Verbesserung der Erfolgsrate der Proteinkristallisation nach Zufall Microseed Matrix Screening

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein allgemeines Verfahren für zufällige microseed Matrix-Screening. Diese Technik wird gezeigt, dass die Erfolgsrate der Proteinkristallisation Screening-Experimenten deutlich erhöhen, reduzieren die Notwendigkeit für Optimierung, und bieten eine zuverlässige Versorgung von Kristallen für die Datenerhebung und-Ligand-Einweichen Experimenten.

Zusammenfassung

Zufalls microseed Matrix-Screening (RMM) ist ein Protein, in dem Kristallisationstechnik Impfkristalle zufällige Bildschirme aufgenommen. Durch die Erhöhung der Wahrscheinlichkeit, dass die Kristalle in der metastabilen Zone Phasendiagramm eines Proteins wachsen, werden zusätzliche Kristallisation führt oft erhalten, die Qualität der Kristalle hergestellt werden, können erhöht werden, und eine gute Versorgung der Kristalle für die Datensammlung und Einweichen Experimente ist. Hier beschreiben wir eine allgemeine Methode zur Risikomanagementmaßnahmen, die entweder im Sitzen Drop oder hängenden Tropfen Dampfdiffusionsexperimente, entweder von Hand oder mit Liquid-Handling-Robotik, in 96-Well-oder 24-Well-Format etabliert Fach angewandt werden können.

Einleitung

Aus der erstmaligen Anwendung von Perutz, Kendrew und Mitarbeiter bei der Bestimmung der Strukturen von Hämoglobin und Myoglobin, zu den modernen automatisierten Hochdurchsatz-Rohrleitungen der strukturelle Genomik Konsortien hat makromolekularen Röntgenkristallographie uns einen beispiellosen Einblick in die strukturelle Protein-Welt gewährt . Diese Technik bleibt die weithin für experimentelle Methode, die die direkte Visualisierung von Proteinstrukturen auf atomarer erlaubt oder in der Nähe atomarer Auflösung (dh in der 3.1 Å-Bereich). Eine Voraussetzung für die Röntgenbeugung an ein Protein angewendet werden, ist, dass es zunächst kristallisiert werden, ....

Protokoll

1. Strategische Überlegungen

1. Die Wahl der Samenkristalle für microseeding Versuchen verwendet werden, je nach dem Ziel des Experiments variieren. Zu Beginn eines Projektes ist es hilfreich, mehrere Kristallisations Hits, die alternative Startpunkte für Kristall-Optimierung bieten kann. RMM reduziert die Notwendigkeit für kristall Optimierung weil gute Qualität Kristalle sind eher in der metastabilen Zone des Phasendiagramms, also in dem Bereich, wo folgende Störung oder Keimbildung kehrt das System ins Gleichgewicht zu wachsen. Wir schlagen daher vor, mit RMM routinemäßig, sobald die ersten Kristalle erhalten (oder, genauer gesagt, sobald die erst....

Ergebnisse

(A) Beispiel für ein Experiment Rmms

Um die Wirksamkeit der RMM-Screening zeigen wir diese Methode angewandt, um die Kristallisation von Hühnereiweiß-Lysozym (HEWL) und Rinderleber-Katalase (BLC). Beide Enzyme sind hervorragend kristallisierbarem und strukturell gut charakterisiert Ziele ^{15, 16.} Als solche bieten beide ausgezeichnete Testpersonen, mit denen die Erfolgsquote verbesserte Kristallisations erreichbar mit RMM illustrieren. Es wurden Experimente in 96-Well-Sitting Drop Tab.......

Diskussion

In diesem Papier haben wir eine allgemeine Methode zur Proteinkristallisation Rmms Screening beschrieben. Wir haben mit zwei Testproteine ​​eine signifikante Verbesserung bei der Kristallisation Erfolgsrate dieser Methode demonstriert. Beugungsanalyse mit Synchrotronstrahlung einer Teilmenge der Kristalle, die unter Verwendung RMM und nicht-Rmms Methoden zeigte wenig Veränderung in der Qualität zwischen Beugungs Kristalle gewachsen mit beiden Methoden, obwohl früheren Autoren haben berichtet, dass gute Qualität Kristall.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
MRC 96 Vertiefungskristallisationsschalen	Molecular Dimensions Ltd	MD11-00-100	Nicht UV-kompatibel, für vom Roboter erstellte Siebe
ClearView-Dichtungsfolien	Molecular Dimensions Ltd	MD6-01S
Henne Eiweiß Lyzozym	Sigma-Aldrich	L6876	~95% Reinheit
Rinderleberkatylase	Sigma-Aldrich	C9322	95% Reinheit
Xylanase	Hampton Research	HR7-104
Thaumatin aus Thaumatococcus daniellii	Sigma-Aldrich	T7630
Thermolysin aus Bacillus thermoproteolyticus rokko	Sigma-Aldrich	P1512
JCSG-plus HT-96 Sieb	Molecular Dimensions Ltd	MD1-40	Für Siebe, die vom Roboter
PACT Premier HT-96 erstellt wurden Sieb	Molecular Dimensions Ltd	MD1-36	Für Siebe, die vom Roboter
Morpheus HT-96 erstellt wurden, Sieb	Molecular Dimensions Ltd	MD1-47	Für Siebe, die vom Roboter erstellt
wurden Crystal Ph– nix liquid handling system	Art Robbins Instruments	602-0001-10
Rocaille-Set	Hampton Research	HR2-320
Binokulares Stereomikroskop	Leica	M165C
Skalpellklingen	Sigma-Aldrich	S2646-100EA
ErgoOne 0,1-2,5 μ l Pipette	Starlab	S7100-0125
ErgoOne 2-20 μ l Pipette	Starlab	S7100-0221
ErgoOne 100-1000 μ l Pipette	Starlab	S7100-1000
JCSG-plus Sieb	Molecular Dimensions Ltd	MD1-37	Für von Hand erstellte Screens
PACT Premier Screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-29	Für von Hand erstellte Screens
Morpheus Screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-46	Für von Hand erstellte Screens
Pinzette	Sigma-Aldrich	T5415-1EA
CrystalClene-Deckgläser 18 mm	Molecular Dimensions Ltd	MD4-17
2 ml Glaspasteur-Pipetten	Sigma-Aldrich	Z722669
Vortex-Mischer	Fisher Scientific	02-215-360
24-Well-XRL-Kristallisationstablett	Molecular Dimensions Limited	MD3-11	Für von Hand
etablierte Siebe30 % (w/v) PEG 8000, 0,2 M Ammoniumsulfat, 0,1 M Natriumcacodylat pH 6,5
20 % (w/v) PEG 8000, 0,2 M Magnesiumacetat, 0,1 M Natriumcacodylat pH 6,5
20 % (w/v) PEG 6000, 100 mM Zitronensäure pH 5,0