Method Article

Effiziente Agroinfiltration von Pflanzen für High-Level-Transient Expression von rekombinanten Proteinen

DOI:

10.3791/50521

⸱

July 23rd, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The College of Technology and Innovation, Center for Infectious Disease and Vaccinology, The Biodesign Institute, Arizona State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pflanzen bieten ein neuartiges System für die Produktion von pharmazeutischen Proteinen in einem kommerziellen Maßstab, die besser skalierbare, kosteneffiziente und sichere als aktuellen Ausdruck Paradigmen ist. In dieser Studie berichten wir über eine einfache und bequeme, aber skalierbaren Ansatz zur Ziel-Gen enthält, einführen Agrobacterium tumefaciens In Anlagen zur Protein transiente Expression.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Säugerzellen ist das wichtigste Plattform für die kommerzielle Produktion von menschlichen Impfstoffen und therapeutischen Proteinen. Allerdings kann es nicht die steigende weltweite Nachfrage nach Arzneimitteln wegen seiner begrenzten Skalierbarkeit und hohe Kosten. Pflanzen haben gezeigt, dass eine der vielversprechendsten alternativen pharmazeutischen Produktion Plattformen, die robuste, skalierbare, kostengünstige und sicher sind. Die jüngste Entwicklung von Virus-basierten Vektoren hat rasche und High-Level transiente Expression von rekombinanten Proteinen in Pflanzen erlaubt. Zur weiteren Optimierung der Nützlichkeit des transienten Expressionssystem zeigen wir eine einfache, effiziente und skalierbare Methode zur Target-Gen, das in Agrobacterium Pflanzengewebe einzuführen in dieser Studie. Unsere Ergebnisse zeigen, dass sowohl mit Agroinfiltration Spritze und Vakuumverfahren bei der effizienten Einführung von Agrobacterium in Blätter und robuste Produktion von zwei fluoreszierenden Proteinen geführt haben; GFP und DsRed. Fernerdemonstrieren wir die einzigartigen Vorteile von beiden Methoden angeboten. Spritze Infiltration ist einfach und braucht keine teure Ausrüstung. Es ermöglicht auch die Flexibilität, um entweder die gesamte infiltrieren verlassen mit einem Ziel-Gen oder von Genen von mehreren Zielen auf ein Blatt einzuführen. So kann es für Labormaßstab Expression rekombinanter Proteine ​​sowie für den Vergleich verschiedener Proteine ​​oder Vektoren für die Ausbeute oder Expressionskinetik verwendet werden. Die Einfachheit der Spritze Infiltration schlägt auch ihre Nutzbarkeit in der High School und College-Ausbildung für das Fach Biotechnologie. Im Gegensatz dazu ist Vakuuminfiltration robuster und Scale-Up für die kommerzielle Herstellung von pharmazeutischen Proteinen. Es bietet auch den Vorteil, dass sie in der Lage, Pflanzenarten, die nicht zugänglich sind für Spritze Infiltration wie Salat und Arabidopsis agroinfiltrate. Insgesamt bietet die Kombination aus Spritze und Vakuum Agroinfiltration Forscher und Pädagogen eine einfache, effiziente und robusteMethodik für die transiente Proteinexpression. Es wird dadurch wesentlich erleichtert die Entwicklung von pharmazeutischen Proteinen und Förderung von Wissenschaft Bildung.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seit den 1970er Jahren haben die Pflanzen als Alternative zu Säugetier-, Insekten-und bakteriellen Zellkulturen für die kommerzielle Produktion von rekombinanten Proteinen und Protein-Therapeutika 1 untersucht. Plant-basierte Systeme für die Expression von Biopharmazeutika haben Versprechen in den letzten Jahren als mehrere neue Behandlungen für Krankheiten, wie Morbus Gaucher 2 und aviäre Influenza H5N1 3 dargestellt ist, haben gezeigt, Erfolg in klinischen Studien. Die Entwicklung von Mechanismen für die zuständigen Expression rekombinanter Proteine ​​in Pflanzen in den Jahrzehnten seit den ersten Versuchen hat das Potenzial für eine Anlage-basierte Systeme, um die aktuelle Paradigma der Protein-Produktion für drei Hauptgründe verändern erstellt. Erstens gibt es eine bemerkenswerte Abnahme der Kosten als Säugetier-, Insekten und Bakterien Bioreaktoren erfordern erhebliche Anlaufkosten, teure Nährmedien und komplizierte Prozesse für Downstream-Reinigung 4. Die Schaffung von stabilen transgenen PflanzeLinien ermöglicht ihnen auch die Skalierbarkeit der Systeme übertreffen anderen Ausdruck als Protein exprimieren Pflanzen angebaut und geerntet werden in einem landwirtschaftlichen Skala 5. Zweitens, auf pflanzlicher Basis Ausdruck Systeme deutlich reduzieren das Risiko der Übertragung eines menschlichen oder tierischen Erreger aus dem Protein-Expression Host für den Menschen, zeigt Überlegenheit in der öffentlichen Sicherheit 6. Schließlich verwenden Pflanzen einen eukaryotischen Endomembransystem ähnlich Säugerzellen ist, für eine angemessene posttranslationale Modifikation von Proteinen einschließlich Glycosylierung und der Zusammenbau von mehreren Untereinheit Proteine ​​7. Diese Fähigkeit bringt pflanzliche Systeme vor solche auf Basis von prokaryotischen Systemen, wie Bakterien, da eine größere Anzahl von pharmazeutischen rekombinanten Proteinen, einschließlich monoklonale Antikörper (mAbs), eine kompliziertere Struktur und erfordern umfangreiche posttranslationale Modifikationen oder Anordnung 8.

Es gibt zwei große entspreschmerzt zu Expression rekombinanter Proteine ​​in Pflanzen. Die erste ist die Entwicklung einer stabilen transgenen Linie, wobei DNA, die für das Zielprotein in eine Expressionskassette kloniert und eingeführt, um die Kern-oder Chloroplastengenome nicht. Dabei wird die Fremd-DNA durch die nachfolgenden Generationen vererbbar und ermöglicht enorm verbesserte Skalierbarkeit, weit über die anderer Expressionssysteme 1. Einführung von exogener DNA in das Kerngenom wird normalerweise durch Agrobacterium tumefaciens Infektion von Pflanzengewebe erreicht oder, seltener, durch Mikroprojektilbeschuss des Gewebes 9. Pflanzenhormone werden dann verwendet, um die Differenzierung und das Wachstum von transgenen Pflanzengewebe wie Wurzeln und Blätter zu induzieren. Transformation des Chloroplasten-Genom nicht erreicht werden A. tumefaciens, sondern verlässt sich ganz auf Gold-oder Wolfram-Partikel mit DNA beschichtet gefeuert ballistisch in Pflanzenzellen. Das zweite Verfahren zur Expression Rekombinationnt-Protein in Pflanzen durch transiente Expression 10. In diesem Szenario werden Virus-abgeleiteten Vektoren, die das Gen von Interesse via A. geliefert tumefaciens zu voll entwickelten Pflanzen durch einen Prozess namens Agroinfiltration. Statt der Integration in das pflanzliche Genom, wird die gelieferte Genkonstrukt dann damit beginnen, die transiente Produktion des gewünschten Proteins, die geerntet und nach kurzer Inkubationszeit isoliert werden zu lenken. Transient Genexpression bietet den Vorteil einer größeren allgemeinen Protein-Akkumulation sowie einer verbesserten Zeit von Protein-Produktion, wie die Pflanzen bereit sein wird, ca. 1-2 Wochen nach Agroinfiltration 11 ernten. Dies ist deutlich schneller als die Prozesse der Erzeugung, Auswahl und Bestätigung von stabilen transgenen Linien, die mehrere Monate dauern kann bis zu einem Jahr. Dies ist aber auch die Begrenzung der transienten Expressionssystem, da es nicht ergeben genetisch stabile Anlage lines, die verwendet werden, um eine Samenbank für groß angelegte kommerzielle Produktion erzeugen kann. Trotzdem haben Ansätze entwickelt worden, um in großem Maßstab transiente Expression zu verbessern. Hier zeigen wir eine Methode zur Erzeugung von transienten Protein-Expression Nicotiana benthamiana Pflanzen mittels viraler Vektoren dekonstruiert von A. geliefert tumefaciens.

Zwei wichtige Methoden werden für die Lieferung von A. entwickelt tumefaciens in Pflanzengewebe: bench scale Infiltration über eine Spritze und große Infiltration über Vakuumkammer. Beide Protokolle werden hier mit N. beschrieben benthamiana, die eng mit der gemeinsamen Tabakpflanze verwandt ist, als Wirtspflanze für transiente Expression von zwei fluoreszierende Proteine: das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus Qualle Aequorea victoria und der rot fluoreszierendes Protein aus Discosoma Koralle (DsRed) 12,13. N. benthamiana ist die häufigste Wirtspflanzerekombinantes Protein, weil es zugänglich für genetische Transformation ist, können große Mengen an Biomasse rasch ergeben, und ist ein überaus produktiver Saatguthersteller für Scale-up-Produktion 14. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von N. benthamiana als Gastgeber für die Proteinexpression ist die Verfügbarkeit einer Vielzahl von Expressionsvektoren 2,5. In dieser Studie wurden zwei dekonstruiert virale Vektoren, eine auf einer Tabak-Mosaik-Virus (TMV) RNA Replikon System (magnICON Vektoren) und die andere von der Bohne yellow dwarf virus (BeYDV) DNA Replikon System (geminiviral Vektoren) 4,11 ermittelt, die 15-18, werden verwendet, um die GFP und DsRed-Gen tragen und sie geben in N. benthamiana Zellen über A. tumefaciens. Drei DNA-Konstrukte für GFP oder DsRed Expression mit magnICON Vektoren verwendet werden. Dazu gehören das 5'-Modul (pICH15879), das den Promotor und andere genetische Elemente für den Antrieb der Expression des Ziel-Gens, das 3'-Modul, das das Gen von Interesse (PICH-GFP oder PICH-DsRed) und der Integrase-Modul (pICH14011) für ein Enzym codiert, das die 5 'und 3'-Module miteinander integriert bei Expression 8,15. Drei DNA-Konstrukte werden auch für die Expression mit geminiviral Vektoren benötigt. Zusätzlich zu Vektoren, die Replikon des Zielgens (pBYGFP oder pBYDsRed) ist ein Vektor, der für die Replikation Protein (pREP110) für die Amplifikation der Ziel-Replikon 11,14,16 erforderlich. Darüber hinaus ist die Einbeziehung eines Vektors Codieren des Silencing Suppressor p19 aus Tomate buschigen stunt virus für hohe Zielgenexpression 11,16 gewünscht.

Im Allgemeinen gibt es drei wesentliche Schritte zur Einführung von Genen von rekombinanten Proteinen in Pflanzenzellen durch Agroinfiltration einschließlich Pflanzenwachstums, A. tumefaciens Kultur Vorbereitung und Infiltration. Da jeder Schritt ist entscheidend für den letztendlichen Erfolg dieses Verfahrens daher wird eine detaillierte Beschreibung für jede vorgesehen istsowohl für Spritze Infiltration und Vakuuminfiltration unten.

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Protocol

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1. Plant Growth

  1. Platz 60 Torf Pellets in einem Anzuchtplatte. In 4 l Leitungswasser und lassen Sie den Torf Pellets absorbieren das Wasser für 2 Stunden.
  2. In 2 N. benthamiana Samen in jeder Torf Pellets mit einem seeder, decken Sie das Fach mit einem transparenten Kunststoff-Kuppel und es ihnen ermöglichen, in einem 25 ° C, 84% Luftfeuchtigkeit Umgebung mit einem 16/8 h Tag / Nacht-Zyklus (Abbildung 1A) keimen.
  3. Entfernen Sie die Kuppel zwei Wochen nach Aussaat, lassen Sie das Wasser aus dem Fach, und mit 2 L von Jacks Dünger in einer Konzentration von 1,48 g / L (Abbildung 1B). Weiter zu Pflanzen in einem 25 ° C, 50% Luftfeuchtigkeit Umgebung mit einem 16/8 h Tag / Nacht-Zyklus wachsen. Versorgung 2 L von Jacks Dünger alle 2 Tage pro Fach.
  4. In Woche 4, übertragen Sie die Pflanzen mit Torf Pellets zu einem neuen Fach, das sechs Pflanzen beherbergt, um ausreichend Platz für weiteres Wachstum (Abbildung 1C) bereitzustellen, bis sie bereit sind, an Alter von 6 Wochen (Abbildung infiltriert werden1D).

2. A. tumefaciens Kultur Vorbereitung

2.1 Vorbereitung für Spritze Infiltration

  1. Serie A. tumefaciens GV3101 Stämme mit den geminiviral Vektoren p19, pREP110, pBYGFP und pBYDsRed auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin (100 ug / ml). Streak ein Stamm pro Platte und wachsen bei 30 ° C für 48 Stunden.
  2. Ebenso Streifen und wachsen GV3101 Stämmen, die magnICON Vektoren der 5 'Modul (pICH15879), das 3'-Modul, das die Target-Gen von GFP oder DsRed (Pich-GFP oder Pich-DsRed) und Integrase (pCH14011) auf LB-Agar Platten mit Carbenicillin (100 ug / ml).
  3. Von einer einzigen Kolonie auf der LB-Agar Platte, impfen GV3101 Stämmen, geminiviral Vektoren in 3 ml YENB Medien (0,75% Bacto Hefeextrakt, 0,8% Nährbouillon, pH-Wert auf 7,5 mit NaOH) + Kanamycin (100 ug / ml) in eine 15-ml-Tube Kultur, wachsen die Flüssigkeit Kultur bei 30 ° C ina Schüttler über Nacht mit einer 300 rpm Drehzahl.
  4. Ebenso impfen und zu wachsen GV3101 Stämmen, magnICON Vektoren in YENB media + Carbenicillin (100 ug / ml) in einem Schüttler über Nacht bei 30 ° C.
  5. Messung und Aufzeichnung von OD 600-Werte für jede Flüssigkeit Kultur mit einem Spektralphotometer und verwenden Sie die folgende Formel, um das notwendige Volumen (V sub), um für eine neue Kultur mit einem Startpreis von 0,025 OD 600 werden in 10 ml YENB subkultiviert mit geeigneten Antibiotika berechnen .
    V sub (ml) = (10 ml) x (0,025) / OD 600
  6. Transfer-V sub (ml) der Übernacht-Kultur auf (10 - V sub) ml YENB Medien mit entsprechenden Antibiotika für jeden Stamm. Wachsen die neue Kultur über Nacht bei 30 ° C in einem Schüttler mit einer 250 rpm Drehzahl bis die OD 600-Wert im Bereich von 1,7-2,0.
  7. Messen und aufzeichnen OD 600-Werte für jede Flüssigkeit Kultur und verwenden Sie die folgende Formel in CalcUlate das benötigte Volumen (V inf) in 50 ml Infiltration Puffer verdünnt werden, um einen endgültigen OD 600 von 0,12 für jeden Stamm geben.
    V inf (ml) = (50 ml) x (0,12) / OD 600
  8. Transfer-V inf (ml) von jeder Kultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Spin-Down der Zellen durch Zentrifugation bei 12.000 xg für 2 min, Überstand entfernen und dann die Zellen in 10 ml Infiltration Puffer (10 mM MES, pH 5,5; 10 mM MgSO 4) durch Vortexen kurz.
  9. Mischen resuspendiert Zellen pBYGFP + + pREP110 p19, drehen Sie die Zellen nach unten bei 12.000 xg für 2 min, und resuspendieren in insgesamt 50 ml Puffer Infiltration. Diese Kombination ist für Agrobakterien geminiviral Expression von GFP.
  10. Ebenso mischen die folgenden Kombinationen von Agrobakterien Zellen, Spin-down und resuspendieren sie in 50 ml Puffer Infiltration. Dazu gehören (1) pBYDsRed + + pREP110 p19 für geminiviral Expression von DsRed, (2) pBYGFP + + pBYDsRed pREP110+ P19 für geminiviral Co-Expression von GFP und DsRed, (3) pREp110 + p19 als negative Kontrolle geminiviral Ausdruck, (4) Pich-GFP + + pICH15879 pCH14011 für magnICON Expression von GFP, (5) Pich-DsRed + + pICH15879 pCH14011 für magnICON Expression von DsRed, und (6) pICH15879 + pCH14011 als negative Kontrolle für magnICON Ausdruck.

2.2 Vorbereitung für Vakuuminfiltration

  1. Impfen und Kultur jedes GV3101 Stamm, geminiviral Vektoren oder magnICON Vektoren in 15 ml YENB Medien mit entsprechenden Antibiotika in einem 50 ml Autoklaven überführt und über Nacht wachsen wie für Spritze Infiltration oben beschrieben.
  2. Messung und Aufzeichnung von OD 600-Werte für jede Flüssigkeit Kultur mit einem Spektralphotometer und verwenden Sie die folgende Formel, um das notwendige Volumen (V sub), um für eine neue Kultur mit einem Startpreis von 0,025 OD 600 werden in 250 ml YENB subkultiviert mit geeigneten Antibiotika berechnen .
    V sub (Ml) = (250 ml) x (0.025) / OD 600
  3. Transfer-V sub (ml) der Übernacht-Kultur auf (250 - V sub) ml YENB Medien in einer 1 L autoklavierte Kolben mit geeigneten Antibiotika für jeden Stamm und wachsen die neue Kultur über Nacht wie für Spritze Infiltration oben beschrieben.
  4. Messen und aufzeichnen OD 600-Werte für jede Flüssigkeit Kultur und verwenden Sie die folgende Formel, um das notwendige Volumen (V inf) in 3 L der Infiltration verdünnt werden, um eine endgültige OD 600 von 0,12 für jeden Stamm geben berechnen.
    V inf (ml) = (3000 ml) x (0,12) / OD 600
  5. Pellet resuspendieren und V inf (ml) von jeder Kultur in Infiltration Puffer für Spritze Infiltration beschrieben und mischen Sie die resuspendierten Kulturen nach den Kombinationen für Spritze Infiltration beschrieben. Repellet die gemischten Agrobakterien Zellen resuspendieren und sie in 3 L der Infiltration Puffer.

3. Infiltration

3.1 Spritze Infiltration

  1. Wählen Sie vier 6-Wochen alten N. benthamiana Pflanzen mit 5 verlässt jeder. Die ersten drei Blätter von oben gezählt von jeder Pflanze wird vollständig mit einer der Kombinationen von A. infiltriert tumefaciens-Stämme in Infiltration Puffer. Das vierte Blatt wird spot-infiltriert mit allen vier Stamm-Kombinationen für geminiviral Ausdruck oder allen drei Kombinationen für magnICON Ausdruck. Das letzte Blatt auf jeder Anlage wird mit einer Kombination aus negativen Kontrollen infiltriert werden.
  2. Erstellen einer kleinen Einschnitt mit einer Nadel in der Epidermis an der Rückseite des Flügels (Abbildung 2A). Vorsicht: Achten Sie darauf, nicht zu kratzen, so hart wie zu durchbohren das Blatt durch beide Seiten, da die Zellen in der Agrobakterien Infiltration Mischung wird durch die Punktion auf die andere Seite des Blattes passieren.
  3. Nehmen Sie einen festen Halt der Vorderseite des Blattes und unter sanftemGegendruck der nick mit dem Daumen einer Hand, injizieren die Mischungen in Agrobacterium Infiltration Puffer in die nick mit einer Spritze ohne Nadel (Abbildung 2B). Hinweis: Da die Agrobacterium Gemisch tritt die Interzellulärraum des Blattes, das infiltrierte Bereich wird sichtbar dunkleren Grün drehen (Abbildung 2C).
  4. Fahren Sie mit dem Agrobacterium Mischungen in die nick injizieren, bis die dunkleren grünen Kreis stoppt, um zu erweitern. Erstellen Sie eine weitere nick und wiederholen Sie die Schritte, bis die gesamte 3.1.2-3.1.4 Blatt infiltriert wird und das ganze Blatt wird dunkler grün für die ersten drei Blätter und das letzte Blatt.
  5. Für das vierte Blatt jeder Pflanze, werden alle vier (geminiviral Vektor) oder drei (magnICON Vektor) Kombinationen hinein infiltriert werden. Machen Sie einen nick für jede Kombination von Agrobacterium-Stämme, und infiltrieren jede nick mit einer Kombination.
  6. Nach der Infiltration bewegen Pflanzen wieder zum Wachstum Zimmer und monitor Proteinexpression zwischen 2-15 Tage nach der Infiltration (dpi).

3.2 Vakuuminfiltration

  1. Legen Sie eine Badewanne in einem Vakuum-Exsikkator und Transfer 3 L Infiltration Puffer, die Agrobacterium-Stämme in die Wanne. Verbinden Sie den Exsikkator zu einem Vacuubrand Membran-Vakuumpumpe (3A).
  2. Legen Sie eine Pflanze kopfüber auf den Exsikkator Platte (3B) und senken Sie die Platte mit der Pflanze, bis das gesamte Blatt und Stamm-System wird in den Puffer Infiltration mit der Platte ruht oben auf der Wanne untergetaucht. Setzen Sie den O-Ring Exsikkator entlang des Randes und setzen Sie den Deckel auf den Exsikkator Kammer (3C).
  3. Einschalten der Vakuumpumpe und den Startzeitpunkt, wenn das Vakuum erreicht 100 mbar. Langsam öffnen Sie das Ablassventil auf dem Exsikkator nach 1 min bei 100 mbar bis zum Eingang von Agrobakterien in die Zwischenräume des untergetauchten Pflanzengewebe zu ermöglichen. Wiederholen Sie diesen Schritt ein additionalen Zeit, um gute Infiltration zu gewährleisten.
  4. Nach der Infiltration, nehmen Sie die Pflanze aus dem Exsikkator und steckte es wieder in die aufrechte Position. Bewegen Pflanzen wieder zum Wachstum Zimmer und Monitor Proteinexpression zwischen 2-15 dpi.

4. Fluorescent Protein Detection and Photography

  1. Ausgehend von 2 dpi, move Pflanzen in dunklen Raum und Glanz UV-Licht auf der Rückseite des infiltrierten Blätter mit einem handgeführten UV-Lampe.
  2. Beachten Sie die grüne Fluoreszenz von GFP oder die rote Fluoreszenz von DsRed. GFP gibt ein stärkeres Signal mit langwelligen UV-Licht, während DsRed ist stärker unter kurzwelligem UV-Licht.
  3. Machen Sie Fotos von fluoreszierenden Blätter mit einer normalen Digitalkamera ohne Blitz.
  4. Bewegen Pflanzen wieder zum Wachstum Zimmer nach Beobachtung oder Fotografie.

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Results

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1. Expression von fluoreszierenden Proteinen durch Spritze Infiltration

Um die Wirksamkeit der Spritze Infiltration von Agrobacterium in Pflanzengewebe zu demonstrieren, testeten wir die Expression von zwei fluoreszierenden Proteinen - GFP und DsRed - von zwei verschiedenen dekonstruiert Anlage virale Vektoren - geminiviral und magnICON - in N. benthamiana. Für N. benthamiana Blätter, die vollständig mit Agrobakterien haltigen geminiviral Vektoren wurden infi...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die steigenden Anforderungen an die Protein-basierten Pharmazeutika weltweit erfordern neue Produktion Plattformen, die robuste, skalierbare, kostengünstige und sicher sind. Pflanzen haben gezeigt, dass eine der vielversprechendsten alternativen Produktionssystemen für Herstellung pharmazeutischer Proteine ​​sein. In den letzten Jahren wurde die Entwicklung von deconstructed Virus basierende Vektoren transienten Expression von Proteinen in Pflanzen, die eine wesentliche Steigerung der Geschwindigkeit und Ausbeute der An...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken R. Sun und andere Studenten von Chens Labor für ihren Beitrag zur Material-Generation zu pflanzen. Wir danken auch Dr. D. Green für seine Unterstützung von Bachelor-Forschung in der Hochschule für Technik und Innovation (KTI). Diese Forschung wurde teilweise durch Zuschüsse NIH U01 AI075549 und 1R21AI101329 zu Q. Chen und eine SSE Zuschuss von CTI der Arizona State University auf Q. Chen unterstützt. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado und J. Stahnke sind Studenten von der SSE Zuschuss unterstützt.

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Materials

Equipment

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
GFP InvitrogenV353-20www.invitrogen.com Siehe Referenz: Lico und Chen, et al 2008
DsRedClontech632152www.clontech.com Siehe Referenz: Baird and Zacharias, et al 2000
MagnICON VectorIcon Geneticsn/awww.icongenetics.com Siehe Referenz: giritch and Marillonnet, et al 2006
Geminiviral VectorAuthor' s Labn/aSiehe Referenz: Chen and He, et al 2011
N. benthamianaAutor' s Laborn/aherbalistics.com.au
>Agrobacterium tumefaciens Stamm gv3101Autor' s Laborn/aSiehe Referenz: Lai and Chen 2012
LB Agar Carbenicillin-100, PlattenSigmaL0418www.sigmaaldrich.com
>LB Agar Kanamycin-50, PlattenSigmaL0543www.sigmaaldrich.com
Magnesiumsulfat-Hepa-HydratSigmaM2773-500 g<a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com
Bacto-TryptonFisher73049-73-7www.fishersci.com
Bacto HefeextraktBecton, Dickinson CO.REF 212750<a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com
Difco NährstoffbrüheBecton, Dickinson CO.REF 234000www.bd.com
MES hydrat BufferSigmaM8250-1kgwww.sigmaaldrich.com
CarbenicillinSigmaC1613-1MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank"> www.sigmaaldrich.com
KanamycinSigma70560-51-9www.sigmaaldrich.com
NatriumhydroxidSigma221465www.sigmaaldrich.com
Jack" s DüngerHummert InternationalJul-25www.hummert.com<
Vacuubrand MD4 VakuumpumpeFisher13-878-113www.fishersci.com
Vakuum Luft RegelventilFisherNC9386590www.fishersci.com
Exsikkator 12 1/8" mit O-RingFisher08-594-15Cwww.fishersci.com
>3 L TubRubber-Maidn/aRubbermaid Servn' Saver Bowl, 10 Tassen funktioniert
Platte/Regal 230MLFisherNC9489269www.fishersci.com
TorfpelletHummert International14-2370-1www.hummert.com
Propagation Tray DomeHydrofarm132052www.hydroponics.net
Propagaiton Trayhydrofarm 138758www.hydroponics.net
Virbo HandsämaschineGro-Mor INCn/awww.gro-morent.com
Flora Cart 4 RegalHummert International65-6924-1www.hummert.com15
ml Kulturgefäße mit rundem BodenSigmaCLS430172-500EAa href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">http://www.sigmaaldrich.com
SpektralphotometerBio-Rad170-2525www.bio-rad.com
Spektralphotometer KüvettenBio-Rad223-9950www.bio-rad.com
MikrozentrifugenröhrchenUSA Scientific1415-2500www.usascientific.com
TischzentrifugeBio-Rad166-0602EDUa href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com
Inkubator/ShakerEppendorfExcella E25 www.eppendorf.com
Modell für ultraviolettes Licht#: UVGL-25UVP95-0021-12www.uvp.com
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