Anliegen, um die Größe des Expanders klein ist. So kann es wünschenswert sein, Linsen mit ungewöhnlich kleinen Brennweite verwenden (hier: 16 mm und 175 mm).
5. Installieren Sie die anderen Spiegel wie angegeben, um die 1.064 nm Strahl durch das Ziel zu lenken.
   1. Sichere DM1 dichroitischen (45 ° Einfallswinkel) in einer kinematischen Halterung, und legen Sie die Assembly im 980 nm Strahlengang, so dass es für undiminishe erlaubtd Übermittlung dieser Strahl.
   2. Aktivieren Sie den Laserpointer. Der Spiegel DM1 widerspiegeln sollte ausreichende Menge sichtbaren Lichts, um richtig zu positionieren, der räumliche Lichtmodulator (SLM) in dem Weg dieses Strahls. Das SLM muss auch so abgewinkelt, dass die ein-und ausgehenden Laserstrahlen werden so nah wie möglich an senkrechtem Einfall. Jedoch der Einfallswinkel muss ausreichend groß sein, um sicherzustellen, daß der Laserstrahl nicht durch Linsenfassungen und andere optische Komponenten befestigt. Eine Winkel von 5 ° sollten leicht erreichbar und ausreichend klein ist. Schließlich ist der Abstand von dem SLM DM1 muss genau gemessen werden, so dass das Einsetzen von Linsen L4 und L5 (siehe 3.6) können die SLM Spiegelebene und die Back-Brennebene des Objektivs konjugierten.
   3. Installieren Sie einen Spiegel, um das Licht von 1.064 nm Beam Expander an den SLM zu lenken. Stellen Sie sicher, dass die Laser-Pointer Licht die Beam Expander Öffnung in der Mitte trifft.
6. Installieren Linsen L4 und L5 (hier: Linsen mit 125 mm bzw. 200 mm). Dieses Teleskop Paar Konjugate SLM Spiegelebene an der hinteren Brennebene des Objektivs und reduziert auch die Strahltaille nur leicht überfüllen hinteren Apertur des Objektivs. Wir entschieden uns für Objektive mit langen Brennweiten, um Platz zu der SLM vom DM1. Dadurch wird nicht nur löscht Raum für den zweiten Laser-Linie, sondern auch dazu führt, daß die Ausrichtung zu erleichtern.
7. Entfernen Sie den Laserpointer. Lassen Sie die Montage-Adapter als grobe Ausrichtungsöffnung dienen.

4. System-Installation und Ausrichtung Hinweise

1. Linse L3 und SLM muss so angeordnet sein, dass sie optisch konjugiert an der hinteren Brennebene des Objektivs. Der gemeinsame Schwerpunkt der L4 und L5 optisch konjugiert zu der Probenebene, wenn die optischen Strahlen in Trapping Unendlichraum des Mikroskops injiziert.
2. singen IR-Karte Betrachter ausrichten 980 nm Strahl entlang der Mittelachse der Öffnung in der Laserpointer Adapter gehen.
3. Mit IR-Karte to dass der 1.064 nm Strahl der gleichen Stelle wie der Strahl 980 nm auf DM1, L2 und L3 und die 1.064 nm Strahl geht entlang der Mittelachse der Öffnung in der Laserpointer Adapter trifft.
4. Tauschen Sie die Laser-Pointer mit Montage-Adapter ein Ziel. Hohe numerische Apertur Öl oder Wasser Ziel ist typisch.
5. Richten Sie die 980 nm Falle wie in ⁹ von "Walking" den Laserstrahl bis ein radialsymmetrischen Interferenzmuster auf der Kamera gesehen wird beschrieben.
6. Mit dem holografischen Spiegel aus (dh als passiver Spiegel) verwenden SLM und DM1 zu "gehen" die ungebeugten 1.064 nm Strahl auf die 1.064 nm Falle auszurichten.
7. Der SLM erzeugt eine erhebliche gebeugte Strahl, der in einem starken unbeweglichen Laserfalle in dem Sichtfeld ergibt. Dies ist nützlich für die Ausrichtung kann jedoch unerwünscht sein Experimenten. Um diese Falle blockieren kann man eine kleine undurchsichtiges Objekt in dem Weg des gebeugten Lichts an der Stelle einzufügen Konjugat zur Probenebene (zB the gemeinsamen Brennpunkt von L4 und L5). Die Größe dieser zentralen Stelle Blocker muss etwas größer als der Durchmesser des Airy-Scheibe für den fokussierten Lichts (a-Blocker mit 100-300 Mikrometer Durchmesser des Systems beschrieben).
8. djust 1.064 nm Strahlpolarisation mit dem Polarisator SLM Orientierung entsprechen. Drehen der Halbwellenplatte, um die Ausgangsleistung des Strahls wie gewünscht einzustellen.
9. Falls gewünscht, legen AOD oder EOD Strahlsteuerungseinrichtung Elemente in die 980 nm Laserlinie. Ordnungsgemäße Konjugation dieser Elemente an den Back-Brennebene des Objektivs und neu ausrichten die Falle. Es ist hilfreich, um die Lenk-Elemente auf einer Bühne goniometrischen montieren.

Ergebnisse

Die zusammengebaute Konfiguration kann der Bediener mehrere brechende Objekte in Echtzeit zu stoppen und positionieren sie in allen drei Dimensionen innerhalb des Sichtfeldes. Wir zeigen die holographische Möglichkeiten des Instruments durch Abfangen 11 Mikrokugeln (Abbildung 2). Die Falle Begrenzung jedes Objekt wird manuell auf Trapping, so dass die endgültige Anordnung das Logo der University of Utah, wo dieses Experiment durchgeführt wurde zeigt neu positioniert. Eine kombinierte Funktion des hologr...

Diskussion

Wir haben ein Instrument, das zwei optischen Fallen verschiedener Typen (Abbildung 1) kombiniert, um Trapping separaten Einrichtungen für Objekt Manipulation und Messung bieten konstruiert. Die "klassischen" optischen Falle wird um einen 980 nm Diodenlaser gebaut. Dieser Strahl wird erweitert, gelenkt und dann in unsere inversen Mikroskop injiziert ("light red" Balken in Abbildung 1). Das holographische optische Falle wird um eine 1.064 nm DPSS Laser gebaut. Der Stra...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Optischer Tisch	Newport corporation	ST-UT2-56-8	Irvine, CA
Mikroskop, invers, Eclipse Ti	Nikon USA	MEA53220	Melville, NY
Plan apo 100X Ölobjektiv (1.4 NA)	Nikon USA	MRD01901	Melville, NY
Ölkondensor Objektiv 1.4 NA	Nikon USA	MEL41410	Melville, NY
EMCCD-Kamera	Andor-Technologie USA	Ixon DU897	South Windsor, CT
1/3" CCD IEEE1394 Kamera	NET USA Inc	Foculus FO124SC	Highland IN
Laser, TEM00, SLM, 1.064 nm Wellenlänge	Klastech Laser Technologies	Senza-1064-1000	Dortmund;
Deutschland Laserdiode, TEM00, SLM, 980 nm	Axcel Photonics	BF-979-0300-P5A	Marlborough, MA
Laserdiodenhalterung	ILX Lightwave	LDX-3545, LDT-5525 und LDM-4984	Bozeman, MT
einstellbare Faseranschlüsse	Thorlabs	PAF-X-11-B	Newton, NJ
holographisches System	Arryx	HOTKIT-ADV-1064	Chicago, IL
holografisch Spiegel	Boulder Nichtlineare Systeme	dies ist ein Teil von HOTKIT-ADV-1064	Lafayette, CO
Calcit Polarisator	Thorlabs	GL10-B	Newton, NJ
Halbwellenplatte	Thorlabs	WPH05M-1064	Newton, NJ
Polarisator Rotationshalterung	Thorlabs	PRM1	Newton, NJ
Halbwellenplatte Rotationshalterung	Thorlabs	RSP1	Newton, NJ
Shutter	Thorlabs	SH05	Newton, NJ
dichroitische Spiegel (DM2 & DM3); 45 & Grad; AOI	Chroma Technology	t750spxrxt	Bellows Falls, VT
dichroitischer Spiegel (DM1); 45 > AOI	Thorlabs	DMSP1000R	Newton, NJ
kundenspezifischer mechanischer Adapter	Thorlabs	SM1A11 und AD12F mit vergrößerter Innenbohrung	Newton, NJ
Kerbfilter	Semrock	FF01-850/310-25	Rochester, NY
Akustooptischer Deflektor (2-Achsen)	intraAction	DTD-584CA28	Bellwood, IL
goniometrischer Tisch	Neuer Focus	9081	Santa Clara, CA
60 mm Lenkgläser	Thorlabs	LA1134-B	Newton, NJ
16 mm asphärische Expander-Linse	Thorlabs	AC080-016-C	Newton, NJ
175 mm Expander-Linse	Thorlabs	LA1229-C	Newton, NJ
Spotblocker (Cabrón-Stahl-Kugel)	Bal-Tec	0,0100" Durchmesser	Los Angeles, CA
Mikrosphären ( Carboxyl-polystyrol)	Spherotech	CP-45-10	Lake Forest, IL