Eine mikrofluidische Chip für die vielseitige chemische Analyse von Einzelzellen

Summary

In diesem Artikel präsentieren wir ein Mikrofluidik-Chip für Einzelzellanalyse. Es ermöglicht die Quantifizierung der intrazellulären Proteine, Enzyme, Cofaktoren und zweiten Boten mittels Fluoreszenzassays oder Immunoassays.

Abstract

Wir stellen eine Mikrofluidik-Vorrichtung, die die quantitative Bestimmung der intrazellulären Biomoleküle in mehreren Einzelzellen parallel ermöglicht. Zu diesem Zweck werden die Zellen passiv in der Mitte eines Mikrokammer gefangen. Nach der Aktivierung des Steuerungsschicht wird die Zelle von der umgebenden Volumen in einer kleinen Kammer isoliert. Die umgebende Volumen kann dann ohne die isolierte Zelle ausgetauscht werden. Jedoch nach kurzer Öffnen und Schließen der Kammer, wobei die Lösung in der Kammer in ein paar hundert Millisekunden ersetzt werden. Aufgrund der Reversibilität der Kammern, die Zellen können an verschiedenen Lösungen nacheinander in einer hoch steuerbar, z. B. für die Inkubation, Waschen und schließlich Zelllyse ausgesetzt werden. Die dicht verschlossenen Kleinst ermöglichen die Retention des Lysats, zu minimieren und die Verdünnung zu steuern, nachdem Zell-Lyse. Seit Lyse und Analyse an der gleichen Stelle auftreten, wird eine hohe Empfindlichkeit beibehalten, da keine weitere dilution oder Verlust der Analyten erfolgt während des Transports. Die Mikrokammer-Design ermöglicht somit die zuverlässige und reproduzierbare Analyse sehr kleiner Kopienzahlen von intrazellulären Molekülen (attomol, zeptomoles) aus einzelnen Zellen freigesetzt wird. Darüber hinaus können viele Mikrokammern in einem Array-Format angeordnet werden, wodurch die Analyse von vielen Zellen gleichzeitig, da die geeignete optische Geräte für die Überwachung verwendet wird. Wir haben bereits die Plattform für den Proof-of-Concept-Studien verwendet, um intrazelluläre Proteine, Enzyme, Cofaktoren und Botenstoffe in relativ oder absolut quantifizierbare Weise zu analysieren.

Introduction

Viele Studien haben in der Vergangenheit Zell-zu-Zell-Unterschiede innerhalb einer großen Zellpopulation ^1-3, insbesondere Signalprozesse ⁴ oder die Mengen an intrazelluläre Biomoleküle wie Proteine ^​​5,6, Metaboliten, und Cofaktoren ^7,8 ergab. Diese Heterogenitäten werden als grundlegend wichtig für die Zell Anpassung und Evolution ⁹ zu sein, aber auch eine Schlüsselrolle in der Entstehung und Behandlung von Krankheiten wie Krebs ^13.10. Daher Studien über die Einzelzellebene sind von hohem Interesse in der biologischen und pharmakologischen Forschung, insbesondere, wenn diese Studien zeigen die versch....

Protocol

1. SU-8 Master Fabrication

Bereiten Sie die beiden Master-Formen für die Kanäle (fluidische und Kontrolle, für Schaltpläne und Abmessungen siehe Abbildung 2) mit dem folgenden Protokoll, aber mit unterschiedlichen Maskenmustern. Das Verfahren wird in Fig. 3a gezeigt.

1. Beginnen, indem eine 4-Zoll-Siliciumwafer 10 min lang bei 180 ° C Laden Sie die dehydriert Wafer auf einem Spin-Coater und verwenden Sie die folgende Protokoll für Spin-Coating-SU-8 2015:
   1. Spin-Wafer bei 100 Upm für 20 sec (offene Deckel des Spin-Coater, verzichten SU-8 in diesem Schritt, Deckel schließen nach der Ausgabe).

Results

Unsere Plattform ist in der Lage, eine Vielzahl von intrazellulären und sekretierten Molekülen in Gegenwart oder durch einzelne Zellen produziert analysieren. Hier möchten wir beispielsweise verschiedene Studien, um die Vielfalt der möglichen Tests unterstreichen präsentieren. Wir werden ein Beispiel für ein sezerniertes Enzym (5a) sowie ein intrazelluläres Enzym (Fig. 5b) und Protein (Fig. 5c und d) erhalten wird. Weitere Beispiele, wie Cofaktoren oder.......

Discussion

Mikrofluidik-Technologie hat neue und faszinierende Möglichkeiten für die Einzelzellanalyse eröffnet. Insbesondere hat die Möglichkeit, zu fangen und zu immobilisieren Zellen einzeln von Mikrofluidik-Tools systematische Kurz-und Langzeitstudien auf Einzelzelleigenschaften und der Reaktion erlaubt. Zusätzlich Verkapselung von Zellen in hoher Frequenz Mikrotröpfchen auf einem Mikrochip erzeugt hat einzelne Zelle Sekretion Studien, die mit herkömmlichen Vorrichtungen durchgeführt werden Zytometrie kann aktiviert. Die Mikro.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS:
Name des Reagenzes		Katalognummer	des Unternehmens Bemerkungen (optional)
SU-8 2015	MicroChem Corp. (Netwon, MA)
	ABCR (Karlsruhe, Deutschland)	AB103608
4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-Diacetylchitobiosidhydrat	Sigma Aldrich	M9763
Aceton	Merck VWR (Darmstadt, Deutschland)	100014
Avidin	AppliChem (Axon Lab AG)	A-2568
AZ 1518	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Deutschland)	n.a.AZ
726 Entwickler	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Deutschland)	n.a.
Rinderserumalbumin	Sigma Aldrich	A-4503
Rinderserumalbumin, Biotin	Sigma Aldrich	A-8549
Zelldissoziationspuffer	Invitrogen	13151-014
Hexamethyldisilazan (HDMS)	Sigma Aldrich	40215
Salzsäure	Fluka	84422
Isopropanol	Merck VWR (Darmstadt, Deutschland)	109634
Magnesiumchlorid-Hexahydrat	Fluka	63068
MR Entwickler 600	Microresist technology GmbH (Berlin, Deutschland)	n.a.PBS
	Invitrogen	10010-031
PLL-g-PEG transplantiertes	SuSoS, (Dü bendorf, Schweiz)	n.a.PLL-g-PEG
gepfropftes Biotin	SuSoS, (Dü bendorf, Schweiz)	n.a.Kaliumchlorid
	Fluka	60132
Protein G, Biotin	Sigma Feinchemikalien	41624
Siliziumwafer	Si-Mat (Kaufering, Deutschland)	n.a.Sylgard
184 Silikonelastomer Kit (PDMS)	Dow Corning	39100000
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Biorad
Tween 20	Biorad	1706531
AUSSTATTUNG:
Materialname	Firma	Katalognummer	Kommentare (optional)
0.22 µ m PES Spritzenvorsatzfilter	TRP	99722
1/1,5 mm Biopsie-Puncher	Miltex, York PA	33-31AA/33-31A
Cell Trics Filter 20 & Mikro; m	Partec	04-004-2325
Zentrifuge Sigma 3-18K	Kuehner	n.a.Hotplate
HP 160 III BM	Sawatec, Sax, Schweiz	n.a.MA-6
Mask Aligner	Karl Suess	n.a.Multizoom
AZ100M Mikroskop	Nikon Corporation	n.a.Photomask
	Microlitho, Essex, U.K.	n.a
Plasmareiniger PDC-32G	Harrick	n.a.Spin
Coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE	Laurell	n.a.Spin
Module SM 180 BM	Sawatec, Sax, Schweiz	n.a.Step
Profiler Dektak XT Advanced	Bruker	n.a.Spritzenpumpe
neMESYS	Cetoni	n.a.