Quantitative und zeitliche Steuerung der Sauerstoff-Mikromilieu in der Einzel-Islet Niveau

Summary

Die mikrofluidische Sauerstoffregelung bietet mehr als nur Komfort und Geschwindigkeit gegenüber hypoxischen Kammern für biologische Experimente. Insbesondere wenn er durch Diffusion durch eine Membran implementiert wird, kann mikrofluidischer Sauerstoff gleichzeitige Modulationen der Flüssig- und Gasphase auf der Mikroskala ermöglichen. Diese Technik ermöglicht dynamische, multiparametrische Experimente, die für die Untersuchung der Pathophysiologie der Inselzellen entscheidend sind.

Abstract

Gleichzeitige Sauerstoffversorgung und Überwachung der Glucosestimulus-Sekretion Kopplungsfaktoren in einer einzigen Technik ist entscheidend für die Modellierung von pathophysiologischen Zuständen von Insel Hypoxie, vor allem in der Transplantations-Umgebungen. Standard-hypoxischen Kammer Techniken können nicht beide Reize modulieren gleichzeitig noch eine Echtzeit-Überwachung des Glucosestimulus-Sekretion Kopplungsfaktoren. Um diese Schwierigkeiten zu begegnen, haben wir mit einer mehrschichtigen Mikrofluidtechnik, sowohl wässrige und Gasphasenmodulationen über eine Diffusionsmembran integrieren. Dies erzeugt einen Stimulations Sandwich um die mikroskalierte Inseln innerhalb des transparenten Polydimethylsiloxan (PDMS)-Vorrichtung, um so die Überwachung der genannten Kopplungsfaktoren über Fluoreszenzmikroskopie. Zusätzlich wird die Gaszufuhr durch ein Paar von Mikrodispenser gesteuert wird, eine quantitative, Unter Minute Modulationen von Sauerstoff zwischen 0-21%. Diese intermittierende Hypoxie wird angewendet, um ein neues Phänomen der Insel zu untersuchent Präkonditionierung. Außerdem mit multimodalen Mikroskopie bewaffnet, waren wir in der Lage, auf detaillierte Kalzium und K _ATP-Kanal Dynamik in diesen hypoxischen Ereignissen zu suchen. Wir haben die Vision mikrofluidischen Hypoxie, vor allem diese simultane Dualphasen Technik, die als ein wertvolles Instrument bei der Untersuchung Inseln sowie viele Ex-vivo-Gewebe.

Introduction

Dynamische Hypoxie ist wichtig in der Biologie, speziell für Inseltransplantate

Dynamische Hypoxie ist ein wichtiger physiologischer sowie pathophysiologischer Parameter in vielen biologischen Geweben. Die Veränderung des Sauerstoffs zum Beispiel ist ein starkes Entwicklungssignal bei der Angiogenese. Darüber hinaus modulieren räumliche und zeitliche Muster bei Hypoxie HIF1-alpha und spielen eine Rolle bei Erkrankungen wie Bauchspeicheldrüsenkrebs. Hypoxie ist auch ein Störfaktor, der die Ergebnisse von Inseltransplantationen beeinflusst. In jüngster Zeit haben zeitlich oszillierende Oszillationen der Hypoxie oder intermittierende Hypoxie (IH)....

Protocol

1. Vorbereiten der Mausinseln

1. Desezieren Sie C57BL/6-Mäuse und isolieren Sie Inselzellen durch Kollagenaseverdau und Ficoll-Dichtegradiententrennung. (Siehe die in^2,3 genannten JOVÈ-Artikel).
2. Inkubieren Sie Inselzellen in RPMI-1640-Medium, das 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 20 mM HEPES enthält, in Petrischalen (37 °C, 5 % CO₂). Nach der Isolierung werden die Inselzellen 24 Stunden lang kultiviert, bevor sie in Experimenten verwendet werden. Verwenden Sie die Inseln innerhalb von 1-2 Tagen, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.

2. Erstellen der mikrofluidischen Plattform

....

Results

Zentral für diese Insel-Hypoxie-Technik ist die Fähigkeit, die Stimulation der wässrigen und gasförmigen Phase in derselben mikrofluidischen Kammer mit Transienten auf der winzigen Skala zu modulieren. Abbildung 1 ist ein repräsentatives Ergebnis der a) dualen Stimulationen und b) der schnellen Modulationen, die innerhalb der Inselkammer gemessen wurden. Die wässrige Modulation, die durch Einbringen von Fluorescein in die Kammer gezeigt wird, erreicht das Gleichgewicht in drei bis vier Minuten nach dem M.......

Discussion

Die verschiedenen Modalitäten, die in dieser Inselhypoxie-Technik integriert sind, stellen hier mehrere Punkte zur Fehlerbehebung dar. Zunächst werden die isolierten Inseln in Kultur durch Verdauungsenzyme aus Azinuszellen weiter abgebaut und zerfallen. Die Standardisierung von Experimenten auf 1-2 Tage nach der Isolierung der Inselzellen ist daher entscheidend, um konsistente Ergebnisse zu erhalten. Zweitens wurde die wässrige Strömung während der Hypoxie und der intermittierenden Hypoxie gestoppt, um eine konvektive Cl.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagenz/Material
Spinner	Laurell	WS-400
SU8 MicroChem		SU8-2150/SU8-2100
Digital Hotplate	PMC Dataplate	722A
UV-Härtungslampe	OmniCure	S1000
PMDS	Dow Chemical	Sylgard 184
Corona Wand	ETP	BD-20AC
Vakuumkammer	Bel-Art	420220000
Mikrodispenser	The Lee Company	IKTX0322000A
5 V und 20 V DC Power	Radio Shack
NI USB	National Instrument	NI USB-6501
Thermometer	Omega Engineering, Inc.
Schlauchpumpe	Gilson	Minipulse 2
Sauerstoffsensor	Ocean Optics	NeoFox
Fraktionssammler	Gilson	203
Pippette	Fisher Scientific	Finnpipette II 100μ l
Inverses Epifluoreszenzmikroskop	Leica	DMI 4000B
50 ml Konische Röhrchen	Fisher Scientific
Fura-2 Fluoreszenzfarbstoff-Molekularsonden	, Life Technologies
Rhodamin 123 Fluoreszenzfarbstoff-Molekularsonden	, Life Technologies
Nährmedien	Sigma-Aldrich	RPMI-1640
HEPES	Sigma-Aldrich
Glukose	Sigma-Aldrich
Rinderserum Albumin	Sigma-Aldrich
30 Zoll Silikonschläuche	Cole-Parmer		1/16 Zoll x 1/8 Zoll
1,5 ml Eppendorf Röhrchen	Fisher Scientific
Y-Anschlüsse	Cole-Parmer		1/16 Zoll und 4 mm
Spritzenverbinder	Cole-Parmer		Luer-Buchse 1/16 Zoll
Gerade Verbinder	Cole-Parmer		1/16 Zoll
Winkelverbinder	Cole-Parmer		1/16 Zoll