Bestimmung der tolerierbaren Fettsäuren und Cholera Toxin-Konzentrationen mit menschlichen Darm-Epithelzellen und BALB / c Maus-Makrophagen

Zusammenfassung

Wir wollten tolerierbaren Konzentrationen von drei Fettsäuren (Ölsäure, Linolsäure und Linolensäure) und Cholera-Toxin nicht wesentlich und nachteilig beeinflussen hat das Überleben der Zelle durch das Lösen der Fettsäuren und das Toxin und mit ihnen in das Überleben der Zelle Assays zu bestimmen.

Zusammenfassung

Die positive Rolle von Fettsäuren in der Prävention und Linderung von nicht-menschlichen und menschlichen Krankheiten wurden und weiterhin umfassend dokumentiert werden. Diese Rollen sind Einflüsse auf infektiösen und nicht-infektiösen Krankheiten einschließlich Prävention von Entzündungen sowie Schleimhaut-Immunität gegen Infektionskrankheiten. Cholera ist eine akute Darm-Erkrankung, die durch das Bakterium Vibrio cholerae verursacht wird. Es tritt in den Entwicklungsländern, und wenn sie unbehandelt, kann zum Tod führen. Während Impfstoffe gegen Cholera existieren, sind sie nicht immer effektiv und vorbeugende Methoden erforderlich sind. Wir wollten tolerierbaren Konzentrationen von drei Fettsäuren (Ölsäure, Linolsäure und Linolensäure) und Cholera-Toxin mit der Maus BALB / C Makrophagen und humanen intestinalen Epithelzellen, bzw. zu bestimmen. Wir solubilisiert die oben genannten Fettsäuren und verwendet Zellproliferationsassays die Konzentrationsbereiche und spezifische Konzentrationen der Fettsäuren, die nicht bestimment schädlich für die menschliche Darm-Epithelzellen Lebensfähigkeit. Wir solubilisiert Cholera-Toxin und benutzte es in einem Test, um die Konzentrationsbereiche und spezifische Konzentrationen von Cholera-Toxin, die nicht statistisch nicht verringern die Lebensfähigkeit der Zellen in BALB / C Makrophagen bestimmen.

Wir fanden die optimale Fettsäure-Konzentrationen zwischen 1-5 ng / ul, und dass für die Cholera-Toxin auf <30 ng pro Behandlung sein. Sein Diese Daten können helfen zukünftige Studien, die eine schützende Schleimhaut Rolle Fettsäuren in der Prävention oder Linderung von Cholerainfektionen finden sollen.

Einleitung

Die gesundheitlichen Vorteile von Fettsäuren, wie Ölsäure, Linolsäure und Linolensäure waren und sind weiterhin zu dokumentieren. Zum Beispiel hilft Ölsäure erleichtern das Eindringen von lipophilen Arzneistoffen im Körper ^1,2 reduziert koronaren Herzerkrankung um 24%, wenn für gesättigte Fettsäuren ³ substituiert ist, und dient dazu, Stoffwechselerkrankungen wie Adrenoleukodystrophy ^4, die eine ist, X-chromosomale behandeln genetische Störung des Fettsäurestoffwechsels. . Während eine notwendige Vorstufe für Arachidonsäure in Säugetieren, Linolsäure (anders als Ölsäure) wird nicht vom Körper synthetisiert und muss durch externe Quellen wie zB durch Leinsamen Verbrauch erzielt werden ⁵ Studien zeigen mehrere positive Auswirkungen auf die Gesundheit von Linolsäure wie: Anti-Aging-Eigenschaften für die Haut; ⁶ entzündungshemmende Eigenschaften; ⁷ reduzierte Proliferation von Darm-und Prostata-Karzinom-Zellen; ⁸ und die Fähigkeit zur Bekämpfung von Adipositas und Förderung of Herz-Kreislauf-Gesundheit. ⁹ Linolensäure spielt eine Rolle bei der Verringerung der parodontalen Entzündung, ¹⁰ und modulierende Thromboxan und Prostacyclin-Biosynthese. ¹¹

Arpita ¹² untersuchten den Einfluss der Galle Fettsäuren und Cholesterin auf V. cholerae 's Ausdruck von Virulenzfaktoren und Beweglichkeit. Yamasaki ¹³ angedeutet, dass Methanol-Extrakt aus roten Chilischoten und anderen natürlich extrahierten Verbindungen können möglicherweise verringern Cholera-Toxin-Produktion. Denkbar ist es, die Verwendung von Lebensmittel-Produkten, die reich an den oben genannten Fettsäuren (wie Leinsamen) bei der Vorbeugung und Linderung von Infektionskrankheiten wie Cholera durch die Bereitstellung von Schleimhaut-Immunität sind zu berücksichtigen. Wir haben Untersuchungen an Fettsäuren löslich zu machen und zu bestimmen, unter Verwendung Zellproliferationsassays, die maximale Konzentration der Fettsäuren, die humanen intestinalen Epithelzellen ohne nachteilige Auswirkungen auf ce vertragenll Lebensfähigkeit. Wir vermuten, dass Öl-, Linol-und Linolensäure eine positive Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen bei niedrigeren Konzentrationen enthalten, aber dass bei höheren Konzentrationen werden sie für die Zellen toxisch. Wir haben auch die gelösten Cholera-Toxin und bestimmt die maximale Konzentration von Cholera-Toxin, dass BALB / C Maus-Makrophagen können, ohne einer signifikanten Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen zu tolerieren. Wir vermuten, eine toxische Wirkung von Cholera-Toxin auf die Lebensfähigkeit der Zellen auch bei sehr niedrigen Niveau. Das Verfahren zur Solubilisierung eine Cholera-Toxin und benutzen, um die maximale Menge des Toxins, dass die Zellen ohne einer signifikanten Abnahme der Überlebensfähigkeit tolerieren bestimmen stellt einen Vorteil für künftige Studien. Zum Beispiel kann eine Kombination der oben genannten Methoden zu bestimmen, ob Zellen bereitzustellen Fettsäuren mit Schleimhaut-Immunität gegen Cholera Infektionen. Nach bestem Wissen versichern wir, hat dies rational und Methodik nicht erforscht worden.

Wir discuss wie unsere vorläufigen Daten in späteren Untersuchungen kann verwendet werden, um festzustellen, ob Öl-, Linol-und Linolensäure bieten Zellen mit Schleimhaut-Immunität gegen Cholera-Infektion.

Protokoll

1. Tissue Culture

1. Verwenden Mus musculus Makrophagen (BALB / c-Mäusen) für Cholera-Toxin Bestimmungen. Zunächst Kultur alle M. musculus Zellen nach Anweisungen des Herstellers.
2. Propagieren BALB / c-Mäusen Zellen in Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium mit L-Glutamin mit 10% fötalem Rinderserum abgeschlossen und 1% Antibiotikum / Antimykotikum oder RPMI 1640 Basismedium mit 10% fötalem Kälberserum, 5% L-Glutamin und 1 abgeschlossen % Antibiotikum / Antimykotikum Reagenz.
3. Wachsen Zellen in 75 cm ² Corning Kolben mit belüfteten Deckeln bei 37 ° C, 95% Luft und 5% CO _2.
4. Rufen Sie humanen intestinalen Epithelzellen innerhalb von 24 Stunden der Lieferung nach den Anweisungen des Herstellers für die Bestimmung von Fettsäure-Bestimmungen.
5. Propagieren der menschlichen Darm-Epithelzellen in 75 cm ² Corning Kolben mit belüfteten Deckeln in HybriCare Medien mit 10% FBS und 30 ng / ml humanen EGF bei 37 ° C abgeschlossen Verwenden Sie keine Antibiotika/ Antimykotikum Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers.
6. Split alle Zellen (1:3) bei ca. 70% Konfluenz.
7. Frieren und bringen alle Zellen während der gesamten Studie unter Verwendung von Standard-Protokollen Einfrieren.
8. Hinweis: Bei größeren Maßstab Bestimmung der Konzentration von Fettsäuren, verwenden Sie den schneller wachsenden, leichter zu pflegen, Maus Makrophagen zunächst. Für feine Skala Fettsäurekonzentration Bestimmung, verwenden menschlichen Epithelzellen. Mit der Maus Makrophagen für alle Cholera-Toxin Behandlungen (siehe Diskussion).

2. Fettsäure und Cholera Toxin Behandlungen

1. Übertragen Ölsäure, Linolsäure und Linolensäure aus Unternehmen bereitgestellte Glasampullen, die sterilisiert Glasfläschchen.
2. Übertragen jedes Fettsäure zu einem separaten sterilisiert Eppendorf-Röhrchen und lösen sich zunächst in 100% Ethanol bei einer Verdünnung von 1:6, und dann in RPMI 1640 unvollständig Medien für eine Endkonzentration von 10 ug / ul.
3. Vortex jede Lösung und transfer es Glasfläschchen zur Speicherung in dem Gefrierfach (-20 ° C).
4. Platte Zellen bei 2.500 Zellen / Well in 96-Well-Gewebekulturplatten.
5. In die entsprechenden vollständigen Medien, um die insgesamt gut auf 200 ul für die Behandlung von Zellen mit Fettsäuren in Vorbereitung MTT-Assays zu bringen.
6. Nach einem 24-Stunden-Zeitraum Proliferation, entfernen Sie die Medien und ersetzen Sie es mit frischem Medium.
7. Fügen Sie die entsprechenden Konzentrationen der einzelnen Fettsäuren zu den Vertiefungen getestet werden (siehe Ergebnisse). In komplette Medien, die insgesamt gut Volumina bis 200 ul zu bringen.
8. Inkubieren der behandelten Platten 24 Stunden vor Beginn des MTT-Tests.
9. Lösen Sie das Cholera-Toxin in PBS in einer Konzentration von 1 mg / ml und Aliquot der Lösung in Kryoröhrchen und speichern die Kryoröhrchen bei 2-8 ° C.
10. Zur Zell-Behandlungen, verdünnt 1:100 in das Toxin entweder sterilisiert PBS (pH 7,4) oder unvollständig DMEM für eine endgültige Arbeitskonzentration von 1 ng / ul.
11. Um Zellen mit Cholera-Toxin in BehandlungVorbereitung MTT Assays Platte Zellen wie oben beschrieben.
12. Nach einem 24-Stunden-Zeitraum Proliferation, fügen Sie die entsprechenden Konzentrationen von Cholera-Toxin (für unsere Konzentration, siehe Ergebnisse), um den Brunnen nach den Verfahren in Fettsäure-Anwendungen (oben) getestet werden.
13. Inkubieren der behandelten Platten 24 Stunden vor Beginn des MTT-Tests.
14. Als positiver (positive C während des Papiers) und Negativkontrolle (negative c), die sowohl Fettsäure und Choleratoxin Behandlungen inkubieren Zellen mit Vollmedium und 70% Ethanol auf.
15. Für alle Proben und Behandlungen mit einem Minimum von drei Wiederholungen (n = 3), mit mehr Wiederholungen für positive Kontrollen (n = 6 in dieser Studie).

3. MTT Assay

1. Machen Sie eine MTT-Stammlösung zu einer Konzentration von 2,5 mg / ml.
2. Entfernen Sie die Lösung in jede Vertiefung der 96-Well-Platte getestet werden und ersetzen Sie es mit 200 ml frisches komplette Media-Lösung.
3. Add 10 ul der MTT-Lösung in jede Vertiefung.
4. Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 3-4 Stunden.
5. Entsorgen Sie die Media-Lösung und 100 ul 0,04 M HCl in Isopropanol in jede Vertiefung.
6. Inkubieren der Platte bei Raumtemperatur für fünf Minuten.
7. Übertragen Sie die Lösung aus jeder Vertiefung in eine neue Zentrifugenröhrchen.
8. Zentrifugieren bei 20000 × g bei Raumtemperatur für 1 Minute oder bis ein Granulat gebildet wird.
9. Der Transfer zwischen 20-40 ul jeder Probe auf einem Mikroplatten-Lesegerät.
10. Optische Dichte bei 570 nm mit einem Spektralphotometer.

Ergebnisse

Bestimmung der optimalen Konzentration von Fettsäuren

Die optimale Konzentration für die Fettsäuren ist als die maximale Konzentration, bei der das Zellwachstum ist vergleichbar oder übersteigt die Kontrollzellen, mit relativ geringen Schwankungen bei den Ergebnissen festgelegt. Um die optimale Konzentration von Ölsäure zu bestimmen, Linol-und Linolensäure Zellen wurden zunächst mit verschiedenen Konzentrationen von jeder Fettsäure in großen Schritten und dann mit kleineren Schritten behandelt....

Diskussion

Tipps der Konzentration von Fettsäuren und Cholera Toxin

Zwar ist der genaue Mechanismus, wie Fettsäuren verbessern Schleimhaut-Immunität ist unbekannt, haben mehrere Studien versucht, ihre positiven Wirkungen zu untersuchen. Unsere Studie soll Methode bereitzustellen, um die maximale Konzentration an Fettsäuren, die Zellen als auch die maximale Konzentration von Choleratoxin tolerieren kann, dass Zellen ohne einen signifikanten Einfluß auf das Überleben der Zelle zu bestimmen tolerieren.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Cells/Reagenz
Mus musculus Makrophagen	ATCC	ATCC RAW 264.7
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	ATCC	30-2002
L-Glutamin	ATCC	30-2115
Fötales Rinderserum	Bio-west	S0250
Antibiotikum/ Antimykotikum	Hyklon	SV3007901
Menschliche Darmepithelzellen	ATCC	ATTC CCL-241
HybriCare Medien	ATCC	46-X
Ölsäure	Sigma-Aldrich	O1008
Linolensäure	Sigma-Aldrich	L-1376
Linolensäure	Sigma-Aldrich	L-2376
Choleratoxin	Sigma-Aldrich	C8052<
BD Falcon 96-Well Zellkulturplatten	BD Biosciences	351172
Spektralphotometer mit Dynex Revelations 4.22 Software	Dynex	91000101