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Methodenartikel

Die

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DOI:

10.3791/50522

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17. Juli 2013

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1Department of Orthopaedic Surgery and Traumatology, Ghent University Hospital, 2Department of Radiation Oncology and Experimental Cancer Research, Ghent University, 3Department of Virology, Parasitology, and Immunology, Ghent University, 4Pathlicon

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die In ovo Chorioallantoismembran (CAM) wird mit frischem Sarkom-derived Tumorgewebe, deren einzelne Zelle Suspensionen und permanente und transiente fluoreszenzmarkierten etablierten Sarkom-Zelllinien gepfropft. Das Modell dient zur Graft-(Lebensfähigkeit, Ki67 Proliferationsindex, Nekrosen, Infiltration) und Host (Fibroblasten-Infiltration, vaskuläre Einwachsen) Verhalten zu studieren.

Zusammenfassung

Sarkom ist eine sehr seltene Krankheit, die heterogen in der Natur ist, die alle negativ auf die Entwicklung neuer Therapien. Sarkom-Patienten sind ideale Kandidaten für die personalisierte Medizin nach einer Schichtung, erklärt die aktuelle Interesse an der Entwicklung eines reproduzierbaren und Low-Cost-Xenotransplantationsmodell für diese Krankheit. Die Küken Chorioallantoismembran ist eine natürliche immungeschwächten Wirt fähig ist, ein dauerhaftes gepfropft Geweben und Zellen ohne Spezies-spezifische Einschränkungen. Darüber hinaus ist es leicht zugänglich, manipuliert und abgebildet, die optische und Fluoreszenz-Stereomikroskopie. Histologie weiteren ermöglicht die detaillierte Analyse der zellulären Interaktionen heterotypic.

Dieses Protokoll beschreibt im Detail die in ovo Pfropfen des Chorioallantoismembran mit frischen Sarkom-derived Tumorgewebe, deren einzelne Zelle Suspensionen und permanente und transiente fluoreszenzmarkierten etablierten Sarkom-Zelllinien (Saos-2 und SW1353). Die Küken Überleben Rattees sind bis zu 75%. Das Modell dient zur Graft-(Lebensfähigkeit, Ki67 Proliferationsindex, Nekrosen, Infiltration) und Host (Fibroblasten-Infiltration, vaskuläre Einwachsen) Verhalten zu studieren. Bei lokalisierten Pfropfen Einzelzellsuspensionen bietet ECM Gel deutliche Vorteile gegenüber inerten Materialien Containment. Die Ki67 Proliferationsindex auf den Abstand der Zellen von der Oberfläche der Nocke und der Dauer der Anwendung auf dem CAM, wobei letztere Bestimmung eines Zeitrahmens für die Zugabe von therapeutischen Produkten in Zusammenhang stehen.

Einleitung

Sarkom ist ein seltener Tumor des Bindegewebes mit einer hohen Sterblichkeit aufgrund von Therapieresistenz 1,2. Fortschritte in der das Überleben der Patienten ist durch ihre geringe jährliche Inzidenz, ihrer breiten Vielfalt und der Tatsache, dass Sarkomzellen gemeldet sind schwer zu Kultur in vitro 3,4 behindert.

Die Verwendung von kultivierten Zellen für die präklinische Therapie Auswertung hat ergeben, dass neue, scheinbar aktive Moleküle in vitro nicht immer die Ergebnisse im klinischen Umfeld. Darüber hinaus sind Genom Aberrationen Genexpressionsarrays zeigte nicht immer korreliert Tumorverhalten Merkmale in den einzelnen Patienten 5-7. Um zu versuchen und diese Probleme zu lösen, hat die personalisierte Medizin an Bedeutung, die in der zunehmenden Suche nach Xenotransplantatmodellen 8-12 reflektiert wird gewonnen.

Ein in vivo Test hat den Vorteil, was die komplexe Zusammenspiel zwischen cancer Zellen und das Wirtsgewebe Umwelt in soliden Tumoren, die für Krebs Proliferation und Invasion 13. Derzeit untersuchen wir die Verwendung des Chorioallantoismembran Assay (CAM-Assay) als reproduzierbare Xenograftmodell für Sarkom 14,15. Dieser Test wird weithin für die Untersuchung von Tumor-Angiogenese 16,17 verwendet. In der Literatur sind jedoch haben wir verschiedene Protokolle für diesen Test gefunden, während andere Studien beobachtet einen deutlichen Unterschied im Wachstum oder die Angiogenese nach unterschiedlichen Protokollen 18,19.

In diesem Artikel untersuchen wir die Wirkung der unterschiedlichen Bedingungen des CAM-Assay auf das Verhalten der Zelle mit Tumortransplantate, tumorderivierten Einzelzellsuspensionen und etablierten Sarkom Zellkulturen.

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Protokoll

Siehe Abbildung 1 für eine Übersicht

Tumor Material

1. Beziehen und Vorbereiten Tumorproben

Für die Nutzung von Patientendaten Material, ist mit Zustimmung des Ethikkommission notwendig, und informierte Zustimmung muss vom Patienten erhalten werden.

  1. Ernte repräsentatives Material (mindestens 1 cm 3) zum Zeitpunkt der Intervention, entweder eine Biopsie oder eine Resektion eines Sarkom. Der richtige Ort der Biopsie wird mithilfe dynamischer Kontrast MRT.
  2. Sie das Material sofort in einem sterilen Fläschchen mit DMEM mit 1000 U Penicillin und 1 mg / ml Streptomycin.
  3. Transportieren Sie das Fläschchen sofort (30-90 min) zum Labor.

Alle folgenden Verfahren werden unter Laminar-Flow durchgeführt.

  1. Den Inhalt des Fläschchens in eine sterile Petrischale.
  2. Setzen Sie den Tumorprobe in kleine Teile von maximal 1 mm 3 mit einem sterilen Skalpell. Alle entfernen verkalkte Teile, wie sie der weiteren Verarbeitung des Gewebes beeinträchtigen neigen.
  3. Zufällig nehmen 10 Tumortransplantate für die Anwendung auf der CAM.

2. Herstellung von Tumor-derived Einzelzellsuspensionen

Dauer: ca. 3 Stunden

  1. Wiegen Sie das verbleibende Gewebe der Probe.
  2. Setzen Sie 2-4 g Gewebe in einem Dissoziator Rohr, mehr als ein Rohr erforderlich sein, um alle verbleibenden Tumorgewebe zu verdauen.
  3. Für die Verdauung von 2 - 4 g des Gewebes, fügen Sie 2,5 ml Kollagenase 2-Lösung (500 U / ml RPMI 1640) und 2,5 ml DNase-Lösung (22 KU / ml RPMI 1640).
  4. Verarbeiten Sie das Gewebe nach dem Dissoziator h_tumor Protokoll. Dabei werden 2 Zyklen von Inkubation bei 37 ° C in CO 2-Inkubator, während das Röhrchen wird vorsichtig für 30 min geschüttelt.
  5. Filtern Sie die verbleibende Suspension durch ein 150 um Zellsieb.
  6. Zentrifuge das Lysat bei 1000 rpm für 5 kmn.
  7. Entfernen Sie den Überstand.
  8. Das Pellet in 10 ml Erythrozytenlysepuffer (ELB), so dass 10 Minuten Inkubation mit regelmäßigen Suspension.

Hinweis: Erythrozyten-Lyse-Puffer wird wie folgt hergestellt: In 0,037 g EDTA, 0,99 g K 2 HPO 4, 8,29 g NH 4 Cl zu 1.000 ml aqua, verwenden 10 N NaOH auf den pH-Wert auf 7,3 einstellen, Filter unter Druck durch ein 0,22 um filtern. Lagern bei 4 ° C.

  1. 25 ml Kulturmedium (DMEM mit 10% fötalem Rinderserum, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin), um die Reaktion zu stoppen.
  2. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 1.000 rpm für 5 min. Die Farbe der Tablette sollte weiß jetzt.
  3. Entfernen Sie den Überstand.
  4. 5 ml Medium zu dem Pellet. Filtern Sie die Suspension durch eine 70 um Zellsieb.
  5. Zähle die Anzahl der lebenden Zellen / ml mittels eines automatischen Zellzähler.

3. Cancer Zelllinien

Saos2 Osteosarkom-Zellen (ATCC Nummer: HTB-85) Expression verstärkt grün fluoreszierende Protein wurden von pEGFP-C1-Vektor unter Verwendung der Zellinie Nucleofector Kit V gemäß dem Protokoll des Herstellers elektroporiert. Um stabile Zelllinien zu etablieren, wurden transfizierte Zellen in G418 (1 mg / ml) für 4 Wochen im Einklang mit früheren festgelegten Protokoll 20 ausgewählt. Zusätzlich Sortierung durch Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

Zellen aus dem SW1353 Chondrosarkom-Zelllinie (ATCC-Nummer: HTB-94) oder frisch zubereitete Tumor Einzelzellsuspensionen sind beschriftet mit einem rot fluoreszierenden lipophilen Membran Fleck.

  1. Entfernen der Zellen aus der Kulturflasche in einer klassischen Art und Weise unter Verwendung von Trypsin (0,5% w / v) Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, 0,2% w / v) Lösung.
  2. Zentrifuge die Zellsuspension 5 min bei 1.000 Umdrehungen pro Minute.
  3. Entfernen Sie die Supernatant.
  4. 1 ml Serum-freiem Medium und 5 ul Dil (Vybrant Red) / 10 6 Zellen.
  5. Wickeln Sie das Fläschchen in Alufolie und steckte es in die CO 2-Inkubator für 10 min bei 37 ° C
  6. Zentrifuge erneut für 5 min bei 1.000 rpm und Überstand.

Chorioallantoismembran Assay

1. Egg Incubation

  1. Befruchtete Eier von einem lokalen kommerziellen Brüterei garantiert 95% der Befruchtung der Eier erforderlich sind.
  2. Befruchtete Eier können bei RT gelagert werden bis zu 10 Tagen.

Hinweis: bevor Inkubation, Schmutz, Federn und Kot werden sorgfältig von den Eierschalen mechanisch durch trockenes Abwischen mit Papiertüchern, die eine raue statt einer weichen Oberflächenstruktur entfernt. Wischen Sie die Eier mit 70% Ethanol denaturiert oder einer anderen Reinigung Reagenz reduziert signifikant die Überlebensrate der Hühnerembryonen.

  1. Setzen Sie die Eier in den incubator auf der einen Seite, die Kennzeichnung der Oberseite. Der Tag, an dem die Eier in den Inkubator gelegt werden, wird Tag 0 der embryonalen Entwicklung bezeichnet.
  2. Stellen Sie die Inkubationstemperatur bei 37,8 ° C und die Luftfeuchtigkeit bei 47%. Stellen Sie sicher, dass die automatische Rotation Option ausgeschaltet ist.

2. Eröffnung der Eier

Dauer: ± 60 min für 25 Eier

Am Tag 3 Entwicklung werden die Eier unter laminaren Luftstrom geöffnet. Öffnen der Eier an weiteren Entwicklungsstadium führt zu einer Schädigung des CAM, da die Membran dazu neigt, an der Schale halten. Ein Infrarot-Lampe verwendet wird, halten die Eier warm während des Verfahrens. Um die Sterilität zu verbessern, empfehlen wir die Verwendung von Handschuhen.

  1. Legen Sie das Ei in den Eierbecher, mit der markierten Seite nach oben zeigt.
  2. Senken Sie den Pegel des CAM durch Entfernen von zwei ml Eiweiss durch eine 18 G Nadel an der Spitze des Eies eingefügt. Wenn die Nadel nach Perforieren mehrere stumpfeEierschalen, ersetzen Sie die Nadel. Wenn nicht, ist zu viel Kraft ausgeübt wird, was zu Schäden an dem Eigelb oder Bruch der Schale. Manchmal wird die Nadel durch die Hagelschnüre, eines von 2 Spiralbänder Aussetzung der Dotter in Eiweiß blockiert. Dies kann durch leichtes Drücken Sie den Kolben nach unten, bis der Block gelöst gelöst werden. Wenn Eigelb in die Spritze gesaugt wird, ersetzen Sie die Nadel sowie die Spritze. Manchmal stirbt der Embryo nach diesem Ereignis. Wenn eine unzureichende Menge an Eiweiß entfernt wird, wird der CAM beschädigt werden, wenn die Hülle entfernt werden.
  3. Anwenden einer semipermeablen Folie an der markierten oberen Seite der Schale, um Verschütten von Shell-Partikel auf die CAM verhindern beim Schneiden das Fenster.
  4. Stellen Sie eine Einführung Loch mit einer kleinen Ahle an der Oberfläche des Eies.
  5. Schneiden Sie ein Fenster von 1 cm 2 in der Schale, mit einem Paar sterile spitzen chirurgische Schere.
  6. Der Embryo pulsierenden Herzen und den angrenzenden Gefäßen bei th beobachtet werdene Oberfläche des Eigelb. Entfernen Sie die nicht befruchteten Eier oder tote Embryonen. Eine unterbrochene Aspekt der Blutgefäße charakterisiert toten Embryonen.
  7. Verschließen Sie die Fenster mit einer semipermeablen Folie. Es ist nicht notwendig, um die Einstichstelle decken, wenn die Hülle während des Einführens der Nadel gebrochen hat.

3. Inokulationsverfahren

Dauer: ± 1 Std. pro Zelllinie

Auf chick Embryonalentwicklung Tag 9 werden die Eier unter laminaren Luftstroms geimpft.

Bewertung der Krebszelle sich über das CAM erfordert Rückhaltung der Zellen begrenzt Oberfläche bei der Inokulation. Matrigel ist eine extrazelluläre Matrix (ECM)-Gel aus der Engelbreth-Holm-Swarm Maussarkoms häufig in experimentellen Bedingungen der Zellkultur eingesetzt. Es ist eine Flüssigkeit, beim Abkühlen, sondern thermisch aktivierten Polymerisation unterliegen, wenn auf 20 gebracht - 40 ° C, wodurch ein stabiles Gel. Währenddie Experimente wird Matrigel in eine Kiste mit schmelzendem Eis gehalten.

Hinweis: Wir bestehen nicht auf perforierten Deckgläser verwenden. Wir beobachteten, Anhaftung und das Wachstum von Krebszellen gepfropft auf der Kunststoffscheibe so vorspannt Wachstum Potential der Zellen auf der Membran selbst.

  1. Resuspendieren eines Zellpellets in gekühlten ECM Gel in einer Konzentration von 10 6 Zellen/100 ul ECM Gel. Diese Lösung wird auf schmelzendem Eis.
  2. Excise Teil der semipermeablen Membran mit einem Paar von sterilen chirurgischen unter laminaren Luftstrom. Wenn die Klebefolie vollständig entfernt wird, wird diese in einem größeren Anteil von embryonalen Tod durch Kontamination.
  3. Berühren Sie die CAM direkt unter dem Shell-Fenster vorsichtig mit einem sterilen Glasstab, um die Epithelzellschicht entfernen. Das Berühren der CAM mit einem sterilen Glasstab erweist sich als weniger traumatisch als mit einem Skalpell n ° 11, die mehr Handlichkeit und Erfahrung erfordert. Kleine Blutungen auftreten.
  4. Adding Tumor Material.
  5. Für Tumortransplantate: sanft untere Stück des Gewebes auf die CAM mit einem Paar von sterilen Pinzette, ohne sie zu quetschen.
  6. Für die ECM Gel-Verfahren: In 4x 25 ul der Zell-ECM-Suspension auf die CAM, auf der jeweils anderen, so dass die ECM-Gel zur Polymerisation in zwischen den Anwendungen. Auf diese Weise eine haftende Plaque, die die Krebszellen wird erstellt.
  7. Verschließen Sie die Shell-Fenster wieder mit einer semipermeablen Folie.

4. Imaging und Ernten der CAM

Dauer: 2 Stunden für 25 Eier

Auf chick Embryonalentwicklung Tag 16 werden die CAMs geerntet. Arbeiten unter laminaren Luftstrom ist nicht erforderlich.

  1. Vergrößern Sie das Fenster mit einem Paar chirurgische Schere. Achten Sie darauf, nicht zu tief schneiden, da sonst die CAM beschädigt werden, was zu Blutungen der verletzten Gefäße.
  2. In 300 - 500 ul PBS D mit einer Pipette auf die CAM-SekteIonen mit der beimpften Materials. Wenn keine fluoreszierende Sonden verwendet werden, können gepuffert Formaldehyd verwendet, da hierdurch die Membran steifer werden, wodurch das Schneiden der Membran.
  3. Machen Sie ein Foto des CAM in das Ei durch ein Stereo-Fluoreszenzmikroskop mit einer digitalen Farbkamera ausgestattet, sowohl mit dem GFP oder die DSR-Filter, und keine Filter. Für die Tumortransplantate, werden alle Fotos ohne Filter. Beleuchtung von oben LED-Leuchten ist stark während des Fotografierens (Abbildung 2) empfohlen.
  4. Nimm Tumorzellmigration für die markierten Zellen. Die Grenzen der Tumoren kann unregelmäßig und ausgefranst. Aufgelockert Zellen vorhanden sein können in der Nähe des Tumors Grenzen. In einigen Proben kann Reihen von Tumorzellen beobachtet (Abbildung 3).
  5. Schneiden Sie die Membran mit einem Paar sterile Schere an der Grenze liegend gegen die Schale.
  6. Legen Sie die geernteten CAM in einer sterilen Petrischale mit PBS D gefüllt oder gepuffert fürFormaldehyd.
  7. Machen Sie ein Foto von den beiden oberen und der unteren Seite des CAM, sowohl mit als auch ohne Filter.
  8. Legen Sie die Membran in einer beschrifteten Behälter mit gepufferter Formaldehyd für mindestens 72 Stunden.
  9. Integrieren Sie die CAMs in Paraffin und bereiten sie für die histologische Untersuchung. Achten Sie darauf, die Tumortransplantate in der Mitte des Knotens geschnitten, so dass die Schnittfläche ist parallel zum Boden der Kassette. Wenn nicht, wird die Wechselwirkung zwischen dem Nocken und dem Tumor-Transplantat nicht sichtbar. Die gleiche Strategie gilt für die ECM Gel Plaques: die Oberfläche, die der Schneidklinge sollte senkrecht zu der Plakette.

5. Histologische Auswertung

Hämatoxylin-Eosin-Färbung und Ki-67 Immunhistochemie wurden zur weiteren Klärung durchgeführt wird, wenn nötig. Immunhistochemie auf Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten von 3,5 um Dicke durchgeführt, unter Verwendung eines Färbeautomat nachden Anweisungen des Herstellers. Eine primäre Maus-monoklonalen Antikörper Ki-67 (Klon MIB-1, Verdünnung 1/100) verwendet. Hitzeinduzierte Epitopdemaskierungslösung wurde mit Handy Conditioning 1 und Visualisierung wurde mit dem Universal-DAB Detection Kit erreicht, nach den Anweisungen des Herstellers. Dehydratation der Gewebeschnitte erfolgte mit Hilfe eines automatisierten Deckglasvorrichtung durchgeführt.

Für die Saos2 und SW1353 Zelllinien, die Zahl der Ki67-positiven und-negativen Zellen Ki67 nuclei/100 um 2 in drei Zonen wurden gezählt: ein in der Nähe der Grenze des CAM, schließen ein die Oberfläche und eine in der Mitte des das ECM Gel Plaque. Dieses Verfahren wurde wiederholt 6x für jede Ki-67 gefärbten Objektträger. Der Index der Proliferation wurde für jede Folie, indem die Anzahl von Ki67-positive Zellen durch die Gesamtzahl der gezählten Zellen bestimmt.

Nekrose ist durch einen Verlust von feinen Dispersion von Chromatin im Zellkern, durch fadi begleitet definiertng von verschiedenen Zell-Margen. Für Xenograften wird Nekrose vollständige, teilweise (oft an der Oberfläche), oder nicht vorhanden erzielt. Infiltration von Tumorzellen in das CAM wird durch die Beobachtung von Tumorzellen in dem Mesoderm der CAM definiert und als vorhanden oder abwesend erzielt.

Drei Titel sind für Host-Verhalten erzielt. Fibroblasten-Infiltration als langgestreckte Zellen Verlassen des CAM und Invasion der Tumor Transplantat / Plaque definiert und wird als anwesend oder abwesend erzielt. Gefäßeinsprossung als Einwachsen von proliferierenden Küken Schiffe, durch die Anwesenheit von kernhaltigen Erythrozyten dadurch Küken beobachtet werden.

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Ergebnisse

Auswertung des CAM

Tumor Transplantate werden Anhänger der CAM (Abbildung 2A). Einzel-Zell-Suspensionen von Patient Material zeigen häufig eine getrocknete, leicht erhabene Plaque (2D). Nach Exzision des CAM, markiert Faltenbildung der Membran auftritt (2E und 2F).

Für den kommerziellen Zelllinien die Plaque wird immer undurchsichtig in der Zeit, was die Zellproliferation. Verschiedene Zelllinien in...

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Diskussion

Zeit der Impfung und Ernte

Timing der Tag der Impfung durchgeführt wurde mit Saos2 in ECM-Gel (36 CAMs) und variiert zwischen Embryonalentwicklung Tag 5 und 10.

Vor der Inkubation Tag 9 war das CAM nicht konsequent groß genug, um die ECM-Gel aufgetragen wir unterstützen. Bei der Ernte, Tumorzellen manchmal musste aus dem tieferen CAM abgerufen werden, und einige ECM Gel Proben wurden lose liegend im Eiweiss oder auf der CAM. An den Tagen, 5 und 6, war es schwer zu v...

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Offenlegungen

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Zellen aus dem SW1353 Chondrosarkom-Zelllinie wurden freundlicherweise von Prof. Dr. PCW Hogendoorn und Prof. Dr. J. Bovée der Universität Leiden, Niederlande vorgesehen. Wir danken J. und G. Mestach Wagemans für hervorragende technische Unterstützung, und G. De Bruyne für die professionelle Darstellung der Überblick über unsere Protokoll.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Cell Line Nucleofector Kit VAmaxaVCA-1003
Kollagenase 2 Lösung (500 U/ml RPMI 1640)Sigma AldrichC6885
DMEMInvitrogen41965-039
DMSOSigmaD8418
Dnase LösungSigma AldrichDN25
G418Invitrogen11811031
MatrigelSigma-AldrichE1270
Maus primärer monoklonaler Antikörper Ki67Dako DänemarkMIB-1
ParaformaldehydFlukaD76240
PBSInvitrogen20012019
PBSDInvitrogen14040083
peGFP-C1 VektorClontech632470
Penicillin/StreptomycinInvitrogen15140163
RPMIInvitrogen22409-015
Trypsin-EDTA-LösungInvitrogen25300054
Vybrant Zellmarkierung DiILifetechnologies22885
Countess Automatisierter ZellzählerInvitrogenC10227
digitale FarbkameraLeicaDFC 340 FX
Digitaler Ei-InkubatorAuto Elex CoR-COM 50
FACSBD BiosciencesFACSAriaIII
Gentlemacs C-TubeMiltenyi Biotech130-093-237
Gentlemacs DissoziatorMiltenyi Biotech130-093-235
Gentlemacs Dissoziator Benutzerhandbuch mit h_tumor ProtokollMiltenyi Biotech
[header]
semipermeable Klebefolie (Suprasorb F)Lohmann& Rauscher20468
Stereo-FluoreszenzmikroskopLeicaM205 FA
Tissue-Tek Film automatisierter EindeckerSakura6400
ultraView Universal DAB Detection KitVentana Medical Systems Inc760-500
Ventana automatisierter Objektträger-FärbeschrankVentana Medical SystemsBenchmark XT

Referenzen

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