Ein Protokoll für genetische Induktion und Visualisierung von Gut-und invasiven Tumoren in Cephalic Komplexe von Drosophila melanogaster

Zusammenfassung

Die Zusammenarbeit zwischen einer aktivierten Onkogen RAS wie ^V12 und Mutationen in Genen, die Zellpolarität wie gekritzelt, führen in das Tumorwachstum in Drosophila, wo Tumorzellen invasive Verhalten zeigen auch. Hier wird ein einfaches Protokoll für die Induktion und Beobachtung der benignen und invasiven Tumoren präsentiert.

Zusammenfassung

Drosophila hat unser Verständnis der genetischen Grundlagen der normalen Entwicklung und Krankheit in den letzten Jahrzehnten und heute immens zu unserem Verständnis der komplexen Krankheiten beitragen ^07.01 geht es weiter beleuchtet. Progression von Tumoren von einem gutartigen zu einem metastatischen Stadium ist ein komplexes Ereignis ⁸ und hat in Drosophila modelliert worden, um uns helfen, die genetischen Grundlagen der Erkrankung ⁹ besser zu verstehen. Hier stelle ich ein einfaches Protokoll, genetisch zu induzieren, beobachten und analysieren dann die Progression von Tumoren in Drosophila-Larven. Die Tumorinduktion Technik basiert auf der MARCM System ¹⁰ auf und nutzt die Zusammenarbeit zwischen einer aktivierten Onkogen Ras ^V12 und der Verlust der Zellpolarität Gene (gekritzelt, Scheiben großen und tödlichen Riesen Larven) zu invasiven Tumoren ⁹ generieren. Ich zeigen, wie diese Tumoren können in der intakten Larven visualisiert unddann, wie diese können zur weiteren Analyse seziert werden. Die vereinfachte Protokoll hier vorge sollte es möglich machen, damit diese Technik durch Forscher interessiert Verständnis der Rolle von einem Gen in Tumorinvasion verwendet werden.

Einleitung

Progression von Tumoren von einem gutartigen zu einem metastatischen Stadium ist ein schrittweise Prozess, der durch Hinterziehung von in den Körper ⁸ vorhandenen Schutzmechanismen gekennzeichnet ist. Zum Beispiel Tumorzellen im Körper muss in der Lage, Apoptose und das Immunsystem zu entgehen, Durchbruch des Fachextrazellulären Matrix (ECM) genannt Basalmembran und der Bewältigung der sozialen Kontrolle durch die umgebenden Zellen ⁸ unterliegen. Es ist durch eine schrittweise Fortschreiten, dass die Krebszellen die Fähigkeit erwerben, entfernten Stellen in einem Prozess namens Metastasen wandern und zu kolonisieren. Unser Verständnis von, wie die Tumorzellen, die Barrieren durch den Körper auferlegt windet ist immer noch in den Kinderschuhen, aber die Schwellen Bild von der Forschung bisher getan verweist auf eine wiederholte Verwendung von normalen Entwicklungsprozesse und Signalwege von den Krebszellen ^11-13.

Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist enorm, unsere und trugerstanding der normalen Entwicklung und Krankheit durch den Einsatz von hoch entwickelten genetischen Techniken in den vergangenen Jahrzehnten ^{14 bis 17} entwickelt. Mutagenese und Überexpression Instrumente haben wir auf ein besseres Verständnis der verschiedenen Onkogene und Tumorsuppressorgene ^18-22 angekommen. , Tumormetastase ist jedoch ein Ergebnis der Zusammenarbeit mehrerer genetischer Läsionen, die hauptsächlich in Zellkulturmodellen ^23,24 sowie verschiedene Xenograft-Modellen ^25-27 untersucht worden. Diese Modelle aber leistungsstarke haben ihre Grenzen, da sie nicht gänzlich nachvollziehen dürfen die in einem lebenden Organismus gefunden. Außerdem transgenen Modelle in Mäusen sind umständlich und nicht förderlich für die genetische Analyse von invasiven Verhalten ^28,29. Mehrere Studien haben versucht, die Invasion von Tumorzellen in Drosophila ^30,31 verstehen. Diese Techniken nutzen, vor allem die Transplantation von Primärtumoren, um Hosts und dann auf die Verfolgung der tra verlassennsplanted Tumoren für die Invasion von Nachbargeweben ^32,33. Eine leistungsstarke Technik namens MARCM ¹⁰ wurde durch Pagliarini und Xu angepasst, um Tumorinvasion in Drosophila ⁹ modellieren. Dieses elegante genetischen Modellierung der Tumorinvasion nutzte die Zusammenarbeit zwischen einem aktivierten Onkogen und dem Verlust der Zellpolarität. Die Kraft dieser Modellierung besteht darin, dass die invasive Tumoren im intakten Organismus damit umgehen die Notwendigkeit für die Transplantation von Geweben geschaffen. Über die Zusammenarbeit onkogenen bringen, eine aktivierte Onkogen wie Ras ^V12 in Klonen von Zellen in der larvalen Augenantennenscheibe ausgedrückt. Als Ergebnis der MARCM Technik diese Klone auch mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) zur einfachen Visualisierung markiert und homozygot für Zellpolarität wie letalen Mutanten Riesenlarven, scribbled und Scheiben groß gemacht. Das Ergebnis ist GFP markiert invasiven Tumoren in der Kopf komplex. In diesem Bericht, den ichzeigen, wie man zu induzieren, und visualisieren diese invasiven Tumoren sowohl im Kontext eines intakten Larven und in herauspräpariert Kopf komplex. Die hier präsentierten Tumorinduktion verwendet Reagenzien auf dem zweiten Chromosom von Drosophila. In Tabelle 2 I liefert eine Auflistung von Aktien, die an X und ^3. Chromosomen, die für den gleichen Zweck verwendet werden können. Ich glaube, dass diese vereinfachte Protokoll wird diese Technik leicht zugänglich für Forscher, die sich für das Verständnis der molekularen Grundlagen der Tumorprogression zu machen.

Protokoll

1. Induktion von Gutartige Nicht-invasive Tumoren

1. Verwenden Bestände in Tabelle 2 aufgelistet für die Induktion von gutartigen Tumoren.
2. Bereiten Sie eine Starterkultur für die "Tester" Lager der folgenden Genotyp: y, w, ey-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP
3. Bereiten Sie eine Starterkultur für die "getestet" Lager der folgenden Genotyp: w; FRT40A, UAS-Ras ^V12 / Cyo
4. Sammeln Sie zehn weibliche Jungfrauen von der "Tester" Lager und zehn Männer von der "geprüft" Lager.
5. Überqueren Sie die Männer und Frauen von der "Tester" und die "getestet" Lager, indem sie sowohl in einem Fläschchen mit Fliegen Essen.
6. Legen Sie das Kreuz in einem 25 ° C-Inkubator und lassen die Männchen und Weibchen zu paaren und Eier legen für 24-48 Std.
7. Überprüfen Sie die Fläschchen für eine ausreichende Eiablage und auf die Anwesenheit von ersten Larvenstadium sicherzustellen, dass die Kultur nicht austrocknen.
   1. Fügen Sie ein paar Tropfen autoklaviertdestilliertes Wasser zur Kultur, um es feucht zu halten (wenn die Kultur Austrocknung).
   2. Weiter, um die Kultur zu überwachen und wiederholen Sie Schritt 1.7.1 nach Bedarf.
8. Beachten Sie wandern dritten Larvenstadium unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop, wie in Kapitel 3 beschrieben.

2. Induktion von invasiven Tumoren

1. Verwenden Bestände in Tabelle 2 aufgelistet für die Induktion von invasiven Tumoren.
2. Verwenden Sie die Starterkultur aus Schritt 1.2 der folgenden Genotyp: y, w, ey-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP
3. Bereiten Sie eine Starterkultur für die "getestet" Lager der folgenden Genotyp: w; lgl ^4, FRT40A, UAS-Ras ^V12 / Cyo
4. Sammeln Sie zehn weibliche Jungfrauen von der "Tester" Lager und zehn Männer von der "geprüft" Lager.
5. Überqueren Sie die Männer und Frauen von der "Tester" und die "getestet" Lager, indem sie sowohl in einem Fläschchen mit Fliegen food.
6. Legen Sie das Kreuz in einem 25 ° C-Inkubator und lassen die Männchen und Weibchen zu paaren und Eier legen für 24-48 Std.
7. Überprüfen Sie die Fläschchen für eine ausreichende Eiablage und auf die Anwesenheit von ersten Larvenstadium sicherzustellen, dass die Kultur nicht austrocknen.
   1. Fügen Sie einige Tropfen autoklaviertem destilliertem Wasser auf die Kultur, um es feucht zu halten (wenn die Kultur Austrocknen).
   2. Weiter, um die Kultur für Trockenheit und wiederholen Sie Schritt 2.7.1 zu überwachen, wie gebraucht.
8. Beachten dritten Larvenstadium unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop, wie in Kapitel 3 beschrieben.

3. Beobachtung der benignen und invasiven Tumoren

1. Verwenden dritten Larvenstadium der gutartigen Tumor Isolation und Visualisierung.
   1. Befeuchten Sie einen Pinsel in destilliertem Wasser, und mit diesem Pinsel kratzen ein paar dritten Larvenstadium von der Wand des Kulturfläschchen.
   2. Zeigen Larven in einer Vertiefung Schlitten mit 1X PBS und dann mit einem nassen Pinsel Schrotte aus alle Lebensmittel Material aus den Larven Epidermis.
   3. Legen Sie die Larven in einer Petrischale und lassen bei -20 ° C-Gefrierschrank für 30 min, um die Larven zu immobilisieren.
      1. Alternative Methode, um Larven zu immobilisieren mit FLYNAP.
      2. Legen Sie einen Zauberstab in der FLYNAP FLYNAP getaucht, um das Fläschchen aus 3.1.3.2 und nach dem Einstecken das Fläschchen gesteckt let Fläschchen mit Larven stehen für 30 bis 40 min.
   4. Legen Sie die immobilisiert Larve auf einem Glasobjektträger, einen Tropfen Licht Halogenkohlenwasserstofföl, Abdeckung mit einem Deckglas und beobachten unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop mit der Fähigkeit, Green Fluorescent Protein (GFP) zu visualisieren.
   5. Die gutartigen Tumor Lager Larven im Frontzahnbereich, wo die Kopf Komplex vorhanden ist grün fluoreszieren.
2. Wählen Sie Tag 10 Larven (nach Induktion) aus dem Kultur oben in Schritt 2 zur Beobachtung von invasiven Tumoren gesetzt. Tag 10 Larven werden ausgewählt, weil invasive Tumorlager Larven haben einen erweiterten larval Bühne und in der Regel nicht zu pupariate.
3. Folgen Sie den Schritten 3.1.1 bis 3.1.4 außer statt dritten Larvenstadium Verwendung Tag 10 Larven.
   1. Der Tag 10 invasive Tumorlager Larven im Frontzahnbereich, wo die Kopf Komplex vorhanden ist grün fluoreszieren.
4. Wenn die Fluoreszenzmikroskop wird mit einer Digitalkamera ausgestattet, dann nehmen Sie Bilder von der fluoreszierenden gutartigen und invasive Tumorlager Larven.

4. Dissektion der Cephalic Complex und weitere Beobachtung der benignen und invasiven Tumoren

Die durchscheinenden Epidermis der Larve macht es schwierig, das Ausmaß der Invasion von Tumoren zu beobachten. Damit das Ausmaß der Invasion besser durch Zerlegung der komplexen Schädel aus der Larve visualisiert. Die folgenden Schritte sollten genutzt werden, um die komplexen Schädel sezieren.

1. Mit einem nassen Pinsel auswählen dritten Larvenstadium (für gutartige Tumoren) und Tag 10 Larven (für invasive Tumoren) fROM Die jeweiligen Kulturfläschchen.
2. Zeigen Larven in eine Vertiefung einer Dissektion Kaltschale mit 1X PBS. Verwenden Pinsel abkratzen keine Speisereste aus den Larven Epidermis.
   1. Übertragen sauber Larven zu einem frischen und der Dissektion Kaltschale mit 1X PBS.
   2. Prüfen auf das Vorhandensein von GFP-Fluoreszenz mit einem Stereomikroskop zum Aufspüren von Fluoreszenz. Entsorgen nicht-GFP Lager Larven.
3. In 1,0 ml kaltem 1X PBS auf eine frische und auf die Zerlegung Gericht und mit einer Pinzette zu übertragen eine Larve tragen entweder die gutartig oder invasiven Tumoren (der Dissektion Protokoll bleibt für diese beiden Arten von Tumoren).
4. Halten Sie die Larve nach unten mit einer Pinzette zu 2/3rds vom vorderen Ende.
   1. Mit der anderen Pinzette und elegant trennen den hinteren 1/3rd der Larve und entsorgen.
   2. Lassen Sie die vordere 2/3rds der Larve. Da der Druck in der Larve den Inhalt der freiLarve aus der Körperhöhle sickern.
   3. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Darm, Fettkörper und andere Innen Inhalt der Larve, die aus der Körperhöhle sickerte zu entfernen.
   4. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Mund Haken der Larve zu halten und schieben Sie es in den Larven Epidermis und mit der anderen Zange invertieren die Larve vollständig.
   5. Verwenden Sie die Zange, um sanft und vorsichtig die Fettkörper, der Speicheldrüsen, Darm, die Flügelscheibe komplex und keine Trachealtuben. Die Kopf komplexe sollte jetzt von der Mündung des umgekehrten Hakenlarve befestigt sein. Die Gehirnhälften und das Bauchmark (VNC) wäre immer noch zu den Larven Epidermis durch die Nerven von der VNC ausgeh angeschlossen werden.
   6. Verwenden Sie eine Pinzette vorsichtig brechen die Verbindungen zwischen den Nerven und den Kopflarven Epidermis.
   7. Da die Nervenverbindungen zwischen dem VNC und den Larven Epidermis sind gebrochen und überschüssiges Fett und andere Körpergewebe entfernt, die Kopf Complex würde deutlich sichtbar geworden und wird zu den Larven Epidermis nur an den Mundhaken befestigt werden.
   8. Zu den Larven Epidermis befestigt werden Die Kopf komplexen gelassen werden, wenn die Anlage muss für nachgelagerte Anwendungen wie Antikörperfärbung oder zur späteren Visualisierung fixiert werden.
   9. Wenn keine weiteren Downstream-Anwendungen würden dann durchgeführt werden, die Kopf Komplex kann von den Larven Epidermis gelöst und in einem Tropfen Glycerin auf Basis einer Montage Medien zur weiteren Beobachtung und Analyse gelegt werden. Verwenden Vectashield als Montage Medien.

Ergebnisse

Als ein Ergebnis der hier vorgestellten Protokoll der Benutzer in der Lage, gutartigen Tumoren durch Überexpression eines aktivierten Onkogens im Larven Auge Antennen Imaginalscheibe induzieren. Der Benutzer wird auch in der Lage, invasiven Tumoren am Auge Antennenscheibe durch Überexpression eines aktivierten Onkogens in Klonen von Zellen induzieren auch eine Zellpolarität Gen-Mutante. Die Tumoren können leicht mit Hilfe eines Stereomikroskops, wie fluoreszierende "green fluorescent" Gewebe im ganzen Larven oder in Kop...

Diskussion

Krebs ist eine komplexe Erkrankung, die mit heute ein viel besseres Verständnis als in der Vergangenheit. Allerdings bleibt noch viel zu lernen und erklärt, bevor wir ein vollständiges Bild der zugrunde liegenden Mechanismen werden. Die hier vorgestellten einfaches Protokoll ist es möglich, genetisch induzieren benigne und invasiven Tumoren in einem ganzen Organismus zu untersuchen und dann die Biologie mit der Progression von Tumoren in diesem Modell zugeordnet sind. Die meisten der bestehenden Techniken in Drosoph...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10X PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) pH 7,2 Stammlösung	Invitrogen, Sigma Aldrich
Gekühlt 1X PBS pH7,2 Arbeitslösung	Invitrogen, Sigma Aldrich		Frisch machen und kühlen, kann bis zu einer Woche verwendet werden
Flynap	Carolina Biologicals		Fliegenanästhesie zur Betäubung der Larven erforderlich
Fixiermittel	0,1M PIPES, pH 7,2, 4% Paraformaldehyd		Erforderlich, um den präparierten Kopfkomplex
Ice Bucket	Mehrere		Maintain Lösungen auf Eis zu fixieren. Präparieren Sie außerdem den Kopfkomplex in gekühltem 1X PBS und legen Sie ihn dann auf Eis in ein Eppendorf-Röhrchen
1,7 ml Eppendorf-Röhrchen	Verschiedene
Objektträger, Deckglas	Fisher Scientific
Vectashield Eindeckmedien oder andere Einbettmedien	Vector Laboratories
Halocarbon 200 oder 700 Oil	Polysciences Inc. oder Halocarbon.com		Halocarbon 200 wird verwendet, um die Larven für die Visualisierung auf einem Fluoreszenzstereoskop zu montieren
Sally Hansen "Hard as Nails" Nagellack	Ist in jedem Gemischtwarengeschäft		Wird benötigt, um die Kanten von Deckglas zu versiegeln
Ein Leica MZ16.5 Fluoreszenz-Stereomikroskop oder ein anderes Fluoreszenz-Stereomikroskop	Leica und andere		Wird benötigt, um die GFP-Fluoreszenz in Larven
zu beobachten Dumont #5 Pinzette	Fine Science Tools
Pyrex 9 Well Spot Plate oder jede andere Sezierschale	Sigma Aldrich
Pinsel	Kann in jedem Gemischtwarengeschäft
Table 1. Materialien, die zur Durchführung des in diesem Artikel vorgestellten Versuchsprotokolls benötigt werden.