In diesem Artikel präsentieren wir ein Mikrofluidik-Chip für Einzelzellanalyse. Es ermöglicht die Quantifizierung der intrazellulären Proteine, Enzyme, Cofaktoren und zweiten Boten mittels Fluoreszenzassays oder Immunoassays.
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Methodenartikel
Eine mikrofluidische Chip für die vielseitige chemische Analyse von Einzelzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Wir stellen eine Mikrofluidik-Vorrichtung, die die quantitative Bestimmung der intrazellulären Biomoleküle in mehreren Einzelzellen parallel ermöglicht. Zu diesem Zweck werden die Zellen passiv in der Mitte eines Mikrokammer gefangen. Nach der Aktivierung des Steuerungsschicht wird die Zelle von der umgebenden Volumen in einer kleinen Kammer isoliert. Die umgebende Volumen kann dann ohne die isolierte Zelle ausgetauscht werden. Jedoch nach kurzer Öffnen und Schließen der Kammer, wobei die Lösung in der Kammer in ein paar hundert Millisekunden ersetzt werden. Aufgrund der Reversibilität der Kammern, die Zellen können an verschiedenen Lösungen nacheinander in einer hoch steuerbar, z. B. für die Inkubation, Waschen und schließlich Zelllyse ausgesetzt werden. Die dicht verschlossenen Kleinst ermöglichen die Retention des Lysats, zu minimieren und die Verdünnung zu steuern, nachdem Zell-Lyse. Seit Lyse und Analyse an der gleichen Stelle auftreten, wird eine hohe Empfindlichkeit beibehalten, da keine weitere dilution oder Verlust der Analyten erfolgt während des Transports. Die Mikrokammer-Design ermöglicht somit die zuverlässige und reproduzierbare Analyse sehr kleiner Kopienzahlen von intrazellulären Molekülen (attomol, zeptomoles) aus einzelnen Zellen freigesetzt wird. Darüber hinaus können viele Mikrokammern in einem Array-Format angeordnet werden, wodurch die Analyse von vielen Zellen gleichzeitig, da die geeignete optische Geräte für die Überwachung verwendet wird. Wir haben bereits die Plattform für den Proof-of-Concept-Studien verwendet, um intrazelluläre Proteine, Enzyme, Cofaktoren und Botenstoffe in relativ oder absolut quantifizierbare Weise zu analysieren.
Einleitung
Viele Studien haben in der Vergangenheit Zell-zu-Zell-Unterschiede innerhalb einer großen Zellpopulation 1-3, insbesondere Signalprozesse 4 oder die Mengen an intrazelluläre Biomoleküle wie Proteine 5,6, Metaboliten, und Cofaktoren 7,8 ergab. Diese Heterogenitäten werden als grundlegend wichtig für die Zell Anpassung und Evolution 9 zu sein, aber auch eine Schlüsselrolle in der Entstehung und Behandlung von Krankheiten wie Krebs 13.10. Daher Studien über die Einzelzellebene sind von hohem Interesse in der biologischen und pharmakologischen Forschung, insbesondere, wenn diese Studien zeigen die versch....
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Protokoll
1. SU-8 Master Fabrication
Bereiten Sie die beiden Master-Formen für die Kanäle (fluidische und Kontrolle, für Schaltpläne und Abmessungen siehe Abbildung 2) mit dem folgenden Protokoll, aber mit unterschiedlichen Maskenmustern. Das Verfahren wird in Fig. 3a gezeigt.
- Beginnen, indem eine 4-Zoll-Siliciumwafer 10 min lang bei 180 ° C Laden Sie die dehydriert Wafer auf einem Spin-Coater und verwenden Sie die folgende Protokoll für Spin-Coating-SU-8 2015:
- Spin-Wafer bei 100 Upm für 20 sec (offene Deckel des Spin-Coater, verzichten SU-8 in diesem Schritt, Deckel schließen nach der Ausgabe).
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Ergebnisse
Unsere Plattform ist in der Lage, eine Vielzahl von intrazellulären und sekretierten Molekülen in Gegenwart oder durch einzelne Zellen produziert analysieren. Hier möchten wir beispielsweise verschiedene Studien, um die Vielfalt der möglichen Tests unterstreichen präsentieren. Wir werden ein Beispiel für ein sezerniertes Enzym (5a) sowie ein intrazelluläres Enzym (Fig. 5b) und Protein (Fig. 5c und d) erhalten wird. Weitere Beispiele, wie Cofaktoren oder.......
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Diskussion
Mikrofluidik-Technologie hat neue und faszinierende Möglichkeiten für die Einzelzellanalyse eröffnet. Insbesondere hat die Möglichkeit, zu fangen und zu immobilisieren Zellen einzeln von Mikrofluidik-Tools systematische Kurz-und Langzeitstudien auf Einzelzelleigenschaften und der Reaktion erlaubt. Zusätzlich Verkapselung von Zellen in hoher Frequenz Mikrotröpfchen auf einem Mikrochip erzeugt hat einzelne Zelle Sekretion Studien, die mit herkömmlichen Vorrichtungen durchgeführt werden Zytometrie kann aktiviert. Die Mikro.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Danksagungen
Die Autoren danken Tom Robinson für das Korrekturlesen des Manuskripts, C. Bärtschi und H. Benz für den Bau des custom-built Druck-Kontrollsystem. Wir möchten auch auf die Verwendung des Reinraum FIRST und der Lichtmikroskopie Center (LMC), die beide an der ETH Zürich zu bestätigen. Die Arbeit wurde von Merck Serono und des Europäischen Forschungsrates (ERC) im 7. Rahmenprogramm (ERC Starting Grant, Projekt-Nr. 203428, nμLIPIDs) finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| REAGENTS: | |||
| Name des Reagenzes | Katalognummer | des Unternehmens Bemerkungen (optional) | |
| SU-8 2015 | MicroChem Corp. (Netwon, MA) | ||
| ABCR (Karlsruhe, Deutschland) | AB103608 | ||
| 4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-Diacetylchitobiosidhydrat | Sigma Aldrich | M9763 | |
| Aceton | Merck VWR (Darmstadt, Deutschland) | 100014 | |
| Avidin | AppliChem (Axon Lab AG) | A-2568 | |
| AZ 1518 | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Deutschland) | n.a.AZ | |
| 726 Entwickler | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Deutschland) | n.a. | |
| Rinderserumalbumin | Sigma Aldrich | A-4503 | |
| Rinderserumalbumin, Biotin | Sigma Aldrich | A-8549 | |
| Zelldissoziationspuffer | Invitrogen | 13151-014 | |
| Hexamethyldisilazan (HDMS) | Sigma Aldrich | 40215 | |
| Salzsäure | Fluka | 84422 | |
| Isopropanol | Merck VWR (Darmstadt, Deutschland) | 109634 | |
| Magnesiumchlorid-Hexahydrat | Fluka | 63068 | |
| MR Entwickler 600 | Microresist technology GmbH (Berlin, Deutschland) | n.a.PBS | |
| Invitrogen | 10010-031 | ||
| PLL-g-PEG transplantiertes | SuSoS, (Dü bendorf, Schweiz) | n.a.PLL-g-PEG | |
| gepfropftes Biotin | SuSoS, (Dü bendorf, Schweiz) | n.a.Kaliumchlorid | |
| Fluka | 60132 | ||
| Protein G, Biotin | Sigma Feinchemikalien | 41624 | |
| Siliziumwafer | Si-Mat (Kaufering, Deutschland) | n.a.Sylgard | |
| 184 Silikonelastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 39100000 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Biorad | ||
| Tween 20 | Biorad | 1706531 | |
| AUSSTATTUNG: | |||
| Materialname | Firma | Katalognummer | Kommentare (optional) |
| 0.22 µ m PES Spritzenvorsatzfilter | TRP | 99722 | |
| 1/1,5 mm Biopsie-Puncher | Miltex, York PA | 33-31AA/33-31A | |
| Cell Trics Filter 20 & Mikro; m | Partec | 04-004-2325 | |
| Zentrifuge Sigma 3-18K | Kuehner | n.a.Hotplate | |
| HP 160 III BM | Sawatec, Sax, Schweiz | n.a.MA-6 | |
| Mask Aligner | Karl Suess | n.a.Multizoom | |
| AZ100M Mikroskop | Nikon Corporation | n.a.Photomask | |
| Microlitho, Essex, U.K. | n.a | ||
| Plasmareiniger PDC-32G | Harrick | n.a.Spin | |
| Coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE | Laurell | n.a.Spin | |
| Module SM 180 BM | Sawatec, Sax, Schweiz | n.a.Step | |
| Profiler Dektak XT Advanced | Bruker | n.a.Spritzenpumpe | |
| neMESYS | Cetoni | n.a. |
Referenzen
- Walling, M. A., Shepard, J. R. E. Cellular heterogeneity and live cell arrays. Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).
- Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. Chemical and biological single cell analysis. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).
- Lecault, V....
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Nachdrucke und Genehmigungen
