Motor Nervendurchtrennung und Zeitraffer-Imaging von Gliazellen Verhalten im Live Zebrafisch

Zebrafisch wurden ausführlich die Entwicklung des Nervensystems aufgrund ihrer optischen Transparenz studieren und einfache Transgenese, die, wenn sie gekoppelt ist, für spektakuläre Darstellung von dynamischen Zelle Verhaltensweisen in einem lebenden Embryo erlauben verwendet. Darüber hinaus, da Zebrafisch und Säugetieren fast alle Gene für die Bildung des Nervensystems, zelluläre und molekulare Informationen in diesem Modell Organismus gesammelt erforderlich zu teilen, ist direkt zuordenbar anderen Wirbeltieren. Obwohl unglaublich mächtig für neuronale Entwicklungsstörungen Studien haben die Zebrafisch und seine einzigartigen Eigenschaften das Potenzial, auch Aufklärung der Mechanismen, die zu erhalten und den Wiederaufbau des Nervensystems nach Verletzung. Zebrafisch-Larven behalten ihre Lichtdurchlässigkeit in den späten Larvenstadien und Pigmentflecken können effektiv entweder mit dem Einsatz von pharmakologischen Inhibitoren der Melanin-Produktion oder genetische Mutanten, die Pigmentzellen fehlen gesperrt. So, mit diesem Modell Organismus studieren Verletzungen und Regeneration bei älteren Tieren ist möglich und bietet die einmalige Gelegenheit, direkt zu untersuchen, die zellulären und molekularen Mechanismen, die das Nervensystem wieder aufzubauen. In diesem Manuskript, beschreiben wir, wie man effizient und reproduzierbar verletzen Nerven im PNS von Zebrafisch-Larven. Diese Verletzung Paradigma eignet sich zur Untersuchung nicht nur Degeneration, sondern auch die Reaktionen von peripheren Gliazellen und Immunzellen sowie die Wechselwirkungen zwischen diesen Populationen während der Regeneration.

Die PNS ist ein komplexes Netzwerk von motorischen und sensorischen Nerven, die erforderlich sind, um Information zwischen dem zentralen Nervensystem (CNS) und der Haut, Organe und Muskeln des Körpers vorbei ist, so dass ein Organismus mit seiner Umgebung zu interagieren und zu überleben. Entlang dieser Nerven, periphere Glia, einschließlich myelinisierenden und nicht myelinisierenden Schwann-Zellen und perineurale Glia sowie Bindegewebe umhüllen die Axone und bilden schließlich die reife Nervenzellen. Verletzung dieser Nerven initiiert einen Prozess known als Wallerdegeneration ^10. Dieser Mechanismus der axonalen Fragmentierung, Immun-Rekrutierung, Schutt Clearance und Regeneration ist sehr stereotyp und genetisch reguliert ^1. Frühere Studien in Säugersystemen haben die Rollen von Schwann-Zellen während Nervendegeneration und Regeneration ^{1, 2, 6, 8} beschrieben. In diesen Studien von fixiertem Gewebe oder Zellkultur, Schwann-Zellen nicht nur Makrophagen zum Ort der Verletzung in Schutt Zwischenraum unterstützen eingestellt, sondern auch in Myelin Phagozytose selbst unterstützt. Während diese Studien gewesen unglaublich informativ, wir haben noch nie zuvor visualisiert Gliazellen Reaktionen auf periphere Axon Verletzung in vivo in Echtzeit und keine andere Studien haben den Zusammenhang zwischen den verschiedenen Klassen der peripheren Gliazellen während dieser Ereignisse untersucht.

In jüngster Zeit haben mehrere Labors Waller-Degeneration untersucht mit Zebrafisch und Laser-vermittelten Axon Verletzungen ähnlich dem, was wir hier beschreiben 4, 5, 9 axotomisierten. In einer anderen Studie, die sehr ähnlich zu unserem eigenen ist, wurden tiefer Axone im ventralen motorischen Nerven in 5 Tage alten Larven mit einem handelsüblichen Laser-Ablation System ⁷ durchtrennt. In diesen beiden Versuchsanordnungen, lag der Schwerpunkt auf Waller-Degeneration und beide Axone und Immunzellen wurden abgebildet. Um auf diesen Studien erweitern beschreiben wir verletzen Motor Axone in älteren Larven mit reifer, myelinisierten Nerven und Test die Antwort aller Nerven-assoziierten peripheren Gliazellen während Degeneration und Regeneration.

Um dies zu tun, wir durchschneiden motorischen Nerven in 6 und 7 Tage nach der Befruchtung (DPF) Larven und visualisieren die Reaktionen der einzelnen Gliazellen Populationen sowie untersuchen die Wechselwirkungen zwischen diesen Populationen entlang verletzten Axone. Mit Doppel-und Dreifach-transgenic Linien dieses Etikett peripheren Gliazellen, einschließlich Schwann-Zellen und Perineuralzellen Gliazellen, sowie als Marker für Axone, verwenden wir ein handelsübliches Laser-Ablation, bestehend aus einem Stickstoff-gepumpter Farbstofflaser (Wellenlänge 435 nm), die an einer sich drehenden Scheibe Konfokalsystem zu Axon Querschnitten erhalten erstellen. Dieser Versuchsaufbau erlaubt es uns, Live, Larven Zebrafisch visualisieren, zu verletzen spezifischen peripheren motorischen Axon Traktate und Zeitraffer-Bild die Antworten der verschiedenen Gliazellen Populationen Axon Verletzungen und ihre Beziehung zueinander. Dieses Protokoll kann weiter angepasst werden, um Nervenverletzungen im Zebrafisch unterschiedlichen Alters zu schaffen, mit verschiedenen transgenen Linien oder genetische Mutanten, verschiedene wissenschaftliche Fragen zu beantworten.

1. Vorbereitung und Montage der Zebrafischembryonen für Ablation und Live-Imaging

1. Bereiten Sie einen Vorrat von 0,8% niedrig schmelzende Agarose in Ei Wasser. Aliquot in 13X 100 mm Einwegglaskulturröhrchen und lagern bei 4 ° C bis zum Gebrauch.
2. Kreuz erwachsenen Zebrafisch mit stabil integriert Transgene fluoreszierend beschriften Motoneuronen und Gliazellen Arten von Interesse. Sammle Zebrafischembryonen in Ei und Wasser in 28,5 ° C Inkubator für richtige Inszenierung später ^3.
3. Bei etwa 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF), zu entfernen Ei Wasser und fügen Sie 0,002% 1-Phenyl-2 Thioharnstoff (PTU) in Ei Wasser. Zurück Embryonen in den Inkubator.
4. Zwischen 24 und 96 HPF sollte Embryonen auf das Vorhandensein von gewünschten Transgene auf einem fluoreszierenden Binokular untersucht werden. Zeigen ausgewählt Embryonen in frischem Wasser und PTU Ei zurück in den Inkubator.
5. Als Larven haben 6 Tage nach der Befruchtung (DPF) (oder gewünschte Alter) erreicht, entfernen Sie sie aus dem InkubatorWählen Sie ein paar Larven für die Montage, und übertragen Sie sie auf einem kleineren Teller.
6. Entfernen Sie das Wasser aus der Schüssel und sofort mit etwa 0,02% Tricane ersetzen in PTU Ei Wasser. Erlauben Larven in Narkose sitzen ca. 5 min.
7. Einen aliquoten von 0,8% niedrig schmelzende Agarose in einem Becherglas mit Leitungswasser und Mikrowelle für 30 Sekunden oder bis die Agarose geschmolzen ist. Lassen Sie das Becherglas abkühlen, bis die Agarose in der Kultur Rohr fühlt lauwarmem im Griff (nicht heiß).
8. Wählen Sie einen betäubten Larve und überträgt es auf einem Single-oder Multi-well 35 mm Glasboden Gericht. Wasser, das sich mit der Larve übertragen wurde, dann sofort decken die Larve mit genügend warme Agarose den Glasboden-Teil der Schale zu füllen, aber nicht zu einer großen Kuppel.
9. Wie die Agarose erstarrt, verwenden Sie einen Präpariernadel die Larve auf seiner Seite an der Unterseite des Tellers platzieren, dann kippen die Larve nur leicht auf dem Rücken. Es ist zwingend notwendig für die Verletzung und die anschließende Bildgebung, dassdie Larve montiert berühren das Glas auf den Boden der Schale. Verwenden Sie die Präpariernadel die Larve in dieser Stellung zu halten, bis die Agarose erstarrt ist und die Larve immobilisiert ist.
10. Sobald die Agarose vollständig ausgehärtet ist, langsam pipettieren genug Tricane Wasser (es kann derselbe Tricane für Anästhesie verwendet werden) in die Schüssel vollständig zu bedecken und die Agarose Larve.

2. Laser Kalibrierung und Tests

1. Schalten Sie alle konfokalen Mikroskop Instrumentierung, geeignete Diodenlaser für spannende Zebrafisch Transgene und der Stickstoff-gepumpten Farbstofflaser. Seien Sie sicher, dass das "leere" Strahlteiler in Kraft ist, ist die Laser-Dämpfer vollständig geöffnet ist, und die 435 nm Cumarinfarbstoff Zelle vorhanden ist. Auf dem Computer, öffnen Sie Bildbearbeitungs-Software.
2. Verschieben eines 63x 1.2NA Wasserimmersionsobjektiv in Position und wenden Sie einen kleinen Tropfen Wasser Immersionsmedium für Ziele auf dem Ziel. Ein 63x Ziel wird für gute Laserablation Genauigkeit und Wasser zu ermöglichen immersion ermöglicht einen größeren Arbeitsabstand, die notwendig ist, bei der Arbeit mit 6-7 dpf Zebrafischlarven.
3. Besorgen Sie sich einen Objektträger aus Glas mit einer gespiegelten Seite für die Kalibrierung des Lasers zu verwenden. Legen Sie den Objektträger, Spiegel nach unten auf dem Mikroskop Bühne.
4. Mit dem Okular unter Hellfeld, finden und konzentrieren sich auf einen Kratzer oder Ätzung in den Spiegel. Die Hellfeld werden shining Down auf dem Glasträger, aber nur bis zum Ziel passieren dort, wo der Spiegel verkratzt worden ist oder weggeätzt, was den Spiegel zu schauen durch das Okular schwarz, und die Radierungen wie Flecken aussehen oder Linien aus Licht.
5. Anzeigen und konzentrieren die Radierungen auf dem Computer-Bildschirm mit Imaging-Software. Öffnen Sie das Fenster, das die Laser-Kalibrierung und Energie-Einstellungen steuert. Legen Sie die Anzahl von Impulsen auf "1" und die Dämpfung Platte auf "3"% Transmission. Die Anzahl der Impulse die Anzahl der Male der Laser innerhalb einer Region von Interesse (RO abfeuertI) und die% Transmission für die Laserleistung. Achten Sie darauf, die richtige Einstellung für die Kalibrierung 63x 1.2NA Wasserimmersionsobjektiv ausgewählt ist.
6. Wählen Sie das Ellipse-Werkzeug aus der Werkzeugleiste und klicken Sie auf das Bild auf dem Bildschirm, um einen einzigen kreisförmigen ROI erstellen. Tun Sie dies 3 Mal, bis es 4 kreisförmige ROIs zufällig über das Bild verteilt sind.
7. Einige Systeme können eine Sicherheitsfunktion, die nicht zulassen, dass der Laser zu feuern, wenn der Lichtweg zu den Okularen ist offen. Wenn dies der Fall ist, manuell das Lichtweg zu den Okularen zu diesem Zeitpunkt.
8. Feuern des Lasers. Dies wird 4 kleinen Fleck Radierungen, 1 in jedem kreisförmigen ROI erstellen. Wenn der Laser nicht ausgelöst wird, überprüfen Sie, ob der Laser eingeschaltet ist und richtig angeschlossen, und daß der Lichtweg zu den Okularen wird geschlossen. Wenn die Laser feuert aber kein Ätzen gesehen wird, überprüfen Sie, ob die "leere" Strahlteiler ist vorhanden. Wenn alles an seinem Platz, erhöhen Sie die Laserleistung und "frap" bis zum Radierungen are sichtbar. Wenn ein Laserleistungseinstellung größer als 10 ist notwendig, zum Ätzen des Glases, kann dies auf der Laser-Plasma-Patrone ersetzt werden muss.
9. Wenn die geätzten Stellen zentriert innerhalb des ausgewählten ROIs erscheint, ist keine Kalibrierung notwendig (gehen Sie zu 2.12). Wenn diese Punkte nicht zentriert ist, muss die Einstellung der Kalibrierung aktualisiert werden.
10. So kalibrieren, klicken Sie auf das Update die Einstellung der Kalibrierung. Der Laser wird ausgelöst, und ein Bild erscheint mit einer einzigen geätzten Punktes. Wenn der Punkt nicht angezeigt wird, brechen Sie die Kalibrierung, erhöhen die Leistung des Lasers, und starten Sie die Kalibrierung erneut.
11. Klicken Sie in der Mitte des Spots. Der Laser wird wieder feuern, und ein weiterer Punkt erscheint. Klicken Sie auf diesen Punkt, und wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Kalibrierung abgeschlossen ist und 9 Punkte erscheinen in einem Raster Mode. Wiederholen Sie die Schritte 2,6-2,9 zu überprüfen, ob die Kalibrierung erfolgreich war.
12. Entfernen Sie den Objektträger aus dem Mikroskop Bühne und reinigen das Ziel. Öffnen Sie den Lichtweg zum oculars, und ersetzen Sie die "leere" Strahlteiler mit dem "100% ILL" Strahlteiler.

3. Nervendurchtrennung mit Laser Ablation und Zeitraffer-konfokale Bildgebung von Gliazellen Verhalten

1. Entfernen Sie die Bühne verwendet, um die Objektträger aus Glas halten und ersetzen mit einer Bühne geeignet zur Aufnahme von 35 mm Glasboden Gerichte. Fahren Sie mit dem 63x 1.2NA Wasserimmersionsobjektiv verwenden.
2. Tragen Sie eine kleine Tropfen Wasser Immersionsmedium auf das Ziel, und die Schale mit montierten Larve auf der Bühne. Stabilisieren Sie das Gericht mit Clips.
3. Mit dem Okular und Weitfeld-Beleuchtung, konzentrieren die Larve und suchen Sie die motorischen Nerven. Scannen Sie die Nerven in hemisegments 10-20 und wählen Sie einen motorischen Nerv für Durchtrennung.
4. Bringen Sie eine Live-Ansicht des Nerven auf dem Computer-Bildschirm mit Imaging-Software. Wählen Sie Z-Ebenen und erwerben ein Bild der Axone und Gliazellen des unverletzten Nerven.
5. Bereiten Zeitraffer-Imaging-Einstellungen in der Imaging-Software zu erfassenZ-Projektionen aller Zelltypen in 5-30 min Abständen, je nach Experiment. Am besten ist es, alle notwendigen Einstellungen für die Zeitraffer vor der Durchführung der Ablation zu erstellen, so gibt es keine Verzögerung beim Starten der Zeitraffer einmal die Verletzung ist abgeschlossen.
6. Nehmen Sie die "100% ILL" Strahlteiler und ersetzen mit dem "leeren". Schließen Sie den Lichtweg zu den Okulare.
7. Zurück zu den Live-Blick auf den Nerv. Verwenden Sie den entsprechenden Kanal, um die fluoreszierenden Axone, durchtrennt werden sehen.
8. Mit dem Ellipse-Werkzeug, erstellen Sie eine dünne elliptische ROI im Bereich abgetragen werden soll, dann erstellen Sie kleinere ROIs innerhalb der gewählten Region.
9. In dem Fenster, das die Laser-Einstellungen steuert, stellen Sie die Anzahl der Impulse auf "2" und die Dämpfung Platte "18"% Transmission. Feuern Sie die Laser innerhalb der ausgewählten ROIs. Wenn Fluoreszenz Überreste innerhalb der ROIs, erhöhen Sie die Laserleistung, warten Sie etwa 10 Sekunden, und feuern Sie den Laser wieder. Tun Sie dies, bis Sie eine Einstellung, die bewirkt, dass fluorescen erreichence innerhalb der ROIs verschwinden.
10. Warten Sie 10 oder mehr Sekunden und überprüfen Sie die abgetragene Fläche wieder für Fluoreszenz. Beachten Sie, dass ein ROI kann zunächst abgetragen, erscheinen, wenn es tatsächlich ist gebleicht. Wenn Fluoreszenz kehrt, erhöhen Sie die Laserleistung und feuern den Laser wieder. Wiederholen Sie dies, bis florescence verschwindet innerhalb der ROIs und nicht innerhalb von 10 Sekunden zurück. Am besten ist es mit einer geringeren Laserleistung beginnen und zu erhöhen, um die nötige Kraft. Die erforderliche Laserleistung auf einzelne Mikroskopen, Alter Coumarin-Farbstoff, Probenaufnahme, Alter der Larven, und die Dicke des Gewebes variieren. Sobald ein idealer Laserleistung festgelegt worden ist, kann diese Stufe wieder auf nachfolgende Nerven im gleichen Experiment verwendet werden.
11. Sobald die Ablation abgeschlossen ist, beginnen Zeitraffer-Bildgebung.
12. Wenn der Zeitraffer abgeschlossen ist, verwenden Imaging-Software, um Daten zu sammeln und zu erstellen Farbkomposit Z-Projektionen für jeden Zeitpunkt. Erstellen Sie einen QuickTime-Film, um das Verhalten zu analysierenvon Axonen und Gliazellen gleichzeitig.

Die hier beschriebenen Assays können verwendet werden, um die Reaktion von Gliazellen und anderer Nerven-assoziierten Zellpopulationen axonale Verletzung in vivo zu bewerten. Film 1 zeigt ein Beispiel einer Nervenverletzung mit dieser Methode erstellt und die Reaktion der umgebenden Gliazellen. Dieses Experiment wurde in Tg durchgeführt (nkx2.2a: megfp); Tg (Olig2: DsRed) Zebrafisch, in denen perineurale Glia eine Membran gezielt EGFP und Motoneuronen express cytosolischen dsRED auszudrücken. Die Verletzung wurde entlang des rostralen Projektion eines Stamm motorischen Nerven in einem 6 dpf Live Zebrafisch gemacht, und der Nerv war anschließend Zeitraffer sowohl in der EGFP und DsRed Kanäle abgebildet. Dies erlaubt die gleichzeitige Darstellung von Axon und Gliazellen Verhalten unmittelbar nach der Verletzung.

Abbildung 1 zeigt Standbilder von statischen Zeitpunkten aus Film 1 gemacht. Die gestrichelte Ellipse zeigt die ROI, die mit dem Laser abgetragen wurde. Eine MinuteBeitrag Durchtrennung (MPT), fehlte dem abgetragenen Bereich Fluoreszenz und die Verletzung Zone gemessen etwa 3,5 um vom proximalen zum distalen Stumpf. Der Erfolg einer Durchtrennung kann durch bildgebende bestätigt werden das distale Nervenstumpf und suchen nach Anzeichen von Waller-Degeneration, einschließlich distalen Axon Fragmentierung und eine zügige Abfertigung. Das Fehlen der axonalen Fluoreszenz entlang der distalen Stumpf in Abbildung 1 bei 120 mpt zeigt diese Axone haben in der Tat Wallerdegeneration unterzogen und die Durchtrennung war erfolgreich.

Einstellen der Laserleistung zu einem idealen Einstellung ist entscheidend bei der Durchführung von Experimenten Laserablation. Ideal Laserleistung Einstellungen werden sauber abzutragen den Nerv nur innerhalb der ausgewählten ROI und Laserleistung Einstellungen, die entweder zu niedrig oder zu hoch sind, werden suboptimale Ergebnisse zu erzielen. 2a zeigt eine Verletzung, die mit einer Laserleistung, die zu niedrig war durchgeführt wurde. Fluoreszenz blieb innerhalb der ROI nach dem Brennen des Lasers, Was zu einer unvollständigen Durchtrennung. 2b zeigt eine Verletzung, die mit einer Laserleistung, die zu hoch war durchgeführt wurde, was zu einer extrem großen Ablation.

Film 1. Motor Nervendurchtrennung und konfokale Zeitraffer-Bildgebung von perineurale Gliazellen Verhalten. Film zeigt einen Stamm motorischen Nerven vor der Verletzung, durch ein Bild gemacht 1 mpt und Bilder alle 10 min für einen Gesamtbetrag von 190 min folgte. Tg (Olig2: DsRed);: Verletzung wurde in einer Live 6 dpf Tg (megfp nkx2.2a) durchgeführt. Zebrafischlarve mit vorderen montiert links und dorsal oben Klicken Sie hier, um Film anzusehen .

Abbildung 1. Motor Nervendurchtrennung und Standbildervon Gliazellen Verhalten. Panels sind noch Bilder von Film 1 gemacht. Die gestrichelte elliptischen Bereich stellt den ROI wurde abgetragen, wodurch eine Durchtrennung Verletzungen durch die gestrichelte Linie bezeichnet. Pfeilspitzen weisen auf axonale Fluoreszenz, die vorhanden ist, bei 10 MPT, aber nicht bei 120 mpt, was die distalen Axonen degeneriert. Maßstab bar, 10 um.

Abbildung 2. Suboptimal Laserleistung Einstellungen führt zu unerwünschten Ergebnissen. (A) Ein versuchter Ablation mit einer Laserleistung, die zu niedrig ist, durchgeführt. Die gestrichelte Ellipse zeigt die gewählte ROI. 1 mpt das Gebiet wurde leicht gebleicht und nicht durchtrennten (Pfeilspitze). (B) Eine Ablation mit einer Laserleistung, die zu hoch ist, durchgeführt. Die gestrichelte Ellipse bezeichnet die gewählte ROI. 1 mpt dieabgetragenen Fläche wesentlich größer als die ausgewählte ROI (gestrichelte Linie). Tg (Olig2: DsRed);: Alle Bilder sind von Live 6 dpf Tg (megfp nkx2.2a) gemacht Zebrafischlarven mit vorderen links und dorsal an die Spitze. Maßstab bar, 10 um.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.