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Methodenartikel

Live-Imaging-Assay für die Bewertung der Rollen von Ca

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DOI:

10.3791/50531

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25. August 2013

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Echtzeit-Bildgebung von Zellen mit dem lipophilen Farbstoff FM1-43 ausgesetzt ermöglicht eine präzise Bestimmung der Kinetik durch die porenbildende Toxine sind von der Plasmamembran entfernt. Dies ist ein empfindlicher Test, der verwendet werden kann, um Anforderungen für die Ca 2 +, Sphingomyelinase und anderen Faktoren auf die Plasmamembran Reparatur zu beurteilen.

Zusammenfassung

Plasma-Membran-Verletzung ist ein häufiges Ereignis, und Wunden müssen schnell repariert, um zelluläre Überleben zu gewährleisten. Einstrom von Ca 2 + ist ein Schlüsselsignalisierungsereignis, das die Reparatur von mechanischen Verletzungen an der Plasmamembran innerhalb von ~ 30 s auslöst. Jüngste Studien zeigten, dass Säugerzellen ihrer Plasmamembran nach Permeabilisierung mit porenbildenden Toxinen in einem Ca 2 +-abhängigen Prozess, der Exozytose des lysosomalen Enzyms saure Sphingomyelinase, gefolgt von Poren Endocytose beinhaltet auch wieder zu verschließen. Hier beschreiben wir die Methodik, um zu zeigen, dass das Wiederverschließen der Zellen durch das Toxin Streptolysin O permeabilisiert ist auch eine schnelle und abhängig von Ca 2 +-Einstrom. Der Assay-Design ermöglicht die Synchronisation der Verletzungsanlaß und eine genaue kinetische Messung der Fähigkeit von Zellen, Plasmamembranintegrität von Abbildungs ​​wiederherzustellen und Quantifizieren des Ausmaßes, mit dem die lipophilen Farbstoff FM1-43 intrazellulären Membranen erreicht. Diese Live-Test ALSo ermöglicht eine sensible Bewertung der Fähigkeit von exogen zugesetzten löslichen Faktoren wie Sphingomyelinase FM1-43 Einstrom hemmen, was auf die Fähigkeit von Zellen, die Plasmamembran zu reparieren. Dieser Assay erlaubt uns zum ersten Mal zeigen, dass Sphingomyelinase wirkt abwärts von Ca 2 +-abhängigen Exozytose, da extrazelluläre Zugabe des Enzyms fördert Wiederverschließen der Zellen in der Abwesenheit von Ca 2 + durchlässig gemacht.

Einleitung

Es ist seit mehreren Jahrzehnten bekannt, dass die Plasmamembran-Reparatur nach mechanischen Verletzungen ist ein Ca 2 +-abhängigen Prozess 1,2. Spätere Studien zeigten, dass Ca 2 +-Einstrom durch die Wunde löst eine kräftige Prozess der Exozytose von intrazellulären Vesikeln an der Stelle der Verletzung, die zum Wiederverschließen 3,4 erforderlich ist. Die Verlustrate der Fluoreszenzfarbstoff in das Zytoplasma der Zellen geladen wurde verwendet, um die Geschwindigkeit der Reparatur zu beurteilen und festgestellt, dass Wiederverschließen wurde innerhalb von <30 sec nach der Verletzung 5 abgeschlossen. Zwei Modelle wurden zunächst vorgeschlagen, die Voraussetzung für die Exozytose in Plasmamembran-Reparatur zu erklären: 1) die "Patch"-Modell, das vorgeschlagen, dass Ca 2 +-Einstrom durch die Läsion löst zunächst homotypischen Fusion von intrazellulären Vesikeln, bilden eine große "Patch" Das wäre dann in die Plasmamembran aufgebracht, um die Wunde 6 und 2) die Spannungsreduzierung Modell, das die Membran adde vorgeschlagen werden verschließendurch Ca 2 +-abhängige Exocytose in der Nähe der Wunde d würde Plasmamembranspannung zu verringern und erleichtert Wiederverschließen der Doppelschicht 7. Die Rolle von Ca 2 + ausgelöste Exocytose in der Plasmamembranreparatur wurde durch Studien, die zeigen, dass Lysosomen enthalten eine Ca 2 +-Sensormolekül, synaptotagmin VII, die Exocytose und deren Plasmamembran Reparatur erleichtert verletzten Zellen verstärkt 8,9,10,11 .

Allerdings hat zusätzliche Beweise zeigten, dass Exozytose allein war nicht ausreichend, um die Reparatur der Plasmamembran zu fördern. Neben mechanischen Tränen auf der Plasmamembran, ist eine häufige Form von Zellschädigung Permeabilisierung von durch Bakterien oder Immunzellen 12,13 14,15 hergestellt porenbildenden Toxinen. Im Gegensatz zu mechanischen Tränen, porenbildende Proteine, fügen sich auf der Plasmamembran, eine stabile, Protein-Pore gesäumt, die nicht einfach durch die Anwendung einer Membran "Patch" oder durch Reduktion wieder verschlossen werden könnenten Membranspannung. Interessanterweise Studien zeigten, dass Säugerzellen mit einem effektiven Mechanismus, um die Plasmamembran nach Permeabilisierung mit porenbildende Proteine ​​zu reparieren, und dieses Verfahren erfordert ebenfalls die Gegenwart von extrazellulärem Ca 2 + 12. Dieser Befund warf die Frage auf, ob Transmembranporen Entfernung von der Zelloberfläche war auch ein schneller Prozess, wie bei mechanischen Wunden 5 beobachtet. Überraschenderweise zeigte unsere jüngste Studien, daß das Wiederverschließen der Zellen, die mit porenbildenden Toxinen permeabilisiert hat sehr ähnliche Eigenschaften wie die Reparatur von mechanischen Wunden: erfordert das Verfahren der extrazellulären Ca 2 +, und wird innerhalb von ~ 30 sec abgeschlossen. Die Untersuchung dieses Prozesses näher wir vor kurzem erfahren, dass zusätzlich zu den Ca 2 +-regulierte Exozytose von Lysosomen, Plasmamembran Reparatur beinhaltet eine schnelle Form der Endozytose, die durch die Freisetzung von lysosomalen Enzym ausgelöst wird, saure Sphingomyelinase (ASM) und ist essentiell nicht nur für the Entfernen der Transmembranporen, aber auch für die Reparatur von mechanischen Verletzungen 16.

Um die Kinetik der Zellwiederverschließen nach Permeabilisierung mit porenbildenden Proteinen zu bestimmen, die wir in unserem Labor eine Echtzeit-Bildgebung geeignet Methodik, die zuvor verwendet worden war, um Wiederverschließen der Laser verletzt isolierte Muskelfasern 17 beurteilen. Dieser Assay beruht auf Eigenschaften der lipophilen Farbstoff FM1-43, die stabil interkaliert in die äußere Seite der Lipiddoppelschichten Erhöhung der Fluoreszenzintensität. Wenn der Plasmamembran-Doppelschicht extrazellulären Farbstoff erhält Zugang zu intrazellulären Membranen gestört, die ein empfindliches Assay Plasmamembran Verletzungen erkennen und reparieren 18,16,19,20. Um diesen Test zur Beurteilung der Zellwiederverschließen nach Permeabilisierung mit porenbildende Proteine ​​anzupassen, wir vorinkubierten Zellen bei 4 ° C mit dem bakteriellen Toxin Streptolysin O (SLO), welche an Membrancholesterin 21 bindet. Synchron-ZellePermeabilisierung kann dann leicht durch Bewegen der Zellen vom Medium, um Eis in einem erwärmten Mikroskoptisch, der die Oligomerisation und Änderung der Konformation, die den Transmembranporenbildung führt aktiviert erwärmen erreicht werden. Ein Vorteil dieser Vorgehensweise gegenüber den bisher veröffentlichten Untersuchungen mit Laser Verwundung ist, dass eine größere Anzahl von Zellen gleichzeitig in einem mikroskopischen Feld analysiert werden, eine bessere Abtastung der Zellpopulation. Angesichts der Gemeinsamkeiten zwischen der Zellwiederverschließen Prozess nach mechanischen Verletzungen und Permeabilisierung mit porenbildende Toxine zu sehen ist, der Test beschreiben wir hier eine sehr vielseitige und leistungsstarke Methode zum Präparieren Faktoren in der grundlegenden Verfahren der Plasmamembran-Reparatur beteiligt. Als Beispiel zeigen wir, dass es möglich ist, diesen Test zu verwenden, um Ca 2 +-abhängigen und unabhängigen Schritten des Reparaturvorgangs zu identifizieren.

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Protokoll

1. Transkriptions Silencing von ASM

  1. Samen 1,5 x 10 5 HeLa-Zellen in 2 ml DMEM Wachstumsmedium (DMEM mit hohem Glucose mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 1% Penn-Strep) auf 35 mm Glasbodenschalen (MatTek) und Inkubieren über Nacht bei 37 ° C in einem 5% CO 2-Inkubator.
  2. Am folgenden Tag, absaugen dem Wachstumsmedium und ersetzen Sie es mit 2 ml DMEM reduziert Serummedium (DMEM mit 4% FBS), mindestens 1 Stunde vor der Zugabe der siRNA-Transfektion Mischung.
  3. Bereiten 4 Röhren für die siRNA-Transfektion Oligo-Mischung. In Röhren A und C, fügen Sie 250 ul Optimem reduziert Serum und 4 ul Lipofectamine RNAiMax, pro 35 mm-Schale transfiziert werden. In Rohr B, fügen Sie 250 ul Optimem reduziert Serum und 8 ul (160 pmol) des Steuermedium GC-Gehalt Oligo (Control siRNA), pro 35 mm-Schale transfiziert werden. In Rohr D, fügen Sie 250 ul Optimem reduziert Serum und 8 ul (160 pmol) des SMPD1 Oligo (tern), pro 35 mm-Schale to transfiziert werden. Die Röhrchen bei Raumtemperatur für 5 min inkubiert.
  4. Kombinieren Rohre A und B, um die Transfektion Komplex für Kontroll-siRNA und Rohre C und D für die ASM siRNA zu bilden. Inkubiere die Reaktion bei Raumtemperatur für 20 min.
  5. Fügen Sie die Kontrolle siRNA und siRNA-Transfektion ASM Reaktionsmischungen langsam tropfenweise in die jeweiligen 35-mm-Glasboden Gerichte und bei 37 ° C / 5% CO 2. Bei 24 Stunden nach der Transfektion sanft absaugen Medien und ersetzen mit frischem DMEM Wachstumsmedien. Für eine effiziente ASM Knockdown, die Gerichte sollten weiter bei 37 ° C / 5% CO 2 für ca. 31 h (insgesamt 55 Stunden) vor dem Live-Bildgebung inkubiert werden.

2. Vorbereitung der Reagenzien für Live-Mikroskopie

  1. Eine Lösung von rekombinantem porenbildenden Toxin Streptolysin O (SLO) bei einer Konzentration von 100 ng / ul in kaltem 1x PBS ohne Ca 2 + und Mg 2 +. Die in diesen Tests verwendeten SLO ist constitutively aktiven Cystein-Mutante, die nicht erfordert Reduktionsmittel für Aktivität, freundlicherweise von Dr. Rod Tweten, University of Oklahoma ist. Das Toxin wurde in E. ausgedrückt coli BL21 DE3 und unter nativen Bedingungen gereinigt, wie zuvor 16 beschrieben.
  2. Bereiten Sie den FM1-43 Stammlösung resuspendieren FM1-43 gefriergetrocknetes Pulver in DMSO, um eine 25 mM Lösung zu schaffen.
  3. Bereiten Lösung A: Verdünnen Sie die FM1-43-Stammlösung in kaltem DMEM mit Ca 2 + bis zu einer endgültigen Konzentration von 4 uM (1,5 ml pro MatTek Gericht erforderlich) zur Lagerung auf Eis, bis sie benötigt.
  4. Bereiten Lösung B: Verdünnen Sie die FM1-43-Stammlösung in kaltem DMEM ohne Ca 2 + und 10 mM EGTA (Ca 2 +-freiem DMEM) in einer Endkonzentration von 4 uM (1,5 ml, die pro MatTek Gericht) und speichern auf Eis, bis benötigt.
  5. Pre-warm (37 ° C) Je 1 ml Lösung A und Lösung B in Eppendorf-Röhrchen.
  6. Halten auf Eis Lösungen von DMEM mit Ca 2 + und Ca 2 +-freiem DMEM.

3. Live Cell Imaging von FM1-43 Influx in SLO behandelten und unbehandelten Zellen

  1. Füllen Sie eine mittelgroße flache Metallbehälter mit Crushed Ice, kehren sie in einem großen Glasbehälter mit Eis, und zusätzliche Eis nur die Bodenfläche des Metallbehälters ausgesetzt verlassen. Legen Sie ein nasses Papiertuch auf dem freiliegenden Metallboden für gleichmäßigen Wärmefluss zu ermöglichen.
  2. Nehmen Sie eine Kontroll-siRNA-behandelten MatTek Gericht (Probe 1) und legen Sie sie auf dem kalten nassen Papiertuch. Vorsichtig absaugen alle Medien und 3x waschen mit kaltem Ca 2 +-freiem DMEM. Nach dem letzten Wasch, absaugen alle Medien in die Schüssel.
  3. Um Bildzellassoziierte FM1-43-Zellen ohne SLO Verwundung (Probe 1) in Gegenwart von Ca 2 +, 180 &mgr; l hinzugefügt kalten Lösung B zum Zentrum Deckglas der Bodenschale 35 mm Glas und Inkubation für 5 min auf Eis (Tabelle 1).
  4. Platzieren MatTek Schale auf der Bühne eines konfokalen Mikroskops auf 37 ° C erhitzt und mit einer Klimakammer (die Temperatur, Feuchtigkeit und CO 2-Gehalt beibehalten wird) ausgestattet. Finden Sie den Bereich der Zellen, der abgebildet werden soll der Blick durch ein 40x NA 1.3 Objektiv (Nikon). Falls vorhanden, schalten Sie PerfectFocus oder einem ähnlichen Gerät, um die thermische Drift zu korrigieren.
  5. 1 ml der vorgewärmten Lösung A sanft auf die Seite der 35-mm-Schale und Deckel ersetzen, der Umweltkammer (Tabelle 1).
  6. Erwerben Sie Bilder für 4 min bei 1 Frame alle 3 Sek. mit entsprechenden Bildbearbeitungssoftware (Volocity in der Ultraview Vox Perkin Elmer Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie-System). Anregung der FM1-43 mit einem 488-nm-Laserlinie unter Verwendung eines dichroitischen Filters mit einem 488 nm Bandpassgeführt und Emissions Diskriminierung wird durch die Verwendung eines 527 (W55) Emissionsfilter erreicht. Laserleistungsniveaus und die ISO-Empfindlichkeit eingestellt, Bildaufnahmen von 100 ms zu erreichen.
  7. Die Schritte 3.2 bis 3.6 FM1-43 Kontroll-siRNA-behandelten Zellen in Abwesenheit von Ca 2 + zu erfassen ohne SLO Verwundung (Probe 2), mit der Ausnahme, daß im Schritt 3.5 die Lösung B hinzugefügt werden soll (Tabelle 1).
  8. Um FM1-43-Einstrom in Steuer siRNA-behandelten Zellen mit SLO entweder in Gegenwart (Probe 3) oder Abwesenheit von Ca 2 + (Probe 4), fügen Sie 180 ul der kalten Lösung B enthält SLO zum Zentrum Deckglas der Verwundeten zu messen 35-mm-Glasbodenschale und Inkubation für 5 min auf Eis, wie in Schritt 3.3. Wiederholen Sie die Schritte 3.2 bis 3.6; einstellen Zugabe entweder Lösung A oder Lösung B in Schritt 3.5 (Tabelle 1).
  9. Um die Rolle von ASM in der Plasmamembran Reparatur, wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,6 mit ASM siRNA-behandelten Zellen für alle Bedingungen (Proben 5-8) (Tabelle 1).
  10. Um die Rolle von extrazellulärem rekombinanten Sphingomyelinase (SM) auf derKinetik der Plasmamembran Reparatur (reflektiert durch die Hemmung in FM1-43 Zustrom) (Proben 9-10), wird SM aufgenommen (0-50 uU) entweder Lösung A oder Lösung B in Schritt 3.5 und dann während der Live-Zelle hinzugefügt, um Zellen Imaging in einem Gesamtvolumen von 1 ml (Tabelle 1).

4. Quantifizierung von FM1-43-Einstrom in Zellen

  1. Nach Filmen erworben wurden, messen die intrazelluläre Fluoreszenzintensität von FM1-43 unter Verwendung von Bildanalyse-Software (Volocity Suite, PerkinElmer). Zeichnen eines Bereichs von Interesse in der zytosolischen Bereich jeder Zelle in dem Feld und Anwendung der Softwaretools, um die mittlere FM1-43-Fluoreszenzintensität in allen Frames der Video bestimmen.
  2. Um Schwankungen in der Ausgangs FM1-43-Färbung einzustellen, werden die Daten für jede Video fachen Anstieg in der Fluoreszenzintensität über die Zeit ausgedrückt, aufgetragen und für jeden unterschiedlichen Zustand. Die Zunahme in der Fluoreszenz der einzelnen Zeitpunkt proZelle als F T / F 0, wobei F T die mittlere Fluoreszenz im festen Zeitpunkt berechnet wird, und f 0 die mittlere Fluoreszenz zum Zeitpunkt t = 0 (Fig. 1-2).

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Ergebnisse

Niedrige Konzentrationen von bakteriellen Sphingomyelinase (SM) Rettungsplasmamembran-Reparatur in Zellen in lysosomalen sauren Sphingomyelinase erschöpft.

Verwendung der FM1-43 Abbildungsassay wir früher gezeigt, dass Zellen defizient für das lysosomale Enzym ASM und SLO ausgesetzt Verwundung in Gegenwart von Ca 2 + über einen Plasmamembran-Defekt wird durch extrazelluläre Zugabe des rekombinanten menschlichen Enzyms 19 gerettet. Da das humane lysosomale ASM hat einen nie...

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Diskussion

Frühere Studien über mechanische Verletzungen und Plasmamembran Reparatur verließ sich auf vielfältige Mechanismen der Zellen zu verletzen, die von Fallenglasperlen, Mikropipettiervorrichtung, Scheren, Kratzen oder Schaben. Das Auslesen von all diesen Tests war eher qualitative als quantitative und hat genaue Informationen über die Kinetik der Reparaturmechanismus nicht geben. Die Fähigkeit von Zellen, die Plasmamembran nach dieser Formen von Verletzungen verschließen wurde durch die Anwesenheit oder Abwesenheit von Tra...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, sie haben keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse R37 und R01 AI34867 GM064625 zu NWA Wir danken Dr. R. Tweten von der Universität von Oklahoma für die SLO-Expressionsplasmid unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenz
HeLa 229 ZelllinieATCCCCL2-1
DMEM Invitrogen mit hohem Glukosegehalt 11965
DMEM mit hohem Glukosegehalt ohne CalciumInvitrogen20168
FM1-43InvitrogenT3163
Optimem reduziertes SerumInvitrogen31985
Lipofectamine RNAiMaxInvitrogen13778
Kontrollmedium GC-Gehalt RNAi OligoInvitrogen12935300
SMPD1 RNAi OligoInvitrogenHSS143988
Fötales Rinderserum HitzeinaktivierteGemini-Bioproducts100-106
Sphingomyelinase aus Bacillus cereusSigmaS7651
35 mm-GlasbodenschüsselnMatTekP35G-0-14
Material
Inverses MikroskopNikonEclipse Ti
KameraHamamatsu PhotonicsC9100-50
Konfokales Spinning-Disk-MikroskopPerkinElmerUltraViewVoX
Software-Analyse SoftwarePerkinElmerVolocity Suite
KlimakammerPathologiegeräteLiveCell System Kammer

Referenzen

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