Quantitative und zeitliche Steuerung der Sauerstoff-Mikromilieu in der Einzel-Islet Niveau

Summary

Die mikrofluidische Sauerstoffregelung bietet mehr als nur Komfort und Geschwindigkeit gegenüber hypoxischen Kammern für biologische Experimente. Insbesondere wenn er durch Diffusion durch eine Membran implementiert wird, kann mikrofluidischer Sauerstoff gleichzeitige Modulationen der Flüssig- und Gasphase auf der Mikroskala ermöglichen. Diese Technik ermöglicht dynamische, multiparametrische Experimente, die für die Untersuchung der Pathophysiologie der Inselzellen entscheidend sind.

Abstract

Gleichzeitige Sauerstoffversorgung und Überwachung der Glucosestimulus-Sekretion Kopplungsfaktoren in einer einzigen Technik ist entscheidend für die Modellierung von pathophysiologischen Zuständen von Insel Hypoxie, vor allem in der Transplantations-Umgebungen. Standard-hypoxischen Kammer Techniken können nicht beide Reize modulieren gleichzeitig noch eine Echtzeit-Überwachung des Glucosestimulus-Sekretion Kopplungsfaktoren. Um diese Schwierigkeiten zu begegnen, haben wir mit einer mehrschichtigen Mikrofluidtechnik, sowohl wässrige und Gasphasenmodulationen über eine Diffusionsmembran integrieren. Dies erzeugt einen Stimulations Sandwich um die mikroskalierte Inseln innerhalb des transparenten Polydimethylsiloxan (PDMS)-Vorrichtung, um so die Überwachung der genannten Kopplungsfaktoren über Fluoreszenzmikroskopie. Zusätzlich wird die Gaszufuhr durch ein Paar von Mikrodispenser gesteuert wird, eine quantitative, Unter Minute Modulationen von Sauerstoff zwischen 0-21%. Diese intermittierende Hypoxie wird angewendet, um ein neues Phänomen der Insel zu untersuchent Präkonditionierung. Außerdem mit multimodalen Mikroskopie bewaffnet, waren wir in der Lage, auf detaillierte Kalzium und K _ATP-Kanal Dynamik in diesen hypoxischen Ereignissen zu suchen. Wir haben die Vision mikrofluidischen Hypoxie, vor allem diese simultane Dualphasen Technik, die als ein wertvolles Instrument bei der Untersuchung Inseln sowie viele Ex-vivo-Gewebe.

Introduction

Dynamische Hypoxie ist wichtig in der Biologie, speziell für Inseltransplantate

Dynamische Hypoxie ist ein wichtiger physiologischer sowie pathophysiologischer Parameter in vielen biologischen Geweben. Die Veränderung des Sauerstoffs zum Beispiel ist ein starkes Entwicklungssignal bei der Angiogenese. Darüber hinaus modulieren räumliche und zeitliche Muster bei Hypoxie HIF1-alpha und spielen eine Rolle bei Erkrankungen wie Bauchspeicheldrüsenkrebs. Hypoxie ist auch ein Störfaktor, der die Ergebnisse von Inseltransplantationen beeinflusst. In jüngster Zeit haben zeitlich oszillierende Oszillationen der Hypoxie oder intermittierende Hypoxie (IH) Vorteile bei der "Präkonditionierung" von Inselzellen^{gezeigt 1}. Sowohl die statischen als auch die transienten Hypoxieeffekte auf die Physiologie der Inselzellen sind jedoch noch nicht gut verstanden oder untersucht, was vor allem auf den Mangel an geeigneten Werkzeugen zur Kontrolle der Mikroumgebung der Inselzellen

zurückzuführen ist.

Inselchen sind in vivo gut vaskularisiert

Pankreasinseln sind 50-400 μm große kugelförmige Aggregate endokriner Zellen, einschließlich Beta-Zellen und Alpha-Zellen, die für die Glukosehomöostase verantwortlich sind. Wenn Inselzellen stimulierender Glukose im Blut ausgesetzt sind, führen Aufnahme und Glykolyse zur ATP-Produktion, die ATP-empfindliche Kaliumkanäle (K_ATP) öffnet und zu einem Kalziumeinstrom führt, der die Exozytose von Insulingranula auslöst. Sauerstoff ist wichtig, um diesen stark metabolischen Prozess anzutreiben, und die Insulinsekretion wird neben den Glukosegradienten auch maßgeblich von der Dynamik des Blutflusses und der Sauerstoffversorgung beeinflusst. Inselzellen führen diese Glukose-Insulin-Reaktion in vivo leicht durch, da sie in der Bauchspeicheldrüse stark durchblutet sind, jede innerhalb einer Zelllänge von einem Kapillargefäß entfernt. Das dichte Netzwerk der Intraislet-Kapillaren wird jedoch während der Inselisolierung durch Kollagenase entfernt^2,3. Folglich sind sowohl die Sauerstoff- als auch die Nährstoffversorgung aufgrund von Diffusionsbeschränkungen auf einen Umfang von 100 μm beschränkt.

Aktuelle Techniken haben nur begrenzten Erfolg bei der Nachbildung der Mikroumgebung der Inselzellen

Die Nachbildung der nativen Sauerstoff- und Glukosedynamik der Insel, die für die Modellierung physiologischer und pathophysiologischer Bedingungen von entscheidender Bedeutung ist, ist mit standardmäßigen hypoxischen Kammern, die eine aufwendige Strömung erfordern und die kontinuierliche Überwachung der Inselfunktionen fehlen, schwer zu erreichen. Darüber hinaus setzen Transplantationstherapien für Typ-I-Diabetes isolierte Inselzellen einer Hypoxie im hepatischen Pfortadersystem⁴ aus, das im Vergleich zur physiologischen Bauchspeicheldrüse (5,6 %, 40 mmHg) einen viel niedrigeren pO₂ (<2%, 5-15 mmHg) aufweist. Nach der Transplantation dauert es zwei Wochen oder länger, bis die Inseltransplantate revaskularisiert werden. Es wurde gezeigt, dass hypoxische Exposition den Glukose-Insulin-Kopplungsmechanismus der Inselzellen beeinträchtigt. Unter den Stimulus-Sekretions-Kopplungsfaktoren können die Kalziumsignalgebung, die mitochondrialen Potentiale und die Insulinkinetik mit Hilfe der Mikrofluidik leicht überwacht werden. Unsere bisherige mikrofluidische Technik demonstrierte diese Echtzeitüberwachung mit präziser Modulation der wässrigen Mikroumgebung um die einzelne Insel^5,6. Die Quantifizierung der hypoxischen Beeinträchtigung der Inselzellen wird jedoch durch das Fehlen gleichzeitiger Stimulations- und Überwachungstechniken behindert. Daher kann die Kombination von mikrofluidischer Kontrolle von Sauerstoff und Inselüberwachung die Hypoxie-Studien der Inselzellen verbessern.

Mikrofluidik kann die wässrige und sauerstoffhaltige Mikroumgebung nachbilden und modulieren

Die Standardtechnik für Gewebe- und Kultur-Hypoxie-Studien basiert auf hypoxischen Kammern. Im Allgemeinen liefern die hypoxischen Kammern einzelne Sauerstoffkonzentrationen mit Äquilibrierungszeiten von ~10-30 min, was mit einer minutenskalierten dynamischen Hypoxie unvereinbar ist. In zwei neueren Studien wurden kleine benutzerdefinierte Kammern für die intermittierende Hypoxie-Exposition an ganzen Mäusen verwendet, mit widersprüchlichen Ergebnissen zur Glukose-induzierten Insulinreaktion^7,8. Beachten Sie, dass auf der Ebene des gesamten Tieres der eingeatmete Sauerstoff aufgrund von Kontrollen im Atmungssystem nicht direkt in die Inselkapillaren pO₂ übersetzt wird. Darüber hinaus verfügen diese Studien weder über standardisierte Sauerstoffgehalte noch liefern sie Echtzeitmessungen auf Gewebeebene von Inselzellen.

Auf der anderen Seite kann die Sauerstoff-Mikrofluidik diese Einschränkungen überwinden, indem sie Sauerstoff über Gaskanalnetzwerke steuert. Darüber hinaus ist die Mikrofluidik mit der Live-Bildgebung während der Sauerstoffmodulation kompatibel, eine Leistung, die derzeit mit standardmäßigen hypoxischen Kammern nicht möglich ist. Eine Reihe dieser neuartigen mikrofluidischen Ansätze nutzt die Gasdurchlässigkeit von Polydimethylsiloxan, um Sauerstoffkonzentrationen in Mikrokanälen aufzulösen, die Medien über die Zielzellen^9-14 strömen. Diese Bausteine haben auch mehrere diskrete Sauerstoffkonzentrationen, fluoreszenzbasierte Sauerstoffsensoren und sogar chemische Sauerstofferzeugung auf dem Chip integriert.

Auf flüssiger Solvatation basierende Mikrofluidik hat es schwer, stabile, kontinuierliche Gradienten aufrechtzuerhalten, da sie auf konvektives Mischen angewiesen ist, das empfindlich auf Strömungsbedingungen reagiert. Im Vergleich dazu konzentriert sich die Technik, die wir hier verwenden, darauf, den Diffusionsweg der Sauerstoffzufuhr zu verringern. Die Gassolvatation und die Scherströmung werden eliminiert, indem Sauerstoff direkt über eine Membran diffundiert wird, die mit Zellen oder Inselgewebe besiedelt ist. Dadurch entfällt die zusätzliche Mikrofluidik, die zur Kontrolle der Solvatation erforderlich ist, und es werden unnötige Scherspannungen auf den Inseln vermieden, die selbst die Insulinfreisetzung auslösen können. Diese Plattform wurde verwendet, um die Hochregulierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) sowohl bei hyperoxischen als auch bei hypoxischen Extremen (2-97% O₂) in Zellkulturen zu demonstrieren^1,15. Aufgrund der direkten Abgabe von Sauerstoff und der Entfernung von Scherströmungen bietet unsere diffusionsbasierte Plattform die optimale mikrofluidische Lösung für die Untersuchung von Inselhypoxie.

Multimodale Stimulation und Überwachung

Diffusionsbasierte Mikrofluidik bringt auch zusätzliche Vorteile, wenn sie für das Studium der Mikrophysiologie von Inselzellen geeignet ist. Durch die Verwendung einer Membran als Diffusionsbarriere kann die Flüssigkeit von den Sauerstoffmodulationen isoliert werden, was eine Steuerung der wässrigen Glukosestimulation unabhängig von hypoxischen Stimulationen ermöglicht. Dadurch entsteht eine sandwichartige simultane Stimulation, die die Abgabe an die Inseln räumlich lokalisiert. Da das Gas über computergesteuerte Mikroinjektoren zeitlich moduliert wird, können wir außerdem die Sauerstoffkonzentration von 21-0% digital modulieren, wobei die Transientenzeit weniger als 60 Sekunden beträgt. Die dynamische Steuerung der Sauerstoff- und Glukosemikroumgebung am Mikroskop ermöglicht ein multimodales Echtzeitprotokoll, das mit Standard-hypoxischen Kammern nicht möglich oder außerordentlich umständlich wäre. Mit diesem Gerät wurden die Kalziumsignalgebung (Fura-AM), die mitochondrialen Potentiale (Rhodamin 123) und die Insulinkinetik (ELISA) überwacht, um ein vollständiges Bild der dynamischen Glukose-Insulin-Reaktion unter Hypoxie zu erhalten.

Protocol

1. Vorbereiten der Mausinseln

1. Desezieren Sie C57BL/6-Mäuse und isolieren Sie Inselzellen durch Kollagenaseverdau und Ficoll-Dichtegradiententrennung. (Siehe die in^2,3 genannten JOVÈ-Artikel).
2. Inkubieren Sie Inselzellen in RPMI-1640-Medium, das 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 20 mM HEPES enthält, in Petrischalen (37 °C, 5 % CO₂). Nach der Isolierung werden die Inselzellen 24 Stunden lang kultiviert, bevor sie in Experimenten verwendet werden. Verwenden Sie die Inseln innerhalb von 1-2 Tagen, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.

2. Erstellen der mikrofluidischen Plattform

1. Generieren Sie die Mikrostrukturgeometrien auf Transparenz-Fotomasken für jede Geräteschicht: 1) Einlass und Auslass, 2) Glukose-Mikrofluidikschicht mit Perifusionskammer (8 mm Durchmesser x 3 mm, 150 μl), 3) 200 μm Membran mit Mikrowells (500 μm Durchmesser, 100 μm Tiefe) und 4) Gasmikrofluidikschichten.
2. Zur Herstellung der Einlass- und Auslassschicht entgastes, vorgemischtes PDMS bis zu einer Höhe von 1,5 mm in eine leere Petrischale gießen und 2 Stunden lang bei 80 °C aushärten. Stanzen Sie die Ein-/Ausgänge mit einem Durchmesser von 2 mm.
3. Um die mikrofluidische Glukoseschicht herzustellen, drehen Sie zwei 350-μm-Schichten aus SU8-2150 zu einer einzigen 700-μm-Schicht auf einem 4-Zoll-Siliziumwafer.
   1. Belichten Sie UV-Licht durch die entsprechende Fotomaske, um das Mikrokanalmuster nach der Entwicklung auf den SU8 zu übertragen, wodurch ein 700 μm hoher Master entsteht.
   2. Gießen Sie entgastes, vorgemischtes PDMS auf eine Höhe von 3 mm und härten Sie es bei 80 °C für 2 Std. Schneiden Sie dieses PDMS mit einer Rasierklinge in Form.
   3. Stanzen Sie die Ein-/Ausgangsanschlüsse mit einem Durchmesser von 2 mm sowie die Kammer mit einem Durchmesser von 8 mm.
4. Um die 200-μm-Membran mit Mikrowells herzustellen, drehen Sie SU8-2100 auf 100 μm. Wenden Sie die gleiche UV-Lithographie an, um Mikrotitermuster auf diesen 100 μm hohen Master zu übertragen.
   1. Schleudern Sie entgastes, vorgemischtes PDMS bei 900 U/min für 30 Sekunden auf diesen Master und härten Sie 10 Minuten lang bei 80 °C aus. Schleudern Sie unter den gleichen Bedingungen eine zweite Schicht auf die erste, wodurch eine 200 μm PDMS-Membran mit Mikrotitermustern entsteht.
   2. Stanzen Sie Ein-/Ausgangsanschlüsse mit einem Durchmesser von 2 mm durch diese Membran
5. Um die gasmikrofluidische Schicht herzustellen, drehen Sie SU8-2100 auf 100 μm. Wenden Sie die gleiche UV-Lithographie an, um gasmikrofluidische Muster auf diesen 100 μm hohen Master zu übertragen.
   1. Gießen Sie entgastes, vorgemischtes PDMS auf eine Höhe von 1,5 mm und härten Sie es bei 80 °C für 2 Std. Schneiden Sie das PDMS mit einer Rasierklinge in Form.
   2. Stanzen Sie Ein-/Ausgangsanschlüsse mit einem Durchmesser von 2 mm durch diese Schicht
6. Um die mehreren Schichten zu verbinden, bereiten Sie sie vor, indem Sie sie mit Klebeband reinigen, dem Koronalichtbogen aussetzen und dann von Hand in der folgenden Reihenfolge ausrichten.
   1. Kleben Sie die Membran mit den Mikrowells nach oben mit der unteren Gasschicht zusammen.
   2. Kleben Sie die Glukose-Mikrofluidik auf die Mikrotitermembran.
   3. Verkleben Sie die Ein- und Auslassschicht ganz oben und kapseln Sie die gesamte Baugruppe.
   4. Verstärken Sie die Verklebung, indem Sie 1 kg Gewicht darauf geben und 3 Stunden lang bei 100 °C backen.
7. Führen Sie einen Dichtheitstest des fertigen Geräts durch, indem Sie Wasser in die wässrige Schicht laden und dann das gesamte Gerät unter Wasser tauchen. Lassen Sie dann mit einer leeren Spritze Luft durch die Gasschicht strömen.
8. Sterilisieren Sie auslaufsichere Geräte mit 70 % Ethanol durch die wässrige Schicht und spülen Sie sie dann mit PBS-Puffer, in dem das Gerät bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert wird.

3. Aufbau des Mikrodispensers

1. Besorgen Sie sich 2 Mikrodispenser, 5-V- und 20-V-Gleichstromnetzteile und eine digitale I/O-Platine, um das Setup für die Sauerstoffmischung und -abgabe zu konstruieren.
   1. Verbinden Sie die Steuerleitungen der Mikrodispenser mit den mitgelieferten Treibereinheiten.
   2. Schließen Sie die Treiber an die digitale I/O-Karte an Anschlüssen an, die den Labview-Steuerungen entsprechen.
   3. Verbinden Sie die 5-V- und 20-V-Netzteile mit entsprechenden Kontakten an den Antrieben.
   4. Schließen Sie die digitale I/O an einen Laptop an, um Labview-Codes für die Gasregelung auszuführen (Anhang).
2. Schließen Sie einen Mikrodispenser an Stickstoff und einen anderen an Druckluft an, beide mit 5 % CO₂. Stellen Sie beide Gase auf 2 psi ein. Schließen Sie die Ausgänge der Dispenser an eine T-Überschneidung an, bevor Sie in das mikrofluidische Gerät gelangen.
3. Bestimmen Sie mit einem dichtheitsgeprüften Gerät das transiente Verhalten der Sauerstoffmodulation, indem Sie die Mikrodispenser zwischen 5 und 21 % Sauerstoff wechseln, während Sie den gelösten Sauerstoff im Wasser mit einem faseroptischen Sauerstoffsensor messen (siehe Geräteliste und repräsentative Ergebnisse).

4. Einrichten an der Mikroskopie

1. Montieren Sie das Gerät auf dem beheizten Tisch am inversen Mikroskop.
2. 0% und 21% O₂ -Gase an das Gerät anschließen und mit dem Sauerstoffsensor kalibrieren.
3. Verbinden Sie den Ausgangsanschluss der Glukose-Mikrofluidik mit einem Fraktionssammler
.
4. Bereiten Sie den Krebs Ringer Bicarbonat-Puffer (KRB) vor: 129 mM NaCl, 5 mM NaHCO₃, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH₂PO₄, 1 mM CaCl_{2,2H 2}O, 1,2 mM MgSO_{4,7H 2}O, 10 mM HEPES pH 7,35-7,40, 2 mM Basalglukose und 5 % FBS.
5. Bereiten Sie zwei Pufferlösungen mit 2 mM bzw. 14 mM Glukose in konischen 50-ml-Röhrchen vor, die in einem 37 °C warmen Wasserbad gebadet sind.
6. Schließen Sie eine Peristaltikpumpe an, um Puffer mit 250 μl/min in den Schlauch zu ziehen. Leiten Sie den Schlauch über eine 37 °C heiße Platte, bevor Sie in das mikrofluidische Gerät gelangen.
7. Um die Inseln zu färben, fügen Sie Fura-2 AM in DMSO und Rh123 in 100 % Ethanol zu 2 ml KRB hinzu, um endgültige Farbstoffkonzentrationen von 5 μM bzw. 2,5 μM zu erreichen.
8. Die Inselzellen mit einer 10 μl Pipette aufnehmen und 30 min bei 37 °C in Farbstoffen inkubieren.
9. Laden Sie ca. 20 Inselzellen über den Glukose-Mikrokanal-Einlass in das Gerät. Leiten Sie die Inselzellen in die Kammer, indem Sie den Puffer vom Auslass zurück in den Einlass anfüllen.
10. Perfundieren Sie die Inselzellen 10 Minuten lang mit Puffer, um überschüssige Farbstoffe zu entfernen.

5. Gleichzeitige Sauerstoff- und Glukosestimulation durchführen

1. Geben Sie einen Glukosestimulationsimpuls mit 5 Minuten Ausgangswert ab, der von KRB2 festgelegt wurde, gefolgt von 15 Minuten 14 mM-Stimulation, dann waschen Sie sich 15 Minuten lang in KRB2.
2. Aufzeichnung einer Anregungswellenlänge von 340/380 nm für Fura-2 und einer 534-Emission für Rh123.
3. Führen Sie vor jedem Experiment Messungen eines normalen Pulses (14 mM Normoxik) durch.
4. Bei der Sauerstoffmodulation (Hypoxie/intermittierende Hypoxie) wird nur während der Stimulations- und Waschschritte ein Pufferfluss und in den anderen Schritten kein Fluss angewendet, um konvektive Störungen zu minimieren.
5. Sammeln Sie die Abwässer aus dem Glukoseauslass in Abständen von 1 Minute für den ELISA-Insulintest.

Results

Zentral für diese Insel-Hypoxie-Technik ist die Fähigkeit, die Stimulation der wässrigen und gasförmigen Phase in derselben mikrofluidischen Kammer mit Transienten auf der winzigen Skala zu modulieren. Abbildung 1 ist ein repräsentatives Ergebnis der a) dualen Stimulationen und b) der schnellen Modulationen, die innerhalb der Inselkammer gemessen wurden. Die wässrige Modulation, die durch Einbringen von Fluorescein in die Kammer gezeigt wird, erreicht das Gleichgewicht in drei bis vier Minuten nach dem M...

Discussion

Die verschiedenen Modalitäten, die in dieser Inselhypoxie-Technik integriert sind, stellen hier mehrere Punkte zur Fehlerbehebung dar. Zunächst werden die isolierten Inseln in Kultur durch Verdauungsenzyme aus Azinuszellen weiter abgebaut und zerfallen. Die Standardisierung von Experimenten auf 1-2 Tage nach der Isolierung der Inselzellen ist daher entscheidend, um konsistente Ergebnisse zu erhalten. Zweitens wurde die wässrige Strömung während der Hypoxie und der intermittierenden Hypoxie gestoppt, um eine konvektive Cl...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagenz/Material
Spinner	Laurell	WS-400
SU8 MicroChem		SU8-2150/SU8-2100
Digital Hotplate	PMC Dataplate	722A
UV-Härtungslampe	OmniCure	S1000
PMDS	Dow Chemical	Sylgard 184
Corona Wand	ETP	BD-20AC
Vakuumkammer	Bel-Art	420220000
Mikrodispenser	The Lee Company	IKTX0322000A
5 V und 20 V DC Power	Radio Shack
NI USB	National Instrument	NI USB-6501
Thermometer	Omega Engineering, Inc.
Schlauchpumpe	Gilson	Minipulse 2
Sauerstoffsensor	Ocean Optics	NeoFox
Fraktionssammler	Gilson	203
Pippette	Fisher Scientific	Finnpipette II 100μ l
Inverses Epifluoreszenzmikroskop	Leica	DMI 4000B
50 ml Konische Röhrchen	Fisher Scientific
Fura-2 Fluoreszenzfarbstoff-Molekularsonden	, Life Technologies
Rhodamin 123 Fluoreszenzfarbstoff-Molekularsonden	, Life Technologies
Nährmedien	Sigma-Aldrich	RPMI-1640
HEPES	Sigma-Aldrich
Glukose	Sigma-Aldrich
Rinderserum Albumin	Sigma-Aldrich
30 Zoll Silikonschläuche	Cole-Parmer		1/16 Zoll x 1/8 Zoll
1,5 ml Eppendorf Röhrchen	Fisher Scientific
Y-Anschlüsse	Cole-Parmer		1/16 Zoll und 4 mm
Spritzenverbinder	Cole-Parmer		Luer-Buchse 1/16 Zoll
Gerade Verbinder	Cole-Parmer		1/16 Zoll
Winkelverbinder	Cole-Parmer		1/16 Zoll