Eine mikrofluidische Chip für die vielseitige chemische Analyse von Einzelzellen

Zusammenfassung

In diesem Artikel präsentieren wir ein Mikrofluidik-Chip für Einzelzellanalyse. Es ermöglicht die Quantifizierung der intrazellulären Proteine, Enzyme, Cofaktoren und zweiten Boten mittels Fluoreszenzassays oder Immunoassays.

Zusammenfassung

Wir stellen eine Mikrofluidik-Vorrichtung, die die quantitative Bestimmung der intrazellulären Biomoleküle in mehreren Einzelzellen parallel ermöglicht. Zu diesem Zweck werden die Zellen passiv in der Mitte eines Mikrokammer gefangen. Nach der Aktivierung des Steuerungsschicht wird die Zelle von der umgebenden Volumen in einer kleinen Kammer isoliert. Die umgebende Volumen kann dann ohne die isolierte Zelle ausgetauscht werden. Jedoch nach kurzer Öffnen und Schließen der Kammer, wobei die Lösung in der Kammer in ein paar hundert Millisekunden ersetzt werden. Aufgrund der Reversibilität der Kammern, die Zellen können an verschiedenen Lösungen nacheinander in einer hoch steuerbar, z. B. für die Inkubation, Waschen und schließlich Zelllyse ausgesetzt werden. Die dicht verschlossenen Kleinst ermöglichen die Retention des Lysats, zu minimieren und die Verdünnung zu steuern, nachdem Zell-Lyse. Seit Lyse und Analyse an der gleichen Stelle auftreten, wird eine hohe Empfindlichkeit beibehalten, da keine weitere dilution oder Verlust der Analyten erfolgt während des Transports. Die Mikrokammer-Design ermöglicht somit die zuverlässige und reproduzierbare Analyse sehr kleiner Kopienzahlen von intrazellulären Molekülen (attomol, zeptomoles) aus einzelnen Zellen freigesetzt wird. Darüber hinaus können viele Mikrokammern in einem Array-Format angeordnet werden, wodurch die Analyse von vielen Zellen gleichzeitig, da die geeignete optische Geräte für die Überwachung verwendet wird. Wir haben bereits die Plattform für den Proof-of-Concept-Studien verwendet, um intrazelluläre Proteine, Enzyme, Cofaktoren und Botenstoffe in relativ oder absolut quantifizierbare Weise zu analysieren.

Einleitung

Viele Studien haben in der Vergangenheit Zell-zu-Zell-Unterschiede innerhalb einer großen Zellpopulation ^1-3, insbesondere Signalprozesse ⁴ oder die Mengen an intrazelluläre Biomoleküle wie Proteine ^​​5,6, Metaboliten, und Cofaktoren ^7,8 ergab. Diese Heterogenitäten werden als grundlegend wichtig für die Zell Anpassung und Evolution ⁹ zu sein, aber auch eine Schlüsselrolle in der Entstehung und Behandlung von Krankheiten wie Krebs ^13.10. Daher Studien über die Einzelzellebene sind von hohem Interesse in der biologischen und pharmakologischen Forschung, insbesondere, wenn diese Studien zeigen die verschiedenen Zell-Reaktionen nach der Behandlung mit bioaktiven chemischen Substanzen.

In den letzten Jahren haben viele analytische Plattformen entwickelt worden, die die Analyse von einzelnen lebenden Zellen oder die chemische Zusammensetzung des Zellinhalts zu erleichtern. Während die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) ist der Gold standard für sehr hohe Durchsatzanalyse von einzelnen lebenden Zellen, wobei das Verfahren nicht für die Bestimmung von intrazellulären und sekretierten Verbindungen eingesetzt werden. Die Entstehung von mikrofluidischen Plattformen hat neuartige analytische Strategien für die Positionierung, Behandlung und Beobachtung von Einzelzellen versprochen. Ein Meilenstein in der Mikrofluidik wurde mit der Integration der flexiblen PDMS Ventile von Quake und Mitarbeiter realisiert ^14,15 erreicht. Diese Ventile sind nützlich, da sie Regionen auf dem Chip zu isolieren, z. B. zwei Kulturen trennen ^16. Darüber hinaus sind sie besonders geeignet für Einzelzellanalyse und helfen, Probleme zu reduzieren Analyten Verdünnung daher. Die Kraft dieser Ansatz für die Einzelzellanalyse wurde kürzlich von Hansen und Mitarbeiter, die die Genexpression von Hunderten von Einzelzellen parallel analysiert ¹⁷ demonstriert.

Wenn Targeting-Proteinen und Metaboliten ist die Analyse sehr schwierig aufgrund des Fehlens von geeigneten einmplification Methoden, die große Anzahl von verschiedenen Verbindungen enthalten, und ihre Variationen in der chemischen Natur. Darüber hinaus sind die meisten intrazelluläre Biomoleküle erwartet in geringer Kopienzahlen in der Größenordnung von einigen zehntausend ¹⁸ anwesend zu sein, daher der verwendeten analytischen Methode muss eine hohe Empfindlichkeit. Stärker Assays wie Immunoassays und Enzym-Immunoassays (ELISA) sind schwer in mikrofluidischen Systemen zu integrieren, da sie erfordern mehrere Wasch-und Inkubationsschritte sowie Oberflächen Immobilisierung.

Aufgrund dieser Herausforderungen ist es nicht verwunderlich, dass nur ein paar Beispiele berichtet, bei denen Proteine ​​oder Metabolite wurden auf der Ebene einzelner Zellen quantifiziert. Beispielsweise wurden Studien über die Sekretion von fluoreszierenden Verbindungen wurde berichtet ^19,20. Kürzlich wurde die Umsetzung mit ELISA zur Analyse von sezerniertem (nicht fluoreszierenden) Proteine ​​aus der Zellkultur (THP-1-Zellen) und ²¹ Einzel (i präsentiertmmune) Zellen ^10. Targeting intrazellulären Proteinen, Shi et al. Entwickelten eine Mikrofluidik-Vorrichtung, welche die Identifikation von intrazellulären Proteinen für die Untersuchung von Signalwegen in Tumorzellen mittels eines Immunoassays ¹¹ erleichtert. Aber nur die relativen Mengen von Proteinen bestimmt und keine enzymatische Amplifikation wurde verwendet, um das Signal für niedrige vorhandenen Proteine ​​zu erhöhen.

Kürzlich waren wir in der Lage, ein Single-Cell-Trapping Kleinst mit Fluoreszenz-Assays ⁸ und ²² Immunoassays (Abbildung 1) zu kombinieren. Die Zellen werden passiv in mikrofeinen Hürde Strukturen, die Angebot und (schnelle) Austausch von mittel-und andere chemische Mittel ohne jede Bewegung der Zellen zu ermöglichen gefangen. Ein ringförmiger Ventil um jede Falle ermöglicht Isolierung der Zelle in einem sehr kleinen Volumen ("der Mikrokammer"). Dieses Ventil wird sofort nach Einführung einer Zell-Lyse (hypoosmolare)-Puffer, er betätigtnce Verhinderung intrazelluläre Moleküle oder Moleküle diffundieren abgesondert entfernt. Vor allem wegen der kleinen Größe des Volumens (625 pl) große Verdünnung der Moleküle verhindert wird. Da Lyse und Analyse sind in an der gleichen Position auf dem Chip durchgeführt wird, gibt es keinen Verlust von Analyten durch Transport. Die hier beschriebene Chip-Design besteht aus 8 Zeilen abwechselnd entweder 7 oder 8 Kleinst, insgesamt 60 Kleinst. Die Kammern sind in Reihen angesteuert, so dass eine Kreuzkontamination entlang einer Linie ausgeschlossen wird.

Die Plattform kann in Kombination mit Fluoreszenz-Assays und immunologische Assays (1d) verwendet werden. Für letztere haben wir Protokolle zur Immobilisierung der Antikörper, die mit der Chip-Herstellung-und Montageprozess kompatibel sind. Daher die Plattform öffnet den Weg für empfindliche, zuverlässige und quantifizierbare Assays auf Einzelzellebene. Bis jetzt haben wir das Gerät für die Analyse von i verwendetntracellular und sezernierten Enzyme (relative Quantifizierung durch enzymatische Assays), intrazellulären Cofaktoren, Proteinen und kleinen Molekülen (absolute Quantifizierung von Endpunkt-Assays oder ELISA). Im Folgenden beschreiben wir den Prozess der Chipherstellung durch Mehrschicht-Weichlithographie und Protokolle zur Strukturierung der Antikörper durch Mikrokontaktdruck und Oberflächenchemie. Darüber hinaus werden einige Beispiele für den Einsatz und Betrieb Chip gegeben.

Protokoll

1. SU-8 Master Fabrication

Bereiten Sie die beiden Master-Formen für die Kanäle (fluidische und Kontrolle, für Schaltpläne und Abmessungen siehe Abbildung 2) mit dem folgenden Protokoll, aber mit unterschiedlichen Maskenmustern. Das Verfahren wird in Fig. 3a gezeigt.

1. Beginnen, indem eine 4-Zoll-Siliciumwafer 10 min lang bei 180 ° C Laden Sie die dehydriert Wafer auf einem Spin-Coater und verwenden Sie die folgende Protokoll für Spin-Coating-SU-8 2015:
   1. Spin-Wafer bei 100 Upm für 20 sec (offene Deckel des Spin-Coater, verzichten SU-8 in diesem Schritt, Deckel schließen nach der Ausgabe).
   2. Spin-Wafer bei 500 rpm für 10 sec (das wird weiterwider über den gesamten Wafer).
   3. Schleuderscheibe bei 1750 Upm für 30 sec (definiert die Höhe des Resists zu 20 um).
2. Entfernen Resist vom Rand des Wafers mit Aceton (mit einem Tupfer), da dies sonst zu der Kochplatte im nächsten Schritt zu halten. Übertragen Sie die Wafer ahotplate bei 95 ° C und Wärme für 4 min. Nach dem Softbake, setzen durch eine Photomaske mit Klebeband an der Resist Glas in einem Mask Aligner mit UV-Licht (150 mJ / cm ^2, gemessen bei 365 nm) Kalk-Natron.
3. Nach der Belichtung wird der Wafer wieder erwärmen auf 95 ° C für 5 min auf einer Heizplatte. Kühlen Sie den Wafer auf RT und dann eintauchen in ein Bad aus SU-8-Entwickler für 4 min. Schütteln Sie vorsichtig, um nicht belichteten SU-8 zu entfernen. Waschen des Wafers mit Reinraum-Klasse Isopropanol und trocken blasen mit Stickstoff. Prüfen unter einem Mikroskop, wenn die Entwicklung erfolgreich (vor allem die Zellfallen) war. Wenn die Zelle Fallen vollständig entwickelt, sollte die Reflexion des Silizium-Wafers sichtbar. Falls notwendig, die Entwicklung der Wafer wieder für ein paar Minuten.
4. Backen des Wafers in einem Ofen für 2 Stunden bei 180 ° C, um alle Restlösungsmittel zu entfernen. Überprüfen Sie die Höhe der Kanäle mit einer Schritt-Profiler. Wenn die Höhe unterscheidet sich von der gewünschten Höhe, wiederholen dieses Protokoll ab Schritt 1.1 mit einem neuen Wafer undändern Sie die Spin-Geschwindigkeit (Schritt 1.1.3). Schließen Sie die Herstellung der Urform durch Silanisierung des Wafers mit 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluordecyl-dimethylchloro-Silan in einem Exsikkator über Nacht.

2. Meister Fertigung für Mikrokontaktdruck

1. Um Master-Formen für Mikrokontakt-Drucken vorbereiten, dehydrieren einen Silizium-Wafer für 10 min bei 180 ° C Spin-Coat 1 ml HDMS auf diesem Wafer bei 7.500 rpm für 30 sec (das Resist haftet besser auf einen silanisierten Oberfläche). Spin-Coat 2 ml AZ1518 positiven Resist mit diesem Protokoll:
   1. Statische Abgabe des Resists auf dem Wafer.
   2. Spin-Wafer für 5 Sekunden bei 500 Umdrehungen pro Minute.
   3. Spin-Wafer für 60 Sekunden bei 4000 Umdrehungen pro Minute.
2. Nach einer 50 Sekunden Softbake bei 100 ° C auf einer Heizplatte, setzen die wider UV-Licht (21 mJ / cm ² bei 365 nm) durch eine Photomaske und auf einem Mask Aligner. Entwicklung des Resists in einem Bad von AZ 726 für 75 Sekunden. Mit DI-Wasser und Schlag d spülen entwickelte Waferry mit Stickstoff. Entfernen restlichen Lösungsmittels durch Erwärmen des Wafers auf 115 ° C für 50 sek. Silanisieren den Wafer unter Vakuum über Nacht.

3. Herstellung der Mikrofluid-Chip

Ein Zweischicht-Einrichtung Entwurf wird für diese Experimente verwendet. Die beiden Schichten werden getrennt hergestellt und miteinander verbunden werden, bevor der Chip wird schließlich auf einen Glasträger (3b) verbunden ist. Dieser Schritt ist die Herstellung der Schichten und die PDMS PDMS-Stempel für Mikrokontaktdruck.

1. Bereiten Sie eine 10:1-Mischung von PDMS und Härter. Bereiten Sie etwa 80 g PDMS insgesamt (unter Verwendung unserer Designs, wird dies in 10 Chips führen). Mischen Sie die beiden Teile kräftig und entgast PDMS, bis die Mischung blasenfrei ist (~ 30 min).
2. Setzen Sie den Wafer mit der Kontrollschicht in einer Petri-Schale und kleben Sie es auf den Boden. Weiter, gießen ~ 50 g PDMS auf und legte die Scheibe für mindestens 2 Stunden in einem Ofen bei 80 ° C und gewährleisten eine vollständigeHärten der PDMS. Wiederholen Sie den Vorgang für den Mikrokontaktdruck-Wafer, dafür ~ 20 g PDMS benötigt wird.
3. Schleuderbeschichtungs PDMS auf dem Wafer mit der Fluidschicht mit einer Rotationsgeschwindigkeit von 2.000 UpM, um eine etwa 40 um hohen PDMS-Schicht zu bilden. Härten des PDMS in einem Ofen mindestens 1 h bei 80 ° C.
4. Wenn beide Teile ausgehärtet ist, entfernen Sie die Schutzschicht von der Wafer-und in Stücke schneiden mit einer Rasierklinge. Punch-Druckanschluss Löcher durch die Verwendung eines 1 mm Biopsie Puncher. Für die Lagerung, ist es ratsam, ein Stück Klebeband über die Kanäle setzen.
5. Um die beiden Schichten zu verbinden, nehmen Sie die Spin-beschichtete Wafer und das Oberteil und legen Sie sie in einem Plasmafilter ^23. Nach der Plasmabehandlung, beide Teile schnell unter einem Mikroskop mit großem Arbeitsabstand auszurichten. Fügen Sie einige Ersatz PDMS um die oberen Teile gelegt. Dieser Schritt ist nicht zwingend, aber es die Entfernung der PDMS von dem Wafer ermöglicht. Platzieren des Wafers in einem Ofen bei 80 ° C für mindestens 1 h.
6. Verwenden Sie ein Skalpell vorsichtig die PDMS von der Wafer-und die Mikrochips geschnitten. Punch-Zugang Löcher für die fluidischen Anschlüsse mit einem 1,5 mm-Biopsie Puncher.
7. Die PDMS-Chip ist nun fertig und kann über Monate gelagert werden. Optional: Wenn der Chip mit einem Reservoir verwendet, schneiden Sie den oberen Teil einer 200 ul Pipettenspitze und verwenden einige Ersatz, halb ausgehärteten PDMS, um sie oben zu kleben. Setzen Sie den Chip im Backofen wieder auf 80 ° C für mindestens 1 Stunde.

4. Die Bindung an Glas Slide

Um das Gerät für den direkten enzymatischen Assays verwenden, ist der einzige Schritt, nach der Verklebung erforderlich die Sperrung von Oberflächen. Aus diesem Protokoll, A. gehen jedoch die Mikrofluidik-Chip für Immunoassays oder ELISAs verwenden Sie bitte Protokoll B beziehen sich auf die Bindungsstellen nur auf den Glasobjektträger (dh für die TIRF-Mikroskopie oder SPR) zu beschränken. Wenn diese Einschränkung nicht wichtig ist, beziehen sich auf A, sondern verwenden biotinylierte Konjugate in Schritt 4.3 und fahren Sie mit Schritt 4.8in Protokoll B, um eine voll funktionsfähige Oberfläche.

Vor der Durchführung Protokoll A und B: Es wird empfohlen, alle verwendeten Proteinlösungen vor der Einbringung in den Chip auswählen. Schutt und Proteinaggregate anderweitig zu blockieren Zellfallen, wodurch die Anzahl der Kammern, die für die Analyse verwendet werden können, verringert wird. Zu diesem Zweck, verwenden Sie eine nicht-Protein-Adsorptions-Filtereinheit, die alle Lösungen vor Aufnahme in die Kanäle zu filtern.

Protokoll A (enzymatische Assays)

1. Um die Mikrofluid-Vorrichtung abzuschließen, verbinden die PDMS-Teile auf einem Glasträger. Um dies zu tun, zuerst reinigen einen Glasobjektträger mit Seife, destilliertem Wasser und Ethanol. Trocknen Sie die Folie mit einem Stickstoffstrom. Reinigen Sie die PDMS Teil mit Klebeband.
2. Setzen Sie die PDMS-Teil und die gereinigte Glasobjektträger in die Plasmareiniger für 45 Sekunden bei 18 W. Um eine feste Bindung zu gewährleisten, setzen Sie den Chip auf einer heißen Platte (100 ° C) für 5 min.
3. Nach dem Verkleben, füllen Sie den Chip mit fLUID. Eine einfache Möglichkeit, dies zu erreichen, ist die Zentrifugalkraft zu verwenden. Schneiden Sie den unteren Teil von 200 ul Pipettenspitze. Für die Fluidkanäle, füllen sie mit der Blockierungslösung (Rinderserumalbumin (4% w / v) oder Poly-L-Lysin) gepfropfte Polyethylenglykol (0,05% w / v) und setzen die Spitzen in die Einlässe. Füllen Sie die Steuerschicht Buchten entweder mit Wasser oder mit einer isosmotischen Lösung, zB PBS. Legen Sie die Chips in die Zentrifuge (800 × g) für 5 min. Die Kanäle sollen nun mit Flüssigkeit vollständig gefüllt sein. Wenn nicht, wiederholen Sie diesen Schritt.
4. Inkubieren der Blockierungslösung für mindestens 30 min bei Raumtemperatur. Waschen der Lösung aus dem Flüssigkeitsschicht mit PBS bei einer Flussrate von 10 &mgr; l / min unter Verwendung einer Spritzenpumpe. Das Gerät ist nun bereit für die Zellexperimente.

Protokoll B (Immunoassays)

Für eine komplette Übersicht über die Oberflächenmodifikation von Schritt ab 4.7 finden Sie in Tabelle 1 beziehen.

5. Incubate PDMS-Stempel für Mikrokontakt-Drucken mit einer BBSA / BSA-Lösung (z. B. 1-100). Nach 30 Minuten, reinigen Sie die Briefmarken gründlich mit destilliertem Wasser und trocknen Sie den Stempel unter einem Strom von Stickstoff. Platzieren schnell die Stempel auf einem gereinigten Glasobjektträger (4).
6. Setzen Sie die Glasobjektträger mit dem Stempel zusammen mit dem oberen Teil des mikrofluidischen Chips Sauerstoffplasma für 45 sec bei maximaler Leistung (18 W) in einem Plasma-Reiniger. Nach der Plasmabehandlung, entfernen Sie den Stempel, und richten Sie die bedruckte Oberfläche unter den Kleinst des Gerätes. Platzieren der Chip für 30 Minuten auf einer Heizplatte bei 50 ° C
7. Um die verbleibende Fläche zu blockieren, führen sterilfiltriert BSA-Lösung (4% (w / v) in PBS) in den Chip mit einer Zentrifuge (siehe Schritt 4.2). Inkubation für 1 Stunde und waschen Sie die Lösung aus der Fluidschicht mit PBS (siehe Schritt 4.3). Der Chip kann dann direkt oder bei 4 ° C in einer feuchten Box verwendet für bis zu 2 Wochen gelagert werden.
8. Für eine voll funktionsfähige Bindungs ​​surface, einzuführen Avidin (0,025% (w / v) in PBS) in den Vorratsbehälter. Verwenden einer Fließgeschwindigkeit von 5 &mgr; l / min für 30 min, um die Avidin-Lösung durch die Fluidkanäle zu entziehen. Danach spülen PBS für 10 min. Spülen Sie den Behälter gründlich.
9. Anschließend fügen Protein G (0,0025% (w / v) in PBS) und bündig für weitere 30 min. Danach Waschen mit PBS für weitere 10 min. Anschließend fügen Sie den Antikörper von Interesse (0,0001% (w / v) in PBS) für 10 min. Nach 10 min, stoppen den Fluss für 15 min Bindung zu ermöglichen. Weiter, waschen mit PBS für 10 min.

5. Zellexperimente

Das Protokoll wird im Allgemeinen wegen der Vielzahl der möglichen Tests geschrieben. Als Beispiel werden die Reagenzien für den Assay benötigt G6PDH Toxizität angegeben. Die anfängliche Zellrückhalteleistung der Vorrichtung etwa 2,5%, das heißt 5 von 200 Zellen eingefangen werden. Die endgültige Belegung der Zelle Fallen hängt stark von der verwendeten Zelllinie, das Protokoll zu unterbrechendie Zelllinie und die Zeit, die Zellen werden durch den Kanal gespült. Für Zellen in Suspension (wie U937) natürlich wachsenden, können einzelne Zellen in etwa 75% der Kammern nach wenigen Minuten gefunden werden. Die anderen Kammern sind entweder nicht gefüllt ist, oder durch zwei oder mehr Zellen besetzt. Im allgemeinen ist die Einzelzellbelegung kleiner für adhärente Zelllinien. Bei Verwendung des hier vorgestellten eher milde Suspensions Protokoll nimmt der Anteil auf etwa 30% (HEK, MLT Zellen). Die Einzelzellbelegung kann durch Trypsin-Behandlung der Zellen verbessert werden, aber dies kann auch die Ergebnisse der Experimente zu ändern.

Abhängig von dem Zielmolekül, kann die Adsorption oder Absorption an PDMS die Ergebnisse beeinflussen. Adsorption kann durch Blockieren der Oberflächen mit BSA oder PLL-g-PEG reduziert werden. Absorption ist unwahrscheinlich, für die meisten hydrophilen Biomoleküle, aber es sollte für (Klein-) lipophilen Zellkomponenten überprüft werden.

1. Vorbereitung der Zellen gemäß dem spezifischen Protokoll (zB Drogenabhängigkeit). Für Suspensionszellen, fügen Zellen direkt in den Chip. Für Klebezelllinien verwenden enzymfreie Dissoziationspuffer um eine Zellsuspension zu erzeugen. Filtern Sie die Zellen vor, um die Einführung der Chip sie die Menge an Zellcluster zu reduzieren.
2. Laden der Zellen auf dem Chip unter Verwendung einer Spritzenpumpe und Vorlauf, statt der Zellsuspension zurückziehen. Verwenden einer Fließgeschwindigkeit von 5 &mgr; l / min für Suspensionszelllinien und höhere Durchflussraten von 10-20 &mgr; l / min für Haftzellen, da unspezifische Bindung der Zellen auf den Kanalwänden zu reduzieren.
3. Wenn die Fallen gefüllt sind, schließen die Kammern. Wenn viele Zellen anhaften unspezifisch an der Oberfläche, versuchen, sie mit einer Fließgeschwindigkeit von 10-30 ml / min abzuwaschen mit Zelldissoziationspuffer.

Protokoll A (enzymatische Assays)

4. Ziehen Lyse-Puffer durch den Chip. In diesem Beispiel ist dies ein Puffer hypoosmolar Puffer mit Tween 20 (10 mM Tris-HCl, 10mM KCl, 1,5 mM MgCl _2, 1% (v / v) Tween 20). Für die Lyse, schnell öffnen und schließen Kammern (dh 500 ms für Flussraten von 10-50 ml / min ^7,21). Assay für die G6PDH, add 2 mM Glucose-6-Phosphat, 0,5 mM NADP, 0,5 U / ml Diaphorase und 0,3 mM Resazurin dem Lysepuffer. Starten Sie die Überwachung der kinetischen Reaktion sofort nach der Lyse.

Hinweis: Wählen Sie eine beliebige Puffer, die sich für den Test ist, beachten jedoch, dass nackten starke Reinigungsmittel (wie Triton, SDS) lysiert Zellen sofort und wird zu einem Verlust von Analyten in Kammeröffnung führen.

Protokoll B (Immunoassays)

Für eine kurze Beschreibung der ELISA Zellexperimenten (Durchflussmengen-, Kammer-Status, etc.), bitte die Tabelle 1 verwiesen.

5. Für ELISA, fügen Sie die erforderlichen Nachweis-Reagens (z. B. sekundäre Antikörper, markierte Antigen) direkt an der Lyse-Puffer. Die hierin aufgenommen Tween 20 reduziert die unspezifische Adsorption. Lyse der Zellen nach Schritt 5.4. Inkubieren der Mischung für 10-15 Minuten Bindung (Inkubation je nach dem verwendeten Antigen und Antikörper) zu ermöglichen.
6. Antikörper-Enzym-Konjugate, die spezifisch an den Kanalwänden adsorbiert kann bis zu einem Umsatz des Nachweisreagenz schon innerhalb des Reservoirs und Kanäle führen. Um Probleme dieser Adsorption reduzieren, spülen eine dauerhafte Inhibitor des Enzyms verwendet Erkennung durch den Chip während der Inkubationszeit (Kammern geschlossen, vor der Zugabe des Detektions-Reagenz). Für HRP, verwenden Sie 20 mM HCl in Wasser, um die Enzyme unspezifisch adsorbiert dauerhaft zu inaktivieren.
7. Nach der Inkubationszeit, stellen die Nachweisreagenz (zB Amplex Red und Wasserstoffperoxid für HRP) auf dem Chip. Öffnen Sie die Kammern in Kürze erneut, um die nicht gebundenen sekundären Antikörper abzuwaschen und die Detektions-Reagenz hinzufügen. Start sofort die Überwachung der kinetischen Reaktion.
8. Kalibrierung: UnbeweglichkeitseffektDer Antikörper gegen das Ziel von Interesse. Schließen Kammern. Bereiten unterschiedlichen Konzentrationen des Analyten in Puffer oder in Zelllysat Off-Chip. Tragen Sie eine Konzentration auf den Chip und tauschen das Volumen innerhalb der Kammern (500 ms Öffnungszeit) schnell. Diese Öffnungszeit kurz genug ist, um sicherzustellen, dass keine zusätzliche Ansammlung von Analyten Spülen auftritt, und nur eine bestimmte Anzahl von Molekülen aus dem Volumen der Mikrokammer detektiert werden. Aus der bekannten Konzentration des Antigens in der Lösung und das Volumen der Kammer (625 pl), die Berechnung der Menge in der Kammer. Anschließend mit Schritt 5.5 fort und die Einführung der Nachweiseinheit.

Ergebnisse

Unsere Plattform ist in der Lage, eine Vielzahl von intrazellulären und sekretierten Molekülen in Gegenwart oder durch einzelne Zellen produziert analysieren. Hier möchten wir beispielsweise verschiedene Studien, um die Vielfalt der möglichen Tests unterstreichen präsentieren. Wir werden ein Beispiel für ein sezerniertes Enzym (5a) sowie ein intrazelluläres Enzym (Fig. 5b) und Protein (Fig. 5c und d) erhalten wird. Weitere Beispiele, wie Cofaktoren oder...

Diskussion

Mikrofluidik-Technologie hat neue und faszinierende Möglichkeiten für die Einzelzellanalyse eröffnet. Insbesondere hat die Möglichkeit, zu fangen und zu immobilisieren Zellen einzeln von Mikrofluidik-Tools systematische Kurz-und Langzeitstudien auf Einzelzelleigenschaften und der Reaktion erlaubt. Zusätzlich Verkapselung von Zellen in hoher Frequenz Mikrotröpfchen auf einem Mikrochip erzeugt hat einzelne Zelle Sekretion Studien, die mit herkömmlichen Vorrichtungen durchgeführt werden Zytometrie kann aktiviert. Die Mikro...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
REAGENTS:
Name des Reagenzes		Katalognummer	des Unternehmens Bemerkungen (optional)
SU-8 2015	MicroChem Corp. (Netwon, MA)
	ABCR (Karlsruhe, Deutschland)	AB103608
4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-Diacetylchitobiosidhydrat	Sigma Aldrich	M9763
Aceton	Merck VWR (Darmstadt, Deutschland)	100014
Avidin	AppliChem (Axon Lab AG)	A-2568
AZ 1518	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Deutschland)	n.a.AZ
726 Entwickler	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Deutschland)	n.a.
Rinderserumalbumin	Sigma Aldrich	A-4503
Rinderserumalbumin, Biotin	Sigma Aldrich	A-8549
Zelldissoziationspuffer	Invitrogen	13151-014
Hexamethyldisilazan (HDMS)	Sigma Aldrich	40215
Salzsäure	Fluka	84422
Isopropanol	Merck VWR (Darmstadt, Deutschland)	109634
Magnesiumchlorid-Hexahydrat	Fluka	63068
MR Entwickler 600	Microresist technology GmbH (Berlin, Deutschland)	n.a.PBS
	Invitrogen	10010-031
PLL-g-PEG transplantiertes	SuSoS, (Dü bendorf, Schweiz)	n.a.PLL-g-PEG
gepfropftes Biotin	SuSoS, (Dü bendorf, Schweiz)	n.a.Kaliumchlorid
	Fluka	60132
Protein G, Biotin	Sigma Feinchemikalien	41624
Siliziumwafer	Si-Mat (Kaufering, Deutschland)	n.a.Sylgard
184 Silikonelastomer Kit (PDMS)	Dow Corning	39100000
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Biorad
Tween 20	Biorad	1706531
AUSSTATTUNG:
Materialname	Firma	Katalognummer	Kommentare (optional)
0.22 µ m PES Spritzenvorsatzfilter	TRP	99722
1/1,5 mm Biopsie-Puncher	Miltex, York PA	33-31AA/33-31A
Cell Trics Filter 20 & Mikro; m	Partec	04-004-2325
Zentrifuge Sigma 3-18K	Kuehner	n.a.Hotplate
HP 160 III BM	Sawatec, Sax, Schweiz	n.a.MA-6
Mask Aligner	Karl Suess	n.a.Multizoom
AZ100M Mikroskop	Nikon Corporation	n.a.Photomask
	Microlitho, Essex, U.K.	n.a
Plasmareiniger PDC-32G	Harrick	n.a.Spin
Coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE	Laurell	n.a.Spin
Module SM 180 BM	Sawatec, Sax, Schweiz	n.a.Step
Profiler Dektak XT Advanced	Bruker	n.a.Spritzenpumpe
neMESYS	Cetoni	n.a.