Die In ovo Chorioallantoismembran (CAM) wird mit frischem Sarkom-derived Tumorgewebe, deren einzelne Zelle Suspensionen und permanente und transiente fluoreszenzmarkierten etablierten Sarkom-Zelllinien gepfropft. Das Modell dient zur Graft-(Lebensfähigkeit, Ki67 Proliferationsindex, Nekrosen, Infiltration) und Host (Fibroblasten-Infiltration, vaskuläre Einwachsen) Verhalten zu studieren.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Sarkom ist eine sehr seltene Krankheit, die heterogen in der Natur ist, die alle negativ auf die Entwicklung neuer Therapien. Sarkom-Patienten sind ideale Kandidaten für die personalisierte Medizin nach einer Schichtung, erklärt die aktuelle Interesse an der Entwicklung eines reproduzierbaren und Low-Cost-Xenotransplantationsmodell für diese Krankheit. Die Küken Chorioallantoismembran ist eine natürliche immungeschwächten Wirt fähig ist, ein dauerhaftes gepfropft Geweben und Zellen ohne Spezies-spezifische Einschränkungen. Darüber hinaus ist es leicht zugänglich, manipuliert und abgebildet, die optische und Fluoreszenz-Stereomikroskopie. Histologie weiteren ermöglicht die detaillierte Analyse der zellulären Interaktionen heterotypic.
Dieses Protokoll beschreibt im Detail die in ovo Pfropfen des Chorioallantoismembran mit frischen Sarkom-derived Tumorgewebe, deren einzelne Zelle Suspensionen und permanente und transiente fluoreszenzmarkierten etablierten Sarkom-Zelllinien (Saos-2 und SW1353). Die Küken Überleben Rattees sind bis zu 75%. Das Modell dient zur Graft-(Lebensfähigkeit, Ki67 Proliferationsindex, Nekrosen, Infiltration) und Host (Fibroblasten-Infiltration, vaskuläre Einwachsen) Verhalten zu studieren. Bei lokalisierten Pfropfen Einzelzellsuspensionen bietet ECM Gel deutliche Vorteile gegenüber inerten Materialien Containment. Die Ki67 Proliferationsindex auf den Abstand der Zellen von der Oberfläche der Nocke und der Dauer der Anwendung auf dem CAM, wobei letztere Bestimmung eines Zeitrahmens für die Zugabe von therapeutischen Produkten in Zusammenhang stehen.
Einleitung
Sarkom ist ein seltener Tumor des Bindegewebes mit einer hohen Sterblichkeit aufgrund von Therapieresistenz 1,2. Fortschritte in der das Überleben der Patienten ist durch ihre geringe jährliche Inzidenz, ihrer breiten Vielfalt und der Tatsache, dass Sarkomzellen gemeldet sind schwer zu Kultur in vitro 3,4 behindert.
Die Verwendung von kultivierten Zellen für die präklinische Therapie Auswertung hat ergeben, dass neue, scheinbar aktive Moleküle in vitro nicht immer die Ergebnisse im klinischen Umfeld. Darüber hinaus sind Genom Aberrationen Genexpressionsarrays zeigte nicht immer korreliert Tumorverha....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Siehe Abbildung 1 für eine Übersicht
Tumor Material
1. Beziehen und Vorbereiten Tumorproben
Für die Nutzung von Patientendaten Material, ist mit Zustimmung des Ethikkommission notwendig, und informierte Zustimmung muss vom Patienten erhalten werden.
- Ernte repräsentatives Material (mindestens 1 cm 3) zum Zeitpunkt der Intervention, entweder eine Biopsie oder eine Resektion eines Sarkom. Der richtige Ort der Biopsie wird mithilfe dynamischer Kontrast MRT.
- Sie das Material sofort in einem sterilen Fläschchen mit DMEM mit 1000 U Penicillin ....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Auswertung des CAM
Tumor Transplantate werden Anhänger der CAM (Abbildung 2A). Einzel-Zell-Suspensionen von Patient Material zeigen häufig eine getrocknete, leicht erhabene Plaque (2D). Nach Exzision des CAM, markiert Faltenbildung der Membran auftritt (2E und 2F).
Für den kommerziellen Zelllinien die Plaque wird immer undurchsichtig in der Zeit, was die Zellproliferation. Verschiedene Zelllinien in.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Zeit der Impfung und Ernte
Timing der Tag der Impfung durchgeführt wurde mit Saos2 in ECM-Gel (36 CAMs) und variiert zwischen Embryonalentwicklung Tag 5 und 10.
Vor der Inkubation Tag 9 war das CAM nicht konsequent groß genug, um die ECM-Gel aufgetragen wir unterstützen. Bei der Ernte, Tumorzellen manchmal musste aus dem tieferen CAM abgerufen werden, und einige ECM Gel Proben wurden lose liegend im Eiweiss oder auf der CAM. An den Tagen, 5 und 6, war es schwer zu v.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Zellen aus dem SW1353 Chondrosarkom-Zelllinie wurden freundlicherweise von Prof. Dr. PCW Hogendoorn und Prof. Dr. J. Bovée der Universität Leiden, Niederlande vorgesehen. Wir danken J. und G. Mestach Wagemans für hervorragende technische Unterstützung, und G. De Bruyne für die professionelle Darstellung der Überblick über unsere Protokoll.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 | |
| Kollagenase 2 Lösung (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 | |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Dnase Lösung | Sigma Aldrich | DN25 | |
| G418 | Invitrogen | 11811031 | |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| Maus primärer monoklonaler Antikörper Ki67 | Dako Dänemark | MIB-1 | |
| Paraformaldehyd | Fluka | D76240 | |
| PBS | Invitrogen | 20012019 | |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 | |
| peGFP-C1 Vektor | Clontech | 632470 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 | |
| Trypsin-EDTA-Lösung | Invitrogen | 25300054 | |
| Vybrant Zellmarkierung DiI | Lifetechnologies | 22885 | |
| Countess Automatisierter Zellzähler | Invitrogen | C10227 | |
| digitale Farbkamera | Leica | DFC 340 FX | |
| Digitaler Ei-Inkubator | Auto Elex Co | R-COM 50 | |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII | |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Gentlemacs Dissoziator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | |
| Gentlemacs Dissoziator Benutzerhandbuch mit h_tumor Protokoll | Miltenyi Biotech | ||
| [header] | |||
| semipermeable Klebefolie (Suprasorb F) | Lohmann& Rauscher | 20468 | |
| Stereo-Fluoreszenzmikroskop | Leica | M205 FA | |
| Tissue-Tek Film automatisierter Eindecker | Sakura | 6400 | |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 | |
| Ventana automatisierter Objektträger-Färbeschrank | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |
Referenzen
- Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution. Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).
- Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
