Method Article

Gleichzeitig Capturing in Echtzeit Bilder in zwei Emissions Kanäle unter Verwendung eines Dual-Kamera-Emissions-Splitting-System: Anwendungen in der Zelladhäsion

DOI:

10.3791/50604

⸱

September 4th, 2013

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1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Russ College of Engineering and Technology, Ohio University, 2Biomedical Engineering Program, Ohio University

In This Article

Summary

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Dual-Kamera-Emissionsspaltanlagen für zwei-Farben-Fluoreszenz-Mikroskopie erzeugen Echtzeit-Bildsequenzen mit außergewöhnlichen optischen und zeitlichen Auflösung, einem Bedarf von lebenden Zellassays einschließlich Parallelplattenlaufkammer Adhäsions-Assays. Als Software wird verwendet, um Bilder von gleichzeitig erworben Emissionskanäle verschmelzen, pseudocolored Bildsequenzen produziert.

Abstract

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Multi-Color-Immunfluoreszenz-Mikroskopie, um bestimmte Moleküle in der Zellmembran erkennen kann, mit Parallelplattenlaufkammer Assays zu Mechanismen, die Zell-Adhäsion unter dynamischen Strömungsbedingungen zu untersuchen gekoppelt werden. Beispielsweise können Krebszellen mit mehreren Fluorophoren über eine möglicherweise reaktive Substrat zu modellieren Mechanismen der Krebsmetastasierung perfundiert werden. Allerdings, Multi-Channel einzelnen Kamera-Systeme und Farbkameras zeigen Mängel in der Bildaufnahme für die Echtzeit-Live-Zellanalyse. Um diese Einschränkungen zu überwinden, eine Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem verwendeten wir gleichzeitig erfassen Echtzeit-Bildsequenzen von fluoreszenzmarkierten Zellen in der Flusskammer. Dual-Kamera-Systeme Emissionsspaltfilter definierten Wellenlängenbereichen in zwei monochrome CCD-Kameras, wodurch gleichzeitig erfassen zwei räumlich identisch, aber Fluorophor-spezifische Bilder. Anschließend werden psuedocolored Ein-Kanal-Bilder in einer einzigen kombiniertenEchtzeit-Sequenz zusammengeführt, die mehrere Zielmoleküle auf Zellen, die sich schnell über einen Bereich von Interesse offenbaren kann.

Introduction

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Verfahren zur Analyse von Molekülen auf der Zelloberfläche, wie z. B. Immunfärbung Sonden einzusetzen, die chemisch mit Fluorophoren konjugiert sind, was den Nachweis von Zielmolekülen. Live-Cell-Imaging-und hydrodynamischen Fluss-basierte Zelladhäsionsassays werden typischerweise mit monochromen CCD-Kameras entwickelt, um physiologische Prozesse auf zellulärer und / oder molekularer Ebene 1, 2 erfassen aufgezeichnet. Diese Kameras sind sehr empfindlich, liefern schnelle Bildraten (mehr als 30 Bilder pro Sekunde) und bieten außergewöhnliche zeitliche Auflösung (durch schnelle Bildraten und kurzen Belichtungszeiten). Allerdings kann nur Monochrom-Kameras er....

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Protocol

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1. Software-Installation

  1. Kaufen StreamPix 5 Multi-Kamera-Software mit SimulPix Modul oder andere Imaging-Software in der Lage, das Sammeln und Kombinieren von Bildern durch monochrome CCD-Kameras eingefangen.
  2. Mindestanforderungen für StreamPix 5 sind: Ein PC mit Core 2 Duo ausgestattet mit 2,4 GHz oder besser mit 2 GB RAM oder höher. Ein unterstützter IEEE digitale oder analoge Kamera und kompatible Framegrabber. Windows-XP/7/Vista 32 oder 64 Bit. Ein Monitor mit Auflösung 1024 x 768 oder höher. Eine Grafikkarte mit guter 2D-Leistung (OCU auszudrücken 16x oder besser wird empfohlen) und 7200-RPM-Festplattenlaufwerk für die Aufzeichnung mit RAID-O....

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Results

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Eine Parallelplattenlaufkammer Haftung Assay wurde verwendet, um eine Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem, die gleichzeitig in zwei Emissionskanäle erfasst Echtzeit-Bildsequenzen (Abbildung 1) zu demonstrieren. Die Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem erkannt BT-20-Zellen, die mit Fluoreszenz-Anti-Human-CD24 und HECA-452 (Erkennung sialofucosylated Antigene) monoklonale Antikörper und entsprechenden Sekundärantikörper (Abbildung 2) markiert waren. Einige Roll Zellen angezeigt rote Signale (CD2.......

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Discussion

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Die Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem hat die räumliche, zeitliche und optische Auflösung benötigt, um qualitativ hochwertige Bilder in Anwendungen, bei denen Zell-oder Molekularbewegung schnell ist zu erfassen. Bei der Erzeugung der repräsentative Ergebnisse, Parameter in der Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem, einschließlich Software-Einstellungen und Kameraeinstellungen wurden optimiert, um eine zusammengeführte Bildfolge, in der Walz-und adhärenten Zellen waren zeitlich und räumlich ausgerichtet zu erhalten. Diese Opti.......

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Disclosures

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgements

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Die Autoren danken Dr. Douglas Goetz (Institut für Chemische und Biomolekulare Ingenieurwissenschaften, Ohio University) und Dr. Fabian Benencia (Department of Biomedical Sciences, Ohio University) für aufschlussreiche Diskussionen und Kritik Manuskript danken. Wir danken auch Dr. Christopher Huppenbauer für hilfreiche technische Diskussionen (W. Nuhsbaum Inc.). Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der National Science Foundation (CBET-1106118) und der National Institutes of Health (1R15CA161830-01) unterstützt.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagenz/Material
BT-20 ZellenATCCHTB-19
CHO-E ZellenGeschenk von Dr. R. Sackstein (Brigham and Women' s Hospital, Harvard Medical School)
MEM Thermo ScientificSH30024.01
FBSThermo ScientificSH30396.03
Penicillin-StreptomycinThermoScientific SV30010
0.25% Trypsin / 0.1% EDTAThermo ScientificSV30031.01
DPBSThermo ScientificSH30028.02
DPBS+Life Technologies14080-055
BSASigmaA9647
HECA-452 monoklonaler AntikörperBD Biosciences555946
monoklonaler Anti-Human-CD24-AntikörperBD Biosciences555426
Anti-Ratten-IgM AlexaFluor 488InvitrogenA21212
Anti-Maus-IgG AlexaFluor 568InvitrogenA11004<
Equipment
EXi Blaue Fluoreszenzmikroskopie Digitale CCD-KameraQ ImagingEXI-BLU-R-F-M-14-C
Retiga EXi FAST 1394 Digitale CCD-KameraQ ImagingRET-EXi-F-M-12-C
DC2 EmissionssplitterPhotometrieDC2
Inverses FluoreszenzmikroskopLeicaDMI6000 B
Streampix 5 SoftwareNorpix
td colspan="4">[header]

References

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  1. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009(2009).
  2. Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligan....

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Dual Camera Emission SplittingParallel Plate Flow ChamberReal time Image AcquisitionCell Adhesion AssayFluorescence MicroscopyCamera Alignment ProcedureMonochrome CCD CamerasFluorescent Cell LabelingFlow Chamber SetupDigital Image Correction

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