Lokalisierung und Relative Quantifizierung der Kohlenstoff-Nanoröhrchen in Zellen mit multispektrale Imaging Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

In dieser Studie bestand der Hauptzweck darin, die zelluläre Aufnahme und eventuelle Exozytose von Kohlenstoffnanoröhren (CNTs) zu überwachen. Aus dieser Perspektive haben wir hier eine einzigartige Methode mit Hilfe der multispektralen bildgebenden Durchflusszytometrie vorgeschlagen, die eine Quantifizierung und Lokalisierung von CNTs in einer statistisch relevanten Anzahl von Zellen ermöglicht.

Zusammenfassung

Kohlenstoff-Nanomaterialien, wie Kohlenstoffnanoröhrchen (CNTs), gehören zu diesem Typ von Nanopartikeln, die sehr schwer von kohlenstoffreichen Zellstrukturen unterscheiden und de facto noch keine quantitative Methode, um ihre Verteilung auf Zell-und Gewebespiegel zu beurteilen sind. Was wir hier vorschlagen, ist eine innovative Methode, die den Nachweis und die Quantifizierung von CNTs in Zellen unter Verwendung eines multispektrale Bild Durchflusszytometer (Image, Amnis). Das neu entwickelte Gerät integriert sowohl eine Hochdurchsatz von Zellen und hochauflösende Bildgebung und bietet damit Bilder für jede Zelle direkt in Fluss und somit statistisch relevante Bildanalyse. Jedes Bild Zelle auf Hellfeld (BF), Dunkelfeld (DF) und Fluoreszenzkanäle, die den Zugang jeweils auf das Niveau und die Verteilung der Lichtabsorption, Streulicht und Fluoreszenz für jede Zelle erworben. Die Analyse besteht dann in einer Pixel-für-Pixel-Vergleich von jedem Bild der 7,000-10,000-Zellen für jede Bedingung des Experiments erfasst. Lokalisierung und Quantifizierung von CNTs wird möglich durch einige besondere intrinsischen Eigenschaften von CNTs gemacht: starke Lichtabsorption und Streuung, ja CNTs werden als stark absorbiert dunkle Flecken auf BF und helle Flecken auf DF mit einer präzisen Kolokalisation.

Diese Methode könnte erhebliche Auswirkungen auf die Studien über Wechselwirkungen zwischen Nanomaterialien und Zellen gegeben, dass dieses Protokoll ist für einen großen Bereich von Nanomaterialien, soweit sie absorbieren kann (und / oder Streuung) sind stark genug, um das Licht.

Einleitung

In den letzten Jahrzehnten hat der Platz von Nanopartikeln in einer Vielzahl von Anwendungen an Bedeutung gewonnen. Insbesondere Kohlenstoff-Nanoröhren (CNTs) werden zunehmend als Nanowerkzeuge für vielfältige diagnostische und therapeutische Anwendungen erforscht; Aufgrund ihrer besonderen elektrischen, thermischen und spektroskopischen Eigenschaften können CNTs als Transportvehikel für verschiedene Medikamente oder Kontrastmittel fungieren oder auch am Tissue Engineering beteiligt sein¹.

Bedenken hinsichtlich der potenziellen Toxizität solcher Nanomaterialien werden jedoch immer noch diskutiert, hauptsächlich weil das Schicksal von CNTs im Organismus sehr umstritten bleibt. Es gibt in der Tat einen Mangel an geeigneten Methoden, um sie in lebenden Zellen und Geweben nachzuweisen und zu quantifizieren: Zum Beispiel wurden Techniken wie Raman-Spektroskopie, Photoakustik und Nahinfrarot-Photolumineszenz-Bildgebung vorgeschlagen, aber jede Methode zeigt je nach Art der Nanoröhren und/oder ihrer Umgebung Grenzen^2-8.

Hier könnte die vorgeschlagene Methode für den Nachweis und die Quantifizierung von Nanopartikeln in Zellen anwendbar sein. Möglich wurde dies durch den Einsatz von ImageStream, einem Gerät, das sowohl Durchflusszytometrie als auch hochauflösende Bildgebung kombiniert. Es kombiniert die Vorteile der Erfassung einer großen Anzahl von Zellen (bis zu 5000 Ereignisse/s) - mit den Vorteilen statistischer Daten und hochauflösender Bilder jeder Zelle zur gleichen Zeit (0,5 μm räumliche Auflösung). Im Allgemeinen werden Bilder mit einer CCD-Kamera aufgenommen und sind eine zweidimensionale Graustufendarstellung der Zelle. Das Licht wird für jedes Pixel im Bild quantifiziert und identifiziert sowohl die Intensität als auch die Position von Fluoreszenz oder Komponenten mit subzellulärer Größe (z. B. bei BF), wodurch eine leistungsstarke Fähigkeit ermöglicht wird, Zellen anhand ihres Aussehens zu unterscheiden^9,10.

Ziel war es, eine Nanomessmethode zu entwerfen, die eine quantitative Beurteilung der Verteilung und des Verhaltens von CNTs in Zellen ermöglicht. Diese Methode wurde insbesondere entwickelt, um die zelluläre Aufnahme, Verarbeitung und Exozytose von CNTs durch Zellen zu untersuchen. Wir haben zum einen den komplexen zellulären Transport von CNTs und zum anderen den Transfer dieser Nanomaterialien zwischen Zellen nachgewiesen: Zell-internalisierte CNTs entkommen ihren Wirtszellen, wenn sie gestresst sind, verteilen sich im extrazellulären Raum und werden von naiven Zellen, unabhängig davon, ob sie homotypisch oder heterotypisch sind, reinternalisiert¹¹

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Frühere Studien zeigten, dass je nach CNT-Funktionalisierung und Aggregationszustand unterschiedliche Mechanismen der Zellaufnahme, entweder aktive oder passive, auftreten können¹². Hier wurden die mehrwandigen CNTs durch 1,3-dipolare Cycloaddition und Amidierung funktionalisiert und anschließend mit einer Fluoreszenzsonde, Fluoresce in Isothiocyanat (FITC), derivatisiert. In der Transmissionselektronenmikroskopie scheinen sie von Zellen entweder einzeln mit zytosolischer Lokalisation oder als Bündel internalisiert zu werden, meist in endosomalen und lysosomalen Kompartimenten zu finden¹¹. Auf ImageStream erscheinen die geclusterten CNTs mit einer hohen Korrelation als dunkle Flecken auf BF und helle Flecken auf DF, was eine klare Unterscheidung zwischen CNT-markierten Zellen und Kontrollzellen ermöglicht. Auf der anderen Seite war die Verteilung des Fluoreszenzsignals, das von dem mit CNTs funktionalisierten Fluoreszenzmarker emittiert wurde, nicht so gut kolokalisiert: Tatsächlich stimmen die grünen Fluoreszenzflecken, wahrscheinlich aufgrund eines Quenching-Phänomens, nicht unbedingt mit den Flecken auf BF und DF überein. Dies deutet darauf hin, dass erstens eine Fluoreszenzsonde für die Detektion von CNTs mit dem ImageStream nicht zwingend erforderlich ist, und zweitens - erst recht - nicht vollständig repräsentativ für die Quantifizierung und Lokalisierung von CNTs ist.

Neben einer statistischen relativen Quantifizierung von Nanopartikeln liefert diese Methode auch Informationen über die Lokalisierung von CNTs in Zellen, was bedeutet, dass sie z.B. CNTs im Inneren der Zelle von denen unterscheidet, die an die Plasmamembran gebunden sind. Die Möglichkeit, CNTs auf Zellbildern zu lokalisieren, überwindet deutlich die Grenzen der konventionellen Durchflusszytometrie-Analyse¹³. Das Verfahren wurde hier über die Erstellung von Masken entwickelt, die zu bestimmten Regionen der Zelle passen, und die Selektion auch der dunklen Flecken, die den beladenen CNTs entsprechen.

Im Allgemeinen könnte diese Methode für eine Vielzahl von Experimenten angewendet werden, bei denen eine Visualisierung oder Quantifizierung in Zellen erforderlich ist, unter der Bedingung, dass die verwendeten Nanopartikel in der Lage sind, das Licht stark zu absorbieren (und/oder zu streuen).

Protokoll

1. Herstellung von wasserdispergierbaren Kohlenstoff-Nanoröhrchen (CNTs)

1. Die ersten CNTs werden in Zellkulturwasser dispergiert, bevor sie 20 Minuten lang in einem Badewasser-Ultraschallgerät bei 20 °C beschallt werden. Wenn CNTs mit einer Fluoreszenzsonde funktionalisiert werden, schützen Sie sie während des gesamten Experiments so weit wie möglich vor Licht.

2. Markieren von Zellen mit CNTs

1. Züchten Sie humane Nabelvenendothelzellen (HUVEC) (z. B.) auf 25 cm² großen Platten in DMEM-Medium, das 10 % fötales Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin enthält.
2. Bereiten Sie Lösungen von CNTs in Konzentrationen von 0, 10, 20 und 50 μg/ml in vollständigem Medium vor und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 20 Stunden oder bei 4 °C für 20 Stunden (2 ml CNT-Suspension für eine 25 cm² Platte).

3. Zellfixierung

1. Entfernen Sie anschließend das Inkubationsmedium, spülen Sie die Zellen mit PBS, trypsinisieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in vollständigem DMEM-Medium. 5 min bei 1.200 U/min zentrifugieren.
2. Ersetzen Sie das Medium zuerst durch Paraformaldehyd 4 % für 1 Stunde bei 4 °C, dann durch PBS, um sie zu konservieren. Bei Bedarf können die Zellen in diesem Stadium des Prozesses mehrere Tage lang bei 4 °C gelagert werden, bis die zytometrische Analyse durchgeführt wird.
3. Jede Probe muss etwa 10⁶ Zellen enthalten, die in 50 μl PBS konzentriert sind. Suspendieren Sie sie korrekt, um Aggregate während der Analyse zu vermeiden, und filtern Sie sie durch einen 50 μm Maschenfärber.
   Hinweis: Jeder Schritt muss sehr schonend durchgeführt werden, um die Zellen zu erhalten.

4. ImageStream-Erfassung

Verwenden Sie das multispektrale bildgebende Durchflusszytometer ImageStream, um Bilder von Zellen aufzunehmen.
Einige Punkte sind zu beachten:

1. Wählen Sie eine angepasste Vergrößerung (hier wird ein 40-faches Objektiv verwendet).
2. Bei Verwendung von Fluorochromen:
   - Bereiten Sie eine Kontrollprobe ohne Fluorochrom vor.
   - Bereiten Sie die Zellen mit einer einfarbigen Positivkontrolle für jedes Fluorochrom vor, das in
   Zusatz zu Ihren Proben.
3. Verwenden Sie den Laser 488 nm, um den FITC anzuregen, und den Kanal 02, um die Fluoreszenzemission zu erfassen (Bandpass 480-560 nm). Zusätzlich können Sie auch die Kanäle 01 und 06 für das Hellfeld (BF) bzw. das Dunkelfeld (DF) verwenden.

5. Nachbearbeitung - IDEAS Analysesoftware (Version 4.0)

1. Unter allen erfassten Ereignissen muss die Analyse zunächst auf die Population einzelner Zellen beschränkt werden: Verwenden Sie ein biparametrisches Punktdiagramm, das das "Seitenverhältnis" (d. h. Breite/Höhe) und die "Zellfläche" (Parameter, die auf Zellen auf BF angewendet werden) darstellt (Abbildung 1). Einzelne Zellen, die in der interessierenden Region mit einer Standardfläche und einem Aspektverhältnis nahe 1 enthalten sind, werden dann von mehrzelligen Ereignissen (große Fläche und kleines Aspektverhältnis) und Trümmern (extrem kleine Fläche) unterschieden.
2. Um Zellen in der fokussierten Ebene auszuwählen, verwenden Sie ein biparametrisches Punktdiagramm, das für stark kontrastreiche CNTs-markierte Zellen angepasst ist: Zeichnen Sie den "Kontrast" im Vergleich zum "RMS-Gradienten" (der die Schärfequalität eines Bildes misst) auf dem BF-Bild auf - es ermöglicht den Ausschluss von unfokussierten Zellen, die sowohl einen niedrigen RMS-Gradienten als auch einen geringen Kontrast in ihren BF-Bildern aufweisen (Abbildung 1).
3. 1. Bestimmen Sie den Parameter, der die beste statistische Trennung zwischen beschrifteten und unbeschrifteten Zellen bietet, indem Sie die Option "Das beste Merkmal suchen" verwenden. In unserer Studie ist das mittlere Pixelobjektmerkmal der Parameter, der am besten geeignet ist (Abbildung 2).
   2. Verfolgen Sie ein Histogramm mit diesem Parameter im Vergleich zur normierten Häufigkeit, um die Menge der aufgenommenen CNTs für die getesteten Konzentrationen zu vergleichen (Abbildung 3).
   3. Verfolgen Sie den biparametrischen Graphen 'mittleres Pixelobjekt auf BF' (Notation: Mean Pixel_Object (M01,Ch01,Tight)_Ch01) versus 'intensity on DF'(Intensity_MC_Ch06), um die Korrelation zwischen diesen beiden Parametern zu untersuchen (Abbildung 4).
4. Die Quantifizierung wird auch anhand von Masken bewertet:
   1. Da CNTs auf BF als stark absorbierende dunkle Flecken erscheinen, erstellen Sie zunächst eine Schwellenwertmaske, die genau zu ihnen passt, indem Sie in dieser Studie einen begrenzten Bereich von Pixeln mit geringer Intensität zwischen 0 und 533 auswählen (Maske 1, Notation: Intensität(M01, BF, 0-533)) (Abbildung 5). Die Wahl der Schwellenintensität erfolgt an markierten Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen.
   2. Erstellen Sie umgekehrt auch eine Maskenanpassung mit den Pixeln hoher Intensität (in diesem Fall 150-4095) des DF (Maske 2, Notation: Intensity (M06, DF, 150-4095)) (Abbildung 6).
   3. Zeichnen Sie ein Diagramm mit der Fläche der Maske (entweder 1 oder 2; (Notation: Area_Intensity(M01, BF, 0-533)für Maske 1): Es wird eine relative Quantifizierung der Internalisierung von CNTs bei verschiedenen Konzentrationen liefern (Abbildung 7).
   4. Überprüfen Sie den Grad der Korrelation zwischen diesen beiden Masken (dank des biparametrischen Diagramms "Fläche von Maske 1" versus "Fläche von Maske 2") (Abbildung 7).
5. Erstellen Sie andere Masken, um CNTs in Zellen zu lokalisieren:
   1. Eine Maske, die sich dem Inneren der Zelle anpasst: Erode (M01, 7) - entspricht der Maske der gesamten Zelle (M01) (Abbildung 8), die weiter um 7 Pixel erodiert wird (Abbildung 9).
   2. Eine Maske, die nur mit der Booleschen Gleichung an die Membran angepasst wird: M01 und nicht Erode(M01,7) - Maske der gesamten Zelle (M01) subtrahiert vom Inneren (Erode(M01,7)) (Abbildung 10).
   3. Um die dunklen Pixel auf der Membran (entsprechend CNTs) zu berücksichtigen, erstellen Sie dann die Maske: Intensität(M01 und nicht Erode(M01, 7), BF, 0-533) (Abbildung 11).
   4. Visualisieren Sie die verschiedenen Masken, die auf eine Sammlung von Zellen angewendet werden, um ihre Relevanz für beschriftete und unbeschriftete Zellen zu überprüfen (Abbildung 12).
   5. Wenden Sie den Merkmalsbereich auf die Maske an, indem Sie die schwarzen Pixel auf der Membran "Area_Intensität(M01 und nicht Erode(M01, 7), BF, 0-533)", den sogenannten schwarzen Bereich, auswählen. Es wird die Quantifizierung der CNTs auf der Membran ermöglichen.
      
      Um schließlich CNTs, die internalisiert wurden, von denjenigen zu unterscheiden, die nur auf der Membran adsorbiert werden, wird der schwarze Bereich auf der Membran mit dem schwarzen Bereich auf der gesamten Zelle verglichen (d. h. "Area_ Intensität(M01 und nicht Erode(M01, 7), BF, 0-533" versus "Area_ Intensität(M01, BF, 0-533)").
      
      Anmerkung: Die gleiche Art von Verfahren wird mit dem FITC-Fluoreszenzsignal angewendet: Vergleichen Sie die Zunahme der Intensität der FITC-Fluoreszenz mit der Abnahme des mittleren Pixelsignals auf dem BF oder die Kolokalisation zwischen dunklen Flecken auf dem BF und der FITC-Fluoreszenzintensität. In unserem Fall ist diese Art der Analyse nicht relevant, da das Fluoreszenzsignal nicht korrekt mit den dunklen Flecken auf BF einerseits und dem Hellfeld auf DF andererseits übereinstimmt, was zeigt, dass die intrinsischen Eigenschaften von CNTs (Lichtabsorption und Streuung) besser geeignet sind als das Signal, das sich auf die Fluoreszenzsonde bezieht.
6. Sobald alle Diagramme unter einer experimentellen Bedingung erstellt wurden, erstellen Sie eine "statistische Berichtsvorlage", speichern Sie die Vorlage als .ast-Datei und stapeln Sie alle Datendateien.

Ergebnisse

Ein Überblick über das Prinzip des ImageStream-Geräts wird in Abbildung 1 gegeben. Es erzeugt mehrere hochauflösende Bilder jedes einzelnen Zells im Durchfluss, einschließlich Hellfeld (BF), Dunkelfeld (DF oder seitlich gestreutes Licht) und Fluoreszenzkanal(e), wie in Abbildung 2 an drei verschiedenen, mit CNTs markierten Zellen veranschaulicht. Die Überlagerungen dieser Kanäle sind ebenfalls dargestellt und zeigen auf den ersten Blick die Korrelation.

Da die gesamte Nachbearbeitungsanalyse auf der Zellbildgebung basiert, ist die Auswahl fokussierter Zellen entscheidend für die Studie (Abbildung 3). Tatsächlich führt das Vorhandensein von CNTs zu Veränderungen sowohl im Kontrast als auch im Gradienten im Vergleich zu nicht markierten Zellen: Gefokussierte Zellen, die eine große Menge an CNTs aufgenommen haben, weisen tendenziell einen niedrigen rms-Gradienten (der gewöhnlich der einzige Parameter zur Unterscheidung von fokussierten gegenüber unfokussierten Zellen ist) auf, zeigen aber gleichzeitig einen hohen Kontrast, weshalb eine biparametrische Darstellung unerlässlich ist. In Abbildung 3 ist die Unterscheidung zwischen unfokussierten (gelber Bereich) und fokussierten Zellen (blauer Bereich) dargestellt.

In Zellen aufgenommene CNTs sind deutlich erkennbar – insbesondere im Hellfeld als stark absorbierende dunkle Stellen (siehe Einfluss unterschiedlicher Markierungskonzentrationen, Abbildung 4). Außerdem wurde das mittlere Pixelsignal im Hellfeld analysiert, das eine relative Quantifizierung der Aufnahme ermöglicht: Die Diagramme in Abbildung 5 zeigen eine signifikante Zunahme mit steigender CNT-Markierungskonzentration (Ergebnisse für etwa 7.000 Zellen pro experimenteller Bedingung).

Zweitens ist die Quantifizierung von CNTs ebenfalls durch die Verwendung von Masken möglich, die entweder auf einen begrenzten Bereich dunkler Pixel des BF oder auf die Pixel hoher Intensität des DF angewendet werden (siehe Beispiele in Abbildung 6), die den Flecken entsprechen, die durch das Vorhandensein von CNTs entstehen. Daher ermöglicht die Auftragung der Fläche dieser Masken sowohl die Hervorhebung als auch die Zunahme der Aufnahme zu veranschaulichen (veranschaulicht in Abbildung 7 anhand der Fläche der Maske auf dem BF, wobei Pixel im Bereich von 0–533 ausgewählt werden).

Außerdem kann die Korrelation zwischen den Flecken auf BF und DF bewertet werden, indem die DF-Intensität gegen das mittlere Pixelsignal auf BF (wie in Abbildung 8) (maskenunabhängige Analyse) oder die Fläche der Maske auf BF (Maske 1) gegen die Fläche auf DF (Maske 2) aufgetragen wird.

Bezüglich des Verfahrens zur Lokalisierung von CNTs innerhalb der Zellen zeigt Abbildung 9A die verschiedenen erstellten Masken. Beachten Sie, dass die Robustheit der Lokalisierungsmasken (basierend auf der Erosion der Standard-Zellmaske) visuell an einer Reihe von markierten und unmarkierten Zellen überprüft werden muss. Dieselben Masken werden für alle Proben verwendet.

Darstellung der Gesamtfläche schwarzer Flecken auf der Zellmembran gegenüber die für die gesamte Zelle einen Internalisierungsscore liefert für Zellen, die 20 Stunden lang inkubiert wurden bei 37 °C im Vergleich zur 2-stündigen Inkubation bei 4 °C (siehe Abbildung 9B); es zeigt an, dass sich CNTs hauptsächlich auf der Membran befinden 4 °C, während bei 37 °C CNTs werden von mehr als 90 % der Zellen internalisiert.

Schließlich wurde bezüglich der Fluoreszenz dieser Parameter aufgrund einer zu geringen Korrelation zwischen fluoreszierenden Stellen und Stellen im Hellfeld (und Dunkelfeld) nicht als Indikator für die Quantifizierung von CNTs verwendet. Tatsächlich zeigt die Korrelation zwischen der FITC-Intensität und dem mittleren Hellfeld-Pixel einen Pearson-Korrelationskoeffizienten von -0,2. In Abbildung 10 sind zwei Fälle dargestellt, in denen das Fluoreszenzsignal entweder gut oder nicht mit dem schwarzen Fleck im Hellfeld übereinstimmt.

Abbildung 1. Übersicht über die allgemeine Funktionsweise des ImageStream. Das multispektrale Bildgebungssystem erfasst bis zu 12 Bilder/Zelle in drei verschiedenen Modi: Hellfeld, Dunkelfeld und Fluoreszenz. Die Anordnung umfasst fünf Anregungslaser mit den Wellenlängen 405, 488, 560 und 658 nm. Das von den in der Küvette strömenden Zellen emittierte Licht wird mit verschiedenen Objektiven gesammelt (in dieser Studie wurde das 40X-Objektiv verwendet) und an das spektrale Zerlegungselement weitergeleitet, das aus einem Satz von Langpassfiltern in einer winkeligen Anordnung besteht. Die CCD-Kamera, die die Zellbilder aufnimmt, arbeitet nach einer als Zeitverzögerungsintegration bezeichneten Technik, um Bildverschmierungen zu vermeiden. Eine erweiterte Tiefenschärfe (EDF) ist optional verfügbar.

Abbildung 2. Bildergalerie von Zellen, die mit Kohlenstoffnanoröhren (50 μg/mL) markiert wurden und mit dem ImageStream über verschiedene Kanäle (Hellfeld (BF), Dunkelfeld (DF), Fluoreszenz (FITC) sowie Überlagerungen dieser) aufgenommen wurden. Innerhalb intrazellulärer Lysosomen eingeschlossene Kohlenstoffnanoröhren erscheinen als große schwarze Flecken auf den Hellfeldaufnahmen. Umgekehrt erzeugen sie helle Flecken auf den Dunkelfeld- und Fluoreszenzbildern.

Abbildung 3. Auswahl scharfgestellter Zellen. Ein bivariater Punktediagramm, das die quadratische Mittelabweichung (rms) des Gradienten im Vergleich zum Kontrast in Hellfeldaufnahmen darstellt, ermöglicht den Ausschluss unscharfer Zellen. Der gelbe Bereich kennzeichnet hier unscharfe Zellen, während scharfe Zellen blau dargestellt sind. Unscharfe Zellen zeichnen sich sowohl durch geringen Kontrast als auch durch geringe Gradienten-rms-Werte im Hellfeldbild aus. Zusätzlich zum rms-Gradienten ist das Kontrastmerkmal erforderlich, um scharfe Zellen nach deren Markierung mit CNTs zu unterscheiden.

Abbildung 4. Dosisabhängige Aufnahme von CNTs, visualisiert mittels ImageStream. Die Anzahl und Fläche der schwarzen Flecken in den Hellfeldaufnahmen nimmt mit der Dosis an CNTs während der Inkubation mit Zellen zu (im Bereich von 0–50 µg/ml). Beachten Sie, dass die Kontrollzellen keine schwarzen Flecken aufweisen.

Abbildung 5. Relative Quantifizierung der CNT-Aufnahme basierend auf Hellfeldaufnahmen. Histogramme der mittleren Pixelmerkmale, angewendet auf die Maske „Objekt“, die die gesamte Zelle darstellt, zeigen eindeutig ein dosisabhängiges Verhalten, das für die Quantifizierung genutzt werden kann. Der R9-Bereich umfasst die CNT-positiven Zellen.

Abbildung 6. Erstellung von Masken zur Auswahl dunkler Stellen auf Hellfeld- und heller Stellen auf Dunkelfeldbildern. Da CNTs auf Hellfeldbildern als stark absorbierende dunkle Stellen erscheinen, wird eine Schwellwertmaske erstellt, um einen eingeschränkten Bereich von Pixeln mit geringer Intensität zwischen 0–533 auszuwählen, wie in dieser Studie beschrieben (Maske 1, Notation: Intensity(M01, BF, 0–533)). Umgekehrt wird eine Maske verwendet, die den Pixeln mit hoher Intensität (hier 150–4095) auf dem Dunkelfeldbild entspricht (Maske 2, Notation: Intensity(M06, DF, 150–4095)), um helle Stellen im Dunkelfeldbild auszuwählen, die Bereichen mit starker Streuung entsprechen.

Abbildung 7. Die dosisabhängige Aufnahme von CNTs wird durch die Quantifizierung der schwarzen Fleckenfläche auf BF-Bildern veranschaulicht. Mithilfe einer Schwellwertmaske (mask 1), die auf das BF-Bild angewendet wird, kann die Fläche der schwarzen Flecken für jede Zelle quantifiziert werden, was eine dosisabhängige Verteilung zeigt.

Abbildung 8. CNT-Quantifizierungsmethoden basierend auf HFK (Absorption) und DFK (Streuung) sind korreliert. Auf der linken Seite der durchschnittliche Pixel im Hellfeldbild gegenüber Intensität im DF-Bild, zeigen eine gute Korrelation für mit CNTs markierte Zellen (50 µg/ml) (Pearsonscher Korrelationskoeffizient r = -0.68). Rechts: Fläche der Maske, die den dunklen Stellen im Hellfeld entspricht gegenüber Fläche der Maskenanpassung heller Stellen im Dunkelfeld für mit CNTs markierte Zellen (50 µg/ml). Der Pearson-Korrelationskoeffizient beträgt r = -0,83. Dargestellt sind Werte von 7.000 Zellen.

Abbildung 9. Lokalisierung von CNTs in Zellen mithilfe spezifischer Masken. (A) Es werden Masken erstellt, die einer bestimmten Zellregion entsprechen, und zwar von links nach rechts – die gesamte Zelle, nur die Membran und das Zellinnere. Eine weitere Maske passt sich schwarzen Punkten an, basierend auf einer Schwellenintensität (Maske 1, Notation: Intensität(M01, BF, 0–533). (B) Die Beurteilung der CNT-Lokalisation erfolgt durch Messung der Fläche schwarzer Punkte an verschiedenen Zellbereichen unter Verwendung der in A beschriebenen Lokalisationsmasken. Die Inkubation mit CNTs (50 µg/ml) erfolgte sowohl bei 37 °C als auch bei 4 °C, um den Internalisierungsweg zu hemmen. Das Diagramm, das die schwarze Fläche an der Membran im Verhältnis zur schwarzen Fläche der gesamten Zelle darstellt, zeigt eine dosisabhängige Adsorption von CNTs an der Membran bei 4 °C, während die vollständige Internalisierung von CNTs bei 37 °C wirksam ist.

Abbildung 10. Kolokalisation der CNT-induzierten schwarzen Stellen im Hellfeld (BF) mit fluoreszierenden hellen Stellen im FITC-Bild. Die fluoreszierenden hellen Stellen liegen nicht immer räumlich überlappend mit den schwarzen Stellen im Hellfeld. Sie stimmen bei den ersten beiden dargestellten Zellen überein, jedoch nicht bei den letzten beiden Zellen.

Diskussion

1. Modifikation und Fehlerbehebung

In dieser Studie bestand das erste Ziel darin, die Menge und die Lokalisation von CNTs in Zellen zu bewerten. Die konfokale Mikroskopie könnte a priori die Goldmethode gewesen sein, um die intrazelluläre Verteilung von CNTs zu beurteilen, die mit dem Fluoreszenzmarker FITC^8,14 funktionalisiert wurden. Der größte Nachteil ist jedoch die Beschränkung auf die Einzelzellbildgebung und damit der Mangel an statistisch relevanten Daten. Der ImageStream ermöglicht es, über diese Hindernisse hinaus zu arbeiten: Durch das Screening einer großen Anzahl von Zellen (5.000-10.000) in kurzer Zeit (

Im Vergleich zur herkömmlichen Durchflusszytometrie besteht der einzigartige Vorteil von ImageStream darin, dass es multispektrale Bilder jeder Zelle liefert und die Signalintensität Pixel für Pixel vergleicht. Auf diese Weise kombiniert ImageStream die statistische Leistungsfähigkeit der Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie mit den analytischen Vorteilen der konfokalen Bildgebung für jede analysierte Zelle. Es ist entscheidend für eine markierungsfreie relative Quantifizierung und Lokalisierung von CNTs in Zellen.

2. Kritische Schritte innerhalb des Protokolls

Der kritische Schritt besteht in der Auswahl der Parameter, die für jede Studie am besten geeignet sind. In unserem Fall war es am besten, die Analyse auf die Absorptions- und Streueigenschaften der Nanoröhren zu stützen: Die gute Korrelation zwischen der Lokalisation von dunklen Flecken auf BF und hellen Flecken auf DF spricht dafür, dass die entwickelte Methode relevant und zuverlässig ist - und ohne Zellbildgebung möglicherweise nicht möglich gewesen wäre.

3. Einschränkungen der Technik

Es muss betont werden, dass die Visualisierung von CNTs in Zellen nur möglich war, weil sie dazu neigen, sich in endosomalen intrazellulären Vesikeln anzusammeln und dann als starke Absorptions- und Streuflecken zu erscheinen. Einzelne Nanoröhren sollten mit dieser Methode nicht nachgewiesen werden, während sie schließlich auf Fluoreszenz nachgewiesen werden könnten, was eine deutliche Einschränkung darstellt. Zweitens ist die Quantifizierung nicht "absolut", sondern relativ für verschiedene Markierungskonzentrationen und im Vergleich zu den unmarkierten Kontrollzellen. Einige quantitative Merkmale (mittlere Pixel, Intensität usw.) sind absolute Parameter, während andere von der Wahl der Masken abhängen (Schwellenmaske, Lokalisierungsmasken).

4. Bedeutung im Vergleich zu bestehenden Methoden

In Bezug auf die Fluoreszenz zeigt die ImageStream-Analyse die schlechte Kolokalisierung von CNT-Clustern zwischen dem hellen FITC-Signal und den Flecken auf den anderen Kanälen. Daher scheint es, dass die Fluoreszenz kein zuverlässiger Indikator für die Quantifizierung und Lokalisierung von CNTs war. Nichtsdestotrotz überwindet der multispektrale Hochdurchsatz-ImageStream die Einschränkungen der konventionellen Durchflusszytometrie, die hauptsächlich auf der Fluoreszenzquantifizierung basiert, und ebnet den Weg für eine statistische markierungsfreie Quantifizierung bei gleichzeitiger Lokalisierung von Kohlenstoffnanoröhren im Inneren der Zellen.

5. Zukünftige Anwendungen

Diese statistische Nanomessmethode mit hohem Durchsatz könnte auf alle Nanomaterialien verallgemeinert werden, die bei der Interaktion mit Zellen eine hohe Absorption und Streuung von Licht aufweisen. Daher könnte es wichtige Anwendungen für Untersuchungen der Nano-Bio-Grenzfläche, der Nanotoxikologie und der Nanomedizin haben.

Materialien

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