Cell Death mit Abnormal Mitose Assoziierte Beobachtet von konfokalen Imaging im Live Cancer Cells

Zusammenfassung

Die zytotoxische Aktivität der Phenanthridin PJ-34 in Krebszellen Mitose wurde in Echtzeit Live-konfokale Bildgebung dokumentiert. PJ-34 ausgerottet menschlichen Brustkrebszellen MDA-MB-231-Zellen, die extra Centrosomen in Mitose. Im Gegensatz zu normalen bifokalen Mitose wurden die extra Zentrosome in den beiden Spindelpole in Gegenwart von PJ-34 gruppiert.

Zusammenfassung

Phenanthrenderivate als potente Inhibitoren PARP1 verhinderte die bi-fokale Clustering überzähliger Centrosomen in multi-zentrosomale menschliche Krebszellen in der Mitose. Die Phenanthridin PJ-34 war die stärkste Molekül. Declustering der extra-Zentrosome verursacht mitotischen Versagen und Zelltod in multi-zentrosomale Zellen. Die meisten soliden menschlichen Krebserkrankungen eine hohe Auftreten von extra Zentrosome. Die Aktivität der PJ-34 wurde in Echtzeit durch konfokale Bildgebung von lebenden menschlichen Brustkrebszellen MDA-MB-231-Zellen mit Vektoren, die für fluoreszierende γ-Tubulin, die sehr häufig in den Centrosomen ist und für Leuchtstofflampen Histone H2B in transfiziert dokumentiert die Chromosomen. Aberrante Chromosom Anordnungen und de-Cluster γ-Tubulin Brennpunkte darstellt Declustered Zentrosome wurden in den transfizierten MDA-MB-231-Zellen nach der Behandlung mit PJ-34 erfasst. Un-Cluster extra Centrosomen in den beiden vorangegangen Spindelpole ihren Zelltod. Diese Ergebnisse verknüpft for das erste Mal, das kürzlich entdeckt exklusiven zytotoxische Aktivität von PJ-34 in menschlichen Krebszellen mit extra Zentrosome de-Clustering in der Mitose und mitotischen Ausfall zum Zelltod führen. Nach den bisherigen Erkenntnissen durch konfokale Bildgebung von fixierten Zellen, PJ-34 ausschließlich ausgerottet Krebszellen mit Multi-Zentrosome ohne Beeinträchtigung normalen Zellen Mitose mit zwei Centrosomen und bi-fokale Spindeln beobachtet. Dieser zytotoxische Aktivität von PJ-34 wurde nicht durch andere potente Inhibitoren PARP1 geteilt, und wurde in PARP1 defizienten MEF beherbergen extracentrosomes beobachtet, was seine Unabhängigkeit von PARP1 Hemmung. Live-konfokale Bildgebung bot ein nützliches Werkzeug für die Identifizierung neuer Moleküle beseitigen Zellen während der Mitose.

Einleitung

Phenanthrene abgeleitet PARP1 Hemmern, einschließlich PJ-34, wurden entwickelt, um ruhende Zellen von Apoptose durch die Energie verbrauchen PARP1 vermittelten DNA-Reparatur unter Stressbedingungen (Schlaganfall oder Myokardinfarkt) ¹ induziert schützen. Doch vor kurzem entdeckten wir, dass PJ-34, bei zweimal höhere Konzentration als die induzierende PARP1 Hemmung kann ausschließlich Zelltod verursachen in menschlichen Krebszellen ^2,3. Je schneller die Proliferation der Zelle war, desto effizienter ist die Tilgung der Zellen. Die zytotoxische Aktivität von PJ-34 wurde extra Zentrosome de-Clustering in Mitose ² zugeschrieben. Viele menschliche Krebszellen Hafen multicentrosomes ^4,5. Inkubation von menschlichen Brustkrebszellen MDA-MB-231, die überzähligen Centrosomen Hafen, mit 20 uM PJ-34 effizient beseitigt diese Zellen innerhalb 72-96 Stunden ohne Beeinträchtigung ruhenden Zellen oder einige gutartige proliferierende Zellen beherbergen zwei Centrosomen in der Mitose ^{2,3. Benigne Zellen enthalten humanen Mamma-Epithelzellen MCF-10, Humane Endothelzellen (HUVEC) und primäre mesenchymale Zellen aus menschlichen Thymus hergestellt. Diese Zellen waren resistent gegen die zytotoxische Aktivität der PJ-34. PJ-34 nicht mit ihren Zellzyklus stören während 96 h Inkubation oder auf ihre Centrosomen und bi-fokale Spindelbildung 2,3.}

Bipolar Zentrosoms Montage ist entscheidend für bipolare Spindel Bildung in der Mitose ^4,5. Daher wurden Zellen mit mehr als zwei Centrosomen eine kaum verstanden molekularen Mechanismus entwickelt, Clustering ihre zusätzliche Zentrosome an zwei Pole ^4-9. Ausfall der bipolaren Anordnung ihrer Zentrosome kann multipolare Spindeln und aberrante verzerrten Chromosomen Segregation, dass die Verhaftungen Zellzyklus in der G2 / M Verhaftung und zum Zelltod führt zu mitotischen Ausfall ^4,5 zugeschrieben. Die molekularen Mechanismen, die extra Zentrosome de-Clustering werden intensiv untersucht ^{10. Das Verständnis dieses Mechanismus Tod ermöglichen exklusive Beseitigung von Krebszellen unter Schonung gesunden Gewebes 5,10.}

So bieten Verbindungen, die mitotische Katastrophe Zelltod aktivieren einen neuen Modus eines selektiven Krebs-Therapie, die wirksam sein kann in einem breiten Spektrum von humanen soliden cancers.Our Ergebnisse legen nahe, dass konfokale Bildgebung verwendet werden, um Moleküle beeinflussen extra Zentrosome Clustering in identifizieren Mitose ^2,3, wodurch diese Verbindungen Krebs Targeting Wirkstoffkandidaten.

Wir haben die zytotoxische Aktivität der Phenanthridin PJ-34 durch Abtasten festen und lebenden menschlichen Krebszellen (mit hohem Auftreten der extra-Zentrosome in Mitose) gegenüber normalen Zellen dokumentiert. Eine Schritt-für Schritt-Beschreibung der bildgebenden Verfahren verwendet, um die zytotoxische Aktivität der PJ-34 in menschlichen Krebszellen zu identifizieren sind unten aufgeführt.

Protokoll

1. Cell Culture Vorbereitung

MDA-MB-231-Zellen wurden von ATCC (American Type Culture Collection) erworben und in flüssigem Stickstoff gelagert.

1. Seed 10 ⁶ MDA-MB-231 Zellen in 92 mm Durchmesser Petrischale in 10 ml Vollmedium mit Dulbeco Modified Eagle Medium (DMEM), 10% Pferdeserum, 1% L-Glutamin und 1%-Penstrep Amphotericin B. Zellen zulassen bis zu etwa 80-100% Konfluenz vermehren.
2. Entfernen Kulturmedium aus Schale und verwerfen.
3. Waschen der Zellschicht kurz mit 0,25% (w / v) Trypsin-EDTA-Lösung, um alle Spuren von Serum zu entfernen.
4. 2,0 ml Trypsin-EDTA-Lösung, austeilen und beobachten Zellen durch inverse Mikroskop bis Zellschicht verteilt ist (in der Regel innerhalb von 5 bis 15 min).
5. In 18 ml komplettem Wachstumsmedium und sanft saugen die Zellen mit einer Pipette. Transfer zu einem Rohr.
6. Zentrifuge die Zellsuspension bei 1.200 Umdrehungen pro Minute.
7. Re-suspend das Zellpellet in 24 ml culture Medium.
8. 2 ml Zellsuspension in 35 mm Petrischalen mit Glasboden (ca. 25% Konfluenz) und Platz im Inkubator (5% CO _2, 37 ° C).
9. Lösungen:
   1. Komplette Medium für Zellen Zellproliferation: DMEM mit 10% FBS, 1% Antibiotika (100 Einheiten / ml Penicillin G, 100 ug / ml Streptomycin, Pen-Strep-Ampho Lösung) und 2 mM L-Glutamin.
   2. Trypsin-EDTA-Lösung, die 0,25% Trypsin-EDTA.
10. Gerichte:
    92 mm Durchmesser Petrischalen.
    35 mm Durchmesser Poly-D-Lysin beschichteten Glasboden Kulturschalen.

2. Vorbereitung der Zellen für die Live-konfokale Imaging

1. Seed 2 x 10 ⁵ MDA-MB-231-Zellen in Glasbodenkulturschalen in 2 ml Vollmedium, wie in Kapitel 1 erwähnt. Wenn Zellkultur Zusammenfluss von 60-70% (ca. 3-4 x 10 ⁵ Zellen pro Schale) erreicht, mit Transfektion gehen.
2. Transfektion der Zellen mit zwei Plasmiden TonkanäleING die Fusionsproteine ​​γ-Tubulin-GFP (für Fluoreszenzdetektion Zentrosome) und Histone-RED (H2b-RED, für Fluoreszenzdetektion der Chromosomen) mit dem liposomalen Transfektionsreagenz Jet-PI nach der Herstellung Protokoll. Kurz gesagt, mischen 2 ug von jedem Plasmid in einem Rohr mit 100 ul NaCl (150 mM). Mischen Sie das Transfektionsreagenz (100 ul) mit 100 ul NaCl (150 mM) in einem zweiten Rohr, und Inkubation 5 min bei Raumtemperatur (RT). Dann kombinieren Sie die beiden Lösungen, Mix (mit milden Vortex) und Spin-down. Inkubieren für 30 min bei RT.
3. Während der Inkubation der Transfektionsgemisch, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und ersetzen Sie die Zell-Medium mit 2 ml warmem DMEM ohne Zusätze (37 ° C).
4. Sanft fügen Sie die Transfektion Mischung zu den Zellen in DMEM und dann wieder die Zellen in den Inkubator (37 ° C, 5% CO ₂₎ für 8 Stunden.
5. Nach 8 h Inkubation, ersetzen Sie das DMEM mit 2 ml Vollmedium und Inkubation der Zellen im Brutschrank für 24hr.
6. 24 Stunden nach der Transfektion, ersetzen Sie das Medium der Zellen mit 2 ml Vollmedium mit 20 uM PJ-34.
7. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 18 Stunden (37 ° C, 5% CO _2).
8. Betrifft die Zellen konfokale Bildgebung für mindestens 16 Stunden zu leben in der Bildgebung Kammer halten die Zellen bei 5% CO ₂ und 37 ° C.
9. Parallel dazu untersuchen Transfektion Wirksamkeit 36 ​​Stunden nach Transfektion unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie wie folgt:
   1. Seed 2 x 10 ⁵ MDA-MB-231-Zellen in 6-Well-Platte mit 1 Deckglas pro Vertiefung in 2 ml Vollmedium.
   2. Transfektion die Zellen wie in den Abschnitten 2.2-2.5 erwähnt.
   3. 36 Stunden nach Transfektion beheben die transfizierten Zellen auf einem Deckglas durch Inkubation montiert in kaltem Methanol: Aceton (1:1)-Lösung, 7 min, -20 ° C
   4. Saugen Sie die Fixierung Lösung und lassen das Deckglas mit den montierten Zellen in einer chemischen Haube trocknen.
   5. Bewerben ProLong Gold-antifade Reagenz mit DAPI und lassen the Deckglas im Dunkeln für 6 Stunden trocknen.
   6. Untersuchen Sie den Schieberegler unter dem Fluoreszenzmikroskop und berechnen den Anteil der transfizierten Zellen (rote und grüne Signale) von der gesamten Population von Zellen (DNA-Färbung durch DAPI). Die gewünschte Transfektion Prozentsatz etwa 20-40% bei 100-200 Zellen gezählt.

3. Technische Parameter der Live-konfokale Imaging Scanner-Einstellungen

1. ScanMode xyzt; Pinhole [luftig] 1,00; Zoom 3,5; Auflösung 8 Bit; Laser DPSS 561 nm; Argon, sichtbaren Laser 488 nm; Laser He / Ne 633 nm sichtbar; Ziel HCX PL APO CS 63X 1.40 OIL UV; Numerische Apertur 1,4; Scan-Geschwindigkeit 700 Hz; Brechungsindex 1,52.
2. Bild 3-D Präsentation wurden von Imaris Imaging-Software 7.0 vorbereitet.

4. Konfokalen Imaging der Mitose in fixierten Zellen

1. Seed 2 x 10 ⁵ MDA-MB-231 Brustkrebszellen (ATCC), normale embryonale Maus-Fibroblasten (MEF), oder PARP1 defizienten MEF (PARP ^{- / -,} hergestellt von Dr. Francoise Dantzer) auf Deckgläser in 6-Well-Platte in 2 ml Vollmedium. Die Deckgläser wurden mit 96% Ethanol gewaschen, gefolgt von Waschen mit sterilem DD Wasser gewaschen, 2 Stunden, und in jeder Vertiefung der 6-Well-Platte.
2. In PJ-34 (10-30 pM) auf das Medium und Inkubation der Zellen für den gewünschten Zeitraum (in der Regel bis zu 96 Stunden).
3. Waschen der Deckgläser einmal mit PBS (phosphate buffered saline), und fixieren die Zellen unter Verwendung von Inkubation in eiskaltem Methanol: Aceton (1:1)-Lösung, 7 min, 20 ° C
4. Saugen Sie die Fixierung Lösung und lassen Sie die Deckgläser in chemischen Haube trocknen lassen (in diesem Stadium können die Deckgläser in -20 ° C für mehrere Wochen aufbewahrt werden).
5. Waschen der Deckgläser einmal mit PBST (PBS mit 0,1% Tween-20 ergänzt), um die Zellmembranen durchlässig und blockieren die Zellen mit 10% NDS (Normale Eselserum) in PBST ("Blocking Solution") für 1 h bei RT.
6. Inkubation der permeabilisierten fixierten Zellen mit primären Antibodies für 2 Stunden bei RT (für Spindeln und Zentrosome Färbung). Anti-α Tubulin (1:250 Verdünnung) und anti-γ Tubulin (1:200 Verdünnung): Die Antikörper werden in der Blocking-Lösung wie folgen verdünnt. Primäre Antikörper wie folgt angewendet: Anwendung 100 ul (in einem Tropfen) einer Mischung der Antikörper in Blocking-Lösung für jedes Deckglas auf 6-Well-Platte Abdeckung (der Deckel auf dem Kopf steht). Sanft legte das Deckglas auf dem Antikörper Tropfen, mit Blick auf die ausgesäten Zellen Drop. Inkubieren Deckgläser zugewandten Antikörper für 2 Stunden bei Raumtemperatur.
7. Legen Sie die Deckgläschen wieder in den Brunnen und die Zellen 3-mal mit PBST. Dann nutzen Sie die gleiche Prozedur in 4.6 für die Markierung von Zellen auf den Deckgläsern mit den fluoreszierenden Sekundärantikörper beschrieben. Inkubieren der Zellen auf den Deckgläschen mit den sekundären Antikörpern für 1 Stunde, RT im Dunkeln. Die Antikörper werden in der Blocking-Lösung wie folgt verdünnt: und Alexa Fluor 568 (1:1000 Verdünnung Alexa Fluor 488 (grün 1:1000 Verdünnung);rot).
8. Montieren Sie die Deckgläser mit ProLong Gold-antifade Reagenz mit DAPI (für die Chromosomen-Färbung) und Inkubation über Nacht bei RT in Dunkelheit, um zu trocknen.
9. Untersuchen Sie die Deckgläser durch konfokale Mikroskopie.

5. Zellviabilitätsmessungen von ATP Produktion gemessen

ATP-Produktion wird durch eine leuchtende ATP Detektionsassay Kit gemessen.

1. Seed die Zellen in 96-Well-Platte etwa 20.000 Zellen in 800 ul Medium in jeder Vertiefung. Drei leere Vertiefungen sollten für die Bestimmung der Hintergrundlumineszenz des Mediums verwendet werden.
2. Bereiten ATP Standardverdünnungsreihen von etwa 10 um bis 100 um und halten auf dem Eis.
3. In 50 ul Reinigungsmittel in jede Vertiefung und schütteln Sie die Platte für 5 min in Schüttler, 700 min.
4. Den Inhalt jeder Flasche des "lyophilisierte Substrat 'mit 5 ml' Substratpuffers 'in dem Kit.
5. In 50 ul des rekonstituierten Substrat-Lösung in die Vertiefungen, und schüttelndie Platte für 5 min auf Schüttler, 700 min.
6. Halten Sie die Platte in Dunkelheit für 10 min.
7. Messen Lumineszenz von jeder Vertiefung durch ELISA Mikroplatten-Reader.

Ergebnisse

PJ-34 ist eine stabile wasserlösliche Phenanthridin ¹ (Abbildung 1). Unsere bisherigen Ergebnisse zeigen, Zelltod und extra Centrosomen in verschiedene Arten von festen Multi-zentrosomale Krebszellen, die mit PJ-34 behandelt wurden, de-Cluster. Im Gegensatz dazu wurden normalen proliferierenden Zellen nicht beeinträchtigt ^2,3. Zentrosomen wurden durch doppelte Markierung mit Antikörpern gegen centrine1 und γ-Tubulin in den festen extra zentrosomale Zellen ² gerichtet ide...

Diskussion

Live-konfokale Bildgebung bot eine Echtzeit-Dokumentation der zytotoxischen Wirkung der PJ-34 im Live-Multi-zentrosomale Zellen während der Mitose (Abbildung 3 und ergänzende Informationen). Dies war die erste Live-Dokumentation zuschreibt die Zytotoxizität von PJ-34 in menschlichen Krebszellen, um zusätzliche Zentrosome de-Clustering und Zelltod, was darauf hindeutet, Induktion von Mitotic Catastrophe Zelltod durch PJ-34 ^5-9. Im Gegensatz dazu wurde bi-fokale Clustering von super-Numerarier ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
REAGENZIEN
DMEM	Invitrogen (GIBCO)	41965
FBS (Fötales Rinderserum)	Invitrogen (GIBCO)	12657
Pen-Strep-Ampho-Lösung	Biological Industries, Israel	03-033-1B
L-Glutamin	Invitrogen (GIBCO)	25030-024
0,25% Tripsin-EDTA	Invitrogen (GIBCO)	25200
92 mm Petrischalen	Nunc,Thermo scientific	150350
35 mm Poly-D-Lysin-beschichtete Glasbodenkulturschalen	MatTek Corporation, USA	P35GC-0-14-C
Lumineszierendes ATP-Nachweis-Assay-Kit	Abcam	ab113849
NDS (Normales Eselserum)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Anti-α-Tubulin-Antikörper	Sigma	T9026	1:250 Verdünnung (IF)
Anti-γ-Tubulin-Antikörper	Sigma	T5192	1:200 Verdünnung (IF)
Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus IgG	Invitrogen	A-11017	1:1.000 Verdünnung (IF)
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Kaninchen IgG	Invitrogen	A-10042	1:1.000 Verdünnung (IF)
ProLong Gold Antifading-Reagenz mit DAPI (einsteigend)	Invitrogen	P36935
JetPEI (liposomales Transfektionsreagenz)	Polyplus	101-10
EQUIPMENT
Konfokalmikroskop	Leica (Mannheim, Deutschland)	TCS SP5II