Methodenartikel

Die intrazelluläre Aufnahme, Sinnes Field Mapping und Kultivierung identifizierten Neuronen in der Leech, Hirudo medicinalis

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DOI:

10.3791/50631

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4. November 2013

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1Department of Biology, University of Kentucky, 2Department of Biology, College of Science, University of Salahaddin, Iraq, 3Department of Neurobiology and Cognitive Neuroscience, SISSA, Italy

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt drei Nervensystem Präparate mit Blutegeln: intrazelluläre Aufnahme von Neuronen im ventralen Ganglien, die Kultivierung von Neuronen ventralen Ganglien, und der Aufnahme von einem Patch von innerviert Haut Sinnesfelder abzubilden.

Zusammenfassung

Der Süßwasser Blutegel, Hirudo medicinalis, ist eine vielseitige Modellorganismus, die verwendet wurde, um wissenschaftliche Fragen in den Bereichen der Neurophysiologie, neuroethology und Entwicklungsbiologie befassen. Das Ziel dieses Berichtes ist es, experimentelle Techniken aus dem Blutegel-System in einem einzigen Artikel die von Nutzen für Physiologen mit Know-how in das Zentrale Nervensystem Zubereitungen oder Biologie-Studenten mit wenig oder keiner Erfahrung sein Elektrophysiologie wird sich konsolidieren. Wir zeigen, wie man die Blutegel für die Aufnahme von intrazellulär identifiziert neuronalen Schaltkreise im Ganglion sezieren. Weiter zeigen wir, wie einzelne Zellen von bekannten Funktion kann von der Ganglien in einer Petrischale kultiviert werden, und wie man von diesen Neuronen in Kultur aufzeichnen entfernt werden. Dann zeigen wir, wie man einen Patch von innerviert Haut zur Abbildung sensorische oder motorische Felder verwendet werden vorzubereiten. Diese Blutegel Vorbereitungen sind immer noch weit verbreitet, um die grundlegenden elektrischen Eigenschaften der neuronalen Vernetzung Adresseks, Verhalten, Synaptogenese und Entwicklung. Sie sind auch eine entsprechende Ausbildungsmodul für Neurophysiologie oder Lehrlabors.

Einleitung

Der Blutegel Zubereitung nützlich für die Untersuchung der Funktion von identifizierbaren (sensorischen, motorischen und Interneuronen innerhalb des Tieres zentralen Nervensystems (ZNS). Das nützliche Eigenschaft Blutegel Neuronen ist, dass die Form ihrer Aktionspotentiale und biophysikalischen Eigenschaften charakteristisch für a sind gegebenen Zelltyp (dh P, N, T, Rz). Außerdem Neuronen aus dem Tier und kultiviert in einem geeigneten Medium, in dem die Zellen behalten ihre elektrischen Eigenschaften so lange wie 45 Tage 1,2 entfernt werden.

Ein deutlicher Vorteil des Blutegels Ganglion zum Erlernen elektrophysiologischen Ableitungen machen, ist, dass die Zellen charakteristisch und zuverlässig im Ganglion in einem Muster angeordnet, das ermöglicht Identifizierung von unterschiedlichen Zelltypen aus Ganglion Ganglion und von Tier zu Tier. Die einzigartige Lage und die Morphologie von Neuronen im Blutegel Ganglien wurden von Retzius so früh wie 1891 3 notiert haben. Kenntnisse über the Identität und Funktion eines Neurons für die Untersuchung neuronaler Schaltkreise und für die Herstellung von Versuchen mit einem bestimmten Zelltyp vorteilhaft. Aufgrund der relativ großen Zellkörper der Neuronen innerhalb einer Ganglien sie mit einem Binokular sichtbar sind, und die Zellkörper selektiv mit Mikroelektroden zur Aufzeichnung ihrer elektrischen Eigenschaften aufgespießt werden.

Farbstoffe und große Moleküle in einzelne Zellen und Kanaleigenschaften studierte von Patch-Clamp-injiziert werden. Ionenströme, die Anlass zu den verschiedenen Formen der charakteristischen Aktionspotentiale in den verschiedenen Neuronen identifiziert worden 4-7. Aus Untersuchungen in dem Muster der Innervation und Verzweigungen von individuellen Neuronen im ZNS sind die synaptischen Verbindungen in der Kultur mit 2,8 Neuronen identifiziert reproduziert. Studien in den Ganglien Blutegel haben Einblick in die Entwicklung von Funktionskreise, die mit der Elektrophysiologie als auch mit Gr gemessen werden können, zur Verfügung gestelltE tierischen Verhaltensforschung. Der Blutegel CNS hat auch als wertvolle Vorbereitung für die Untersuchung von Mechanismen der neuronalen Reparatur und Regeneration in der gesamten Tier-und in der Kultur 4-6,9-12 beteiligt serviert.

In Säugetier Gehirn es ist eine gewaltige Aufgabe, das Verhalten in Bezug auf die Eigenschaften und Verbindungen einzelner Neuronen identifiziert erklären. Im Prinzip kann man hoffen, dass die Studie von weniger komplexen Systemen wie der Blutegel könnte helfen, grundlegende Mechanismen bei höheren Tieren verwendet definieren. Die Verbindungen, die verwendet werden, die ein Bad-Muster 13,14 und Rhythmik des Herzens 15 zugrunde liegen, wurden auch in der Blutegel aus. Die Fähigkeit einiger Blutegel Neuronen sowohl elektrische und chemische Kommunikation bilden, ist verblüffend. Einige Verbindungen sind bidirektional, während andere unidirektionale chemisch, sondern bidirektionale elektrisch 7. Das Verständnis der synaptischen Verbindungen im Tier sowie Neuerstellung der gleichen type von Verbindungen in einer Kulturschale sind leistungsfähige Werkzeuge für die Untersuchung Synaptogenese 16-18 sowie pharmakologischer Profilierung der Synapsen 19. Die hier beschriebenen intrazellulären Aufnahme-und Stimulationstechniken bieten eine Grundlage für pharmakologische Tests und Forschung in neuroethology und Entwicklung.

Darüber hinaus kann die Segmentbauchmark mit einem Patch von innervierten Haut seziert werden. Mit der Fähigkeit, einen Patch von Haut und die Nervenzellen am Leben zu halten, können sensorische rezeptiven Felder durch Aufzeichnung elektrischer Signale aus dem Zellkörper (dh Soma) von sensorischen Neuronen innerhalb der jeweiligen Abdominalganglion im ZNS untersucht werden. Dadurch kann man die Empfindlichkeit der sensorischen Endungen indem unterschiedliche Grade der Kraft auf die Haut beurteilen und Karte rezeptiven Felder: leichte Berührung, Druck, und schädliche (schmerzhafte) Reize 20,21.

Ein Vorteil dieser Blutegel Ganglien Vorbereitung der Haut ist, dass man ca.n ziehen anatomisch das rezeptive Feld Karte und Spuren die neuronalen Prozesse, die der identifizierten Neuron, sobald die elektrischen Antworten aufgezeichnet werden. Die im Folgenden beschriebenen drei Blutegel Experimente können alle mehrfach mit einem einzigen Exemplar, das diese eine kostengünstige Lehrmodul für wissenschaftliche Laboratorien macht abgeschlossen sein.

Protokoll

1. Herstellung von Elektroden und Kochsalzlösung

  1. Bereiten physiologischer Kochsalzlösung und Elektroden, bevor das Tier seziert. Leech Ringer-Lösung besteht aus den folgenden: 115,3 mM NaCl, 1,8 mM CaCl 2, 4,0 mM KCl, 10 mM Tris / Maleinsäure oder HEPES. Den pH-Wert auf 7,4.
  2. Bereiten Sie eine Ag-Cl Draht durch Eintauchen eines gereinigten Silberdraht in eine kleine Menge von Bleichmittel für 20 Minuten oder bis der Draht hat eine glatte dunkelgrauen Finish. Waschen, bevor Sie den Draht mit destilliertem Wasser. Dann legen Sie den Draht in einer Mikropipette Halter, der in den Verstärker angeschlossen wird.
  3. Bereiten Sie eine scharfe Glaselektrode aus Borosilikatglas mit einer Pipette Magnet. Die Elektrode Widerstand sollte in der Größenordnung von 20 MOhm sein.
  4. Hinterfüllen der Pipette mit 3 M Kaliumacetat-Lösung und stecke in in die Mikrohalter.
  5. Für eine extrazelluläre Elektrode herzustellen eine scharfe Glaspipette, wie oben beschrieben, brechen Sie die Spitze zurückReiben andere scharfe Pipette in der Nähe der scharfen Kante. Dann feuern polieren die Spitze, so dass es nicht die Verknüpfungen zu reißen. Kunststoff extrazellulären Elektroden wird auch funktionieren, solange ein guter Kontakt zwischen der Elektrode und dem Nerv.
  6. Legen Sie die extrazelluläre Aufnahme-Elektrode in eine Mikropipette Halter (mit Ag-Cl-Draht), die mit einem Gummischlauch und Spritze zum Absaugen wird. Mit der Spritze Kochsalzlösung in der Elektrode zumindest auf das Niveau der Silberdraht zu ziehen.
  7. Richten Sie die Hardware (Verstärker und Stimulus Isolator) und Software-Aufzeichnungsparameter, indem Sie das Handbuch für Ihre speziellen Signalaufnahmeeinheit. Siehe Leksrisawat et al., Um Details über 22 Geräte in den nachfolgend beschriebenen Experimenten verwendet anzuzeigen.

2. Bauchganglion Dissection

  1. Präparieren Sie die Blutegel in einer großen Silikon-Elastomer ausgekleideten Schale mit Blutegel Ringer-Lösung. Wenn das Tier in Längsrichtung gestreckt wird esleichter sein, die Bauchmark (siehe Abbildung 1A) zu entfernen.
  2. Mit # 10 oder # 11 Größe Skalpell einen Längsschnitt mit sehr flachen Schnitte in der ventralen Mittellinie. Um die Mitte 2/3rd ventralen Schnitt ist in Fig. 1B gezeigt. Versuchen Sie nicht, durch den schwarzen Strumpf (die ventrale Blutsinus) schneiden, bis das Tier vollständig geöffnet und ohne Knicke das Blut Sinus gestreckt wird. Dieses Blut Sinus läuft über die Länge des Tieres entlang der ventralen Mittellinie. Der VNC ist innerhalb dieses Blutgefäß enthalten ist.
  3. Nachdem die Haut wurde über die volle Länge des Tieres geschnitten nutzen die feinen Iris Schere, um das Blut nick Höhle (Abbildung 2). Rutsch eine Klinge der feinen Iris Schere unter der Sinus und die Klinge, um sie vom Nervengewebe zu trennen leicht anzuheben. Schneiden Sie den Sinus die Länge des VNC unter Vermeidung der Nervenwurzeln, segmentale Nerven oder die Verknüpfungen zwischen den Ganglien.
  4. Dann entfernen Sie Teil der Bauchmark vonSchneiden Sie die Wurzeln distal, wo das Blutgefäß verbindet die Wurzeln. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Ganglien entlang der Länge des Bauchmark.
  5. Übertragen eines Segments aus einem oder zwei Ganglien zu einer kleineren Petrischale. Die Ganglien oder die einzelne Ganglien muss straff mit etwas locker festgesteckt zu werden.
  6. Stecken Sie die Verknüpfungen und die Wurzeln, so dass die Ganglien Glia-Hülle wird leicht gedehnt, um die Neuronenzellkörper aus, um sich beim Aufspießen durch die Glia-Hülle und in das Neuron von Interesse zu verhindern. Die Stifte sollten durch die schwarze Sinus für die Wurzeln und in der Mitte der beiden Verknüpfungen zu einer Schädigung der Axone (Fig. 3) zu minimieren, angeordnet werden.
  7. Legen Sie die Petrischale mit der Vorbereitung unter dem Mikroskop und sichern Sie sie mit Wachs an der Unterseite der Schale, um die Bewegung zu verhindern.
  8. Sorgfältig fokussieren den Lichtstrahl mit einem Spiegel und Licht Kondensator, um die Neuronen wie in 4A sehen (schematisch in 4B gezeigt ). Beachten Sie die beiden großen Retzius Zellen in der Mitte des Ganglions.
  9. Um eine intrazelluläre Aufnahme des Rz, T, P, und N-Neuronen zu machen, vorsichtig die Spitze der Elektrode über der Zelle von Interesse und senken Sie die Spitze, bis ein Grübchen in der Glia-Mantel gesehen.
  10. Tippen Sie auf den Elektrodenhalter oder Manipulator (sehr vorsichtig), so dass die Elektrodenspitze "Pops" in die Zelle von Interesse.
  11. Spritzen Sie kurze Impulse (30-40 ms) von positiven Strom (1-10 nA) in die Zelle, um Aktionspotentiale hervorzurufen.

3. Die Kultivierung von Neuronen der ventralen Ganglion Vorbereitung

  1. Pin der Ganglien ventralen Seite nach oben in eine saubere Schale mit L-15 mit fötalem Kälberserum (FCS) (Abbildung 3). Pin den Wurzeln, so dass die Ganglien sind leicht gestreckt, wie oben für intrazelluläre Ableitungen getan. Mit einer feinen Schere, nick die Gliazellen Kapsel an einem Ende, rutsch ein Scherenklinge unter der Kapsel, dann über die Glia-Kapsel geschnittenwie in Fig. 5A gezeigt.
  2. 100 l Aliquot von Collagenase / Dispase in die Schale und auf einem Schüttler für 15 min. Untersuchen Zellen, indem die Kulturmedien um die freiliegenden Zellkörper. Bringen Sie die Zellen, die Schüttler für weitere 15 Minuten oder länger, bis die Zellen kommen mit minimalen Absaugung.
  3. Verwenden Sie eine Pipette auf eine Spritze, um sanft zu extrahieren Zellen aus dem Ganglion angebracht. Feuer polieren die Pipettenspitze, so dass sie etwas größer als die Zellenkörperdurchmesser. Rz für Zellen in einem erwachsenen Blutegel sollte der Durchmesser etwa 50 &mgr; m sein.
  4. Bereiten Sie eine Vielzahl von Pipetten mit unterschiedlichen Durchmessern, ohne einen Faden, da dies verringert die Chancen der Zellen stecken im Inneren der Pipette. Bewahren Sie die Pipetten in eine Flasche mit 80% Ethanol (EtOH) mit einem Wattebausch auf der Unterseite, um die Spitzen von Chipping schützen. Denken Sie daran, die EtOH mit Medium vor Absaugen Zellen zu waschen aus der Pipette.
  5. Nach der Enzymbehandlung, waschen Sie dieenzymhaltigen Medium mit L-15 (mit FCS) 2x. Identifizieren Sie die Zellen von Interesse und sanft ziehen sie in die Pipette, indem Sie die Spritze (6A). Entladen Sie die abgesaugt Zellen in ein anderes Gericht, das L-15 (mit FCS) enthält.
  6. Bis jetzt waren alle Verfahren nicht steril. Führen Sie die folgenden Schritte in einer sterilen Haube. Platzieren 3-4 große Tropfen von sterilem L-15 (mit FCS) an verschiedenen Stellen in einer sterilen Petrischale.
  7. Pipettieren Sie die Zellen in eine der vor genannten Tropfen, um bläst sie in der Drop, um sie zu waschen. Wiederholen Sie diesen Vorgang in Serie in 3 oder 4 Tropfen Medium.
  8. Zeigen Zellen in einer Petrischale mit sauberen L-15 gefüllt (mit FCS).
  9. Inkubieren der Zellen für 1-24 h bei Raumtemperatur. Danach können die Zellen sauber beschichtet werden. Nach dem Verlassen der Zellen für ein paar Stunden oder über Nacht die extrazelluläre Matrix löst sich leicht. Platte die Zellen sofort auf mehr Prozesse erzeugen.
  10. Verwenden sterilen Substrat zu beschichten, eine Mikrowell-di sh und lassen Sie es vollständig trocknen lassen (über Nacht), bevor die Kultivierung Experimenten.
  11. Nachdem die Schale beschichtet worden ist, Waschen der Schale vorsichtig mit sterilem Wasser und dann mit einer kleinen Menge des L-15-Medium. Denken Sie daran, die L-15-Lösung ohne FCS verwenden hinzugefügt, damit die Zellen an der Schale haften. Das Medium kann leicht zu L-15 geändert werden mit FCS, nachdem die Zellen an dem Substrat haftet. Wenn die Zellen bis zu einigen Stunden nach dem Ausplattieren, wird das Schaltmedium, um L-15 mit FCS verwendet werden, sind nicht notwendig.
  12. Positionieren der Zellen nebeneinander bei der Beschichtung um eine schnelle Synaptogenese (6B) zu induzieren. Nach 24 Stunden Maßnahme physiologische Aktivität in Paarungen von Neuronen.
  13. Verwenden intrazelluläre elektrophysiologische Techniken, um RP oder synaptische Antworten in kultivierten Paare von Zellen aufzeichnen (stimulieren ein Neuron durch eine intrazelluläre Elektrode und Rekord Antworten vom gepaart Zelle unter Verwendung einer zweiten intrazellulären Elektrode).
Titel "> 4. Ganglion Körper-Wand Vorbereitung

  1. Pin der Blutegel dorsalen Seite nach unten in ein Elastomer ausgekleideten Schale wie oben beschrieben.
  2. Pin der Haut zu einer Seite mit Wurzeln auf der anderen Seite des abgetrennten Ganglion (7A, 7B in vergrößert) oder machen ein Fenster auf der ventralen Aspekt der Blutegel über ein Ganglion (7C) mit allen Wurzeln, um den Körper Wand intakt.
  3. Nach dem Erhalt einer stabilen intrazelluläre Aufnahme in eine der Sinneszellen (T, P, N) mit einem kleinen Glasstab, die Feuer poliert wurde, um die Haut im gleichen Segment leicht berühren. Wenn das Neuron aus aufgezeichnet ist eine N Zelle dann mehr Druck muss auf die Haut aufgetragen werden. In den meisten Fällen wird der N Zelle nur zu reagieren, wenn die Haut mit einer Pinzette eingeklemmt wird. Aus diesem Grund sollten diese Zellen das letzte mal versucht wie man die Haut schädigen oder zu verdrängen, den intrazellulären Umkodierung von stören die Vorbereitung auf eine solche Weise werden.
  4. Man sollte sichLage, schnell skizzieren die Haut und Ganglien mit Details ausreichend genug, dass eine Karte, wo man berührt verwendet werden, um die rezeptiven Feld für einen bestimmten Neuron zu bestimmen. Nach der Aufnahme von so vielen T-und P-Zellen wie möglich auf beiden Seiten einer Ganglien versuchen die N Zellen.
  5. Um zu untersuchen, ob die sensorischen Neuronen haben Prozesse, die durch die Verknüpfungen in einem rostralen oder kaudalen Weise und dann aus den Wurzeln in der angrenzenden Segment der Haut fahren, können die Verknüpfungen zwischen den Ganglien geschnitten werden und die rezeptiven Felder erneut untersucht in Bezug auf die Ausbreitung der Detektion. Grundsätzlich ist eine Prüfung, wenn es zu einem Verlust in dem Empfangsfeld.

5. Injizieren Fluoreszenzfarbstoffe

  1. Bereiten Sie einen Blutegel Ganglion wie oben beschrieben.
  2. Füllen Sie eine Mikroelektrode mit einer Lösung von Lucifer Gelb-CH (3,0%) und Lithiumchlorid (300 mM).
  3. Aufspießen einer der Sinneszellen oder Zellen Rz auf der Bauchseite des Ganglions, wie beschrieben,oben.
  4. Injizieren Farbstoff in der Zelle, indem negative Strom (3nA) durch die Elektrode für 15 min. Stellen Sie die Impulsdauer auf 100 ms und die Frequenz 2 Hz.
  5. Visualisierung der Farbstoff gefüllten Neuronen durch Anregung des Farbstoffs mit einer Quecksilberlampe und einem FITC / GFP-Filtersatz.

Ergebnisse

Intrazelluläre Aufnahmen von sensorischen Neuronen im Blutegel Ganglion sich durch ihre in 4C gezeigt unterschiedlichen Spannungs-Zeit-Spuren aus. Die Ruhezellmembranpotential bei gesunden Blutegel Ganglienzellen ist -45 bis -60 mV. Wenn Potenziale sind kleiner (weniger negativ) sollte man die Glaselektrode zu ändern, oder wenn das Potenzial ist immer noch niedrig ist, gehen Sie zu einem anderen Segment des Nervenstrang. Spontanen Aktionspotentiale mit kleiner Amplitude kann anzeigen, dass die Elektrode in einem Motor Neuron. Wenn dies geschieht in der Ganglienkörperwand eine Strominjektion kann verwendet werden, um festzustellen, ob das Neuron innerviert alle Muskeln, noch auf der Haut befestigt werden. Der Ringraum erector Motor Neuron (AE) ist auf der Bauchseite des Ganglions (4B) und es führt dazu, dass die Ringe (Rippen oder Segmente), um durch die Aktivierung der Ringmuskel Rückens steigen.

Einspeisen von Strom in den Sinneszellen sollten Aktionspotential hervorzurufens mit den in Fig. 4C gezeigten charakteristischen Kurven. Wenn die Wellenformen anders aussehen es aufgrund einer Verstimmung der Brücke oder Offset-Kapazität Entschädigung sein könnte. Man sollte das Handbuch, die die Signalerfassungseinheit für Details, wie die Brücke in einer Zelle auszugleichen begleitet konsultieren. Beachten Sie die Stimulus-Artefakte am Anfang und Ende der Stromimpulse in 4C. Dies ist, wie die Artefakte zu suchen, wenn die Brücke abgeglichen ist.

Primärkulturen von Neuronen aus dem Blutegel Ganglion bilden elektrische und chemische Synapsen im Gericht. Zunächst werden die elektrischen Eigenschaften der kultivierten Zellen sind nicht genau die gleichen wie sie in vivo sind. Doch nach ein paar Tagen die Impulse sind fast nicht zu unterscheiden von den in den Ganglien aufgezeichnet. Dies ist in Fig. 6C mit einem Paar von Rz Zellen gezeigt. Nach 7 h in Kultur die Amplitude der synaptischen Potentiale war 1-2 mV. Nach 56 h in Kultur synaptic Potentiale waren größer als 10 mV (Spitze Spuren in 6C). Die Form des Aktionspotentials ändert sich auch nach 56hr in Kultur. Unter den beschriebenen Bedingungen sind diese Zellen für mehrere Tage lebensfähig.

Die interzelluläre Kommunikation kann durch die Stimulierung der Nervenwurzeln oder Verknüpfungen und der Aufnahme von Neuronen im Ganglion nachgewiesen werden. Stimulation dieser Nerven erzeugt robuste synaptische Potenziale und Aktionspotentiale in den verschiedenen Ganglienzellen. Spuren in 8B wurden aus einer Retzius Zelle in einem Ganglion, die aus dem Tier entfernt und in eine Schüssel fixiert worden war, aufgezeichnet. Die schwarze Kurve wurde von einem unterschwelligen Reiz mit einer extrazellulären Elektrode mit der Binde angewendet hervorgerufen. Die Erhöhung der Reizspannung verursacht die Zelle, um ein Aktionspotential (rote Kurve) zu feuern. Fluoreszierende Farbstoffe oder Meerrettich-Peroxidase in diese Zellen eingespritzt, um ihre Morphologie zu untersuchen. Lucifer Gelb wurde in einem Rz injiziertNeuron, indem ein negativer Strom durch die Elektrode. Eine Alternative ist, den Farbstoff zu injizieren mit Druckluftstößen. 9A zeigt den Farbstoff kurz nach der Injektion begann. Dreißig Minuten später war der Farbstoff bereits in die Nervenwurzeln (9B) gestreut. Die Art der Farbstoff hängt von der Anwendung, z. B. niedermolekulare Farbstoffe, die durch gap junctions passieren können, werden verwendet, um elektrische Synapsen zu identifizieren.

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Fig. 1 ist. . Ventralen Blutegel Dissektion (A) Das Tier wird gründlich in einem Elastomer ausgekleideten Schale mit Kochsalzlösung gefüllt Blutegel merken Bauchseite nach oben (B) Eine flache Einschnitt überspannt den vorderen:. Hintere Achse wird nur lateral der Mittellinie, um eine Beschädigung der Nerven Mark. Das schwarze Blut Sinus (die Contains das Bauchmark) kann leicht gesehen werden. Beachten Sie das eine freiliegende Ganglien, die verglichen mit dem Mantel ist weiß. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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Abbildung 2. Dissektion der schwarz Höhle. Das Blutgefäß (Pfeil) sollten sorgfältig auf einer Seite geschnitten, um das Bauchmark (Doppelpfeil) freizulegen. Lassen Segmente des Blutgefäßes intakt rund um die Segment Wurzeln für den Einsatz als Handgriff zu manipulieren das Bauchmark bei der Übertragung zwischen Präparation und Aufnahme Gerichte. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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Abbildung 3. Isolated Abschnitt der Bauchmark. Abstecken Bauchmark von den übrigen auf den Segment Wurzeln Blutgefäßfragmente und an den Enden der Segment Verknüpfungen macht die Ganglien für die elektrophysiologischen Ableitungen. Ein straff Dehnung der Ganglien ermöglicht es, die identifizierbare Zellkörper zu sehen und wird ein leichteres Eindringen der Glia-Hülle mit einem scharfen Glaselektrode ermöglichen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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4. Zelluläre Anatomie des Blutegels Ganglion. (A) Idealerweise werden die Retzius-Zellen (R) und andere große Zellkörper (P-Presseure, T-Touch, N-nozizeptiven, AE-Ring erector) wird Schematische Darstellung von Zellen in der Ganglien deutlich sichtbar sein, wenn das Mikroskop und Lichtkondensor richtig eingerichtet sind. (B). Leichte Unterschiede in der Lage der Somen wird in jedem Ganglion durch, wie die Ganglien gestreckt und fixiert straff auftreten. (C) Aktionspotentiale aus der Soma dieser Neurone aufgezeichnet haben charakteristische Wellenformen. Diese Spitzen wurden durch Injektion positiver Strom in die Zelle (Rechteckimpuls überlagert die Spannungs-Zeit-Spuren) hervorgerufen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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Abbildung 5. Desheathing das Ganglion, einzelne Zellkörper zu entfernen. (A) Die Glia-Mantelsollte sorgfältig über die Ganglien geschnitten werden, um schädliche Zellen von Interesse zu vermeiden. Die rote Linie zeigt einen Schnitt trifft das Soma der Rz Neuronen zu vermeiden. Das Öffnen der Hülle gibt den Verdauungsenzymen Zugriff auf das Bindegewebe Matrix. (B) Gesunde Zellkörper aus dem prall Ganglion nach der Glia-Hülle geöffnet wurde. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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Abbildung 6. Kultivierung Neuronen aus dem Blutegel Ganglion. (A) Zellen werden aus der Ganglien abgesaugt mit einer Mikropipette und eine Schale mit Kulturmedium überführt. (B) Anzeige mehrere Zellen nebeneinander wird die Rate der Synaptogenese zwischen identifizierbaren Neuronen zu erhöhen. Hier ist die stumps von zwei Neuronen haben eine Synapse in Kultur zeigen leicht unterschiedliche elektrische Eigenschaften gebildet. (C) Neuronen. Die Top-Spuren zeigen synaptischen Potentiale durch die Stimulierung der benachbarten Zelle 7 Stunden und 56 Stunden, nachdem die Zellen wurden plattiert hervorgerufen. Die unteren Spuren wurden durch Injizieren von Strom direkt in einen der Rz-Zellen hervorgerufen. Beachten Sie die Erhöhung der synaptischen Potentialamplitude und ändern Sie in der Aktionspotentialwellenform nach 56 h in Kultur. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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Abbildung 7. Der Blutegel Ganglienkörperwand Vorbereitung für die Zuordnung rezeptiven Felder. (A) Ein Ansatz ist, einen ganzen Abschnitt der Körperwand zusammen mit 1-3 Ganglien zu entfernen. Hier werden die Wurzeln auf der einen Seite haben been Schnitt und die Ganglien wurde zur Seite merken. (B) A out merken Ganglion bei höherer Vergrößerung. (C) Ein weiterer Ansatz ist ein kleines Fenster in der Körperwand und Aufnahme von der intakten Ganglien zu schaffen, während die Zuordnung eines rezeptiven Feldes . (DG) Jedes der sensorischen Neuronen eine charakteristische Antwort auf eine mechanische Reiz. (d) eine leichte Berührung hervorruft Aktivität in T-Zellen, aber nicht in P-oder N-Zellen. (E) Die T-Zell-Antwort schaltet in Reaktion auf stärkere Stimuli, weicht Aktivierung des P-Zelle. Als der Reiz stärker die N-Zellen bekommt wird aktiviert (FG). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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Figure 8. evozierte Aktivität in der Blutegel Ganglion. Extrazelluläre Stimulation der Verknüpfungen kann zur synaptischen Übertragung im Nervenstrang zu fahren. (A) Dies wird durch die Anbringung eines Saug-Elektrode zu einer der Verknüpfungen und Anlegen einer kleinen Spannung getan. Die scharfe Glaselektrode (Pfeil) zu sehen spießte eine Retzius Zelle in der Ganglien werden. (B) Spannungszeit-Spuren, die die Reizartefakt, gefolgt von einer synaptischen Potential (schwarz) und ein Aktionspotential (rot). Klicken Sie hier, um zu vergrößern Bild .

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Abbildung 9. Injizieren Farbstoff in Blutegel Neuronen. (A) Lucifer Gelb können, indem Strom thro in die Soma injiziert werdenugh die Aufnahme Mikroelektroden. Eine Quecksilberlampe und FITC-Filtersatz kann dann verwendet werden, um die Fluoreszenz zu visualisieren. (B) Dye hat in den Rz diffuses Axone etwa 30 Minuten nach der Injektion. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Diskussion

Der Zweck dieser Versuchsreihe betrug 1) von identifizierbaren Neuronen lehren und zeigen die Grundprinzipien der intrazellulären Aufzeichnungen und 2), um die charakteristischen Formen der elektrischen Signale, die von diesen bestimmten neuronalen Typen mit adulten Blutegel entstehen erkennen. Es gibt eine reiche Geschichte von Untersuchungen mit Hilfe der Blutegel für die neurophysiologische Untersuchungen und Forschung ist im Gange in ein auf Fragen der neuronalen Schaltkreise und Gen-Regulation während der Entwicklung als auch bei der synaptischen Reparatur und Regeneration 10. Neuromodulation, insbesondere durch biogene Amin Wege, hat auch in der Blutegel eine erfolgreiche Forschungsrichtung. Durch die Zugabe von Dopamin und anderen pharmakologischen Mitteln des Nervensystems durch die Kochsalzlösung, hat sich gezeigt, dass Dopamin moduliert neuronale Netzwerke in Entscheidungs ​​23 und Bewegungsmuster für das Crawlen 24,25 Verhalten beteiligt. Dieser experimentelle Ansatz ist ein einfle (und kostengünstige) Weg, um Modulation in die Lehre zu integrieren Labor und Einstellen der ionischen Zusammensetzung der Salzlösung ist ein effektiver Weg, um die Nernst und Goldman-Hodgkin-Katz-Gleichungen zu lehren.

Um erfolgreich mit den Ganglien Vorbereitungen sein, ist es wichtig, dass vor dem Versuch, eine Soma mit einem intrazellulären Elektrode stecken das Ganglion straff. Ansonsten wird das Soma zu bewegen, wenn Drücken des Glia-Paket. Darüber hinaus, wenn das Ganglion desheathing zum Entfernen von Neuronen für Kultur, vermeiden Sie die Region von Interesse, wenn quer durch das Ganglion so Somen nicht beschädigt werden, da sie entfernt werden. Auch kann eine übermäßige Inkubation der Enzyme in die Neuronen als zu zerbrechlich zu entfernen führen. Es erfordert einige Versuch und Irrtum, um eine ideale Inkubationszeit zu erreichen, weil jede Reihe von Enzymen ist in ihren Handlungen etwas anders.

Weitere Untersuchungen zu Kulturmedien zu optimieren könnte diese Technik zu verbessern. Varischiedenen Faktoren, wie die Anwesenheit von Insulin, Zucker oder Wachstumsfaktoren könnte für längere Aufrechterhaltung der Kulturen untersucht werden. Um festzustellen, wenn die Zellen ihre Fähigkeit, Sender, wie zB Serotonin-Synthese in Rz Zellen synthetisieren zu halten, können neutral-Rot-Färbung angewendet werden, um serotonerge Prozesse kennzeichnen. Auch Mikroglia-Invasion, um verletzte und regenerierende Gewebe kann durch Kern Flecken Tage nach einer Verletzung quantifiziert werden.

Obwohl dieser Zubereitung hat viele Vorteile für die bei der Prüfung der Regeneration und Reparatur sowie neuronalen Schaltkreise zu bieten, die pharmakologische und molekulare Identifizierung der verschiedenen Rezeptor-Subtypen an Synapsen wurden nicht vollständig charakterisiert. Ein exprimierten Sequenz-Tag-Bibliothek ist 26 und der medizinische Blutegel Genom wird derzeit montiert 27, aber die Hauptbegrenzung im Blutegel-Modell im Vergleich zu einigen Präparaten ist die Fähigkeit, das Genom zur selektiven Genen in bestimmten Zelltypen zu ändern. In Embryonen tseine Einschränkung wurde durch die Injektion von DNA oder dsRNA, die Genexpression regulieren 28 angesprochen. Die Gen-Kanone Technik wurde kürzlich verwendet, um wirbellosen Connexin (innexin)-Proteine ​​in Nervenzellen Blutegel auszudrücken. Die Expression eines innexin aus Hirudo verbana (HVE-inx6) ist ausreichend für die Bildung einer Eileiter gap junctions in der medizinischen Blutegel 29. Die Blutegel-oder H. Eisenkraut, wie es ist, 30 waren sicher, unser Verständnis der Physiologie und Entwicklung von elektrischen Synapsen in den nächsten Jahren voranzutreiben.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
SylgardDow Corning182-Silikon-Kit
NaClSigma-AldrichS7653
KClSigma-AldrichP9333
CaCl2Sigma-AldrichC5670
Tris/MaleinsäureSigma-Aldrich
Bleiche Sigma-AldrichZum Chloridieren des Silberdrahts
NaOHSigma-Aldrich221465Zur pH-Einstellung
HClSigma-AldrichH1758Zur pH-Einstellung
Collagenase/DispaseBoehringer Mannheim269-638
Leibovitz L-15 mit L-GlutaminGibco041-01415H
Fötales KälberserumReady Systems Ag
04-001
D-Glucose-MonohydratMerck8342
Gentamycin-Sulfat beliebiger Lieferant10 mg/ml
GlutaminGibco043-0503H
HEPESSigma3375Freie Säure, kristallin
Concanavalin A Typ IVSigmaC 2010
Poly-L-Lysin-HydrobromidSigmaP 7890MW 15–30.000
 Mikroplatte, 60 x 10 μlFalcon3034Flacher Boden, 10 pro Beutel
PräparationswerkzeugeWorld Precision InstrumentsSatz
Intrazelluläre Elektrodensonde
Faraday-Käfig
InsektennadelnFine Science Tools, Inc26001-60
Präparationsmikroskop (100X)
Lichtleiterlampe
Kleiner verstellbarer SpiegelZum Lenken des Lichtstrahls auf die Präparation.
Glas-ElektrodenSigma-AldrichCLS7095B5XSchachtel mit 200 Stück, Saug-Elektroden
MikromanipulatorWorld Precision InstrumentsMD4-M3-R Kann an der Basis oder an einer Metallstange befestigt werden
Erhöhter Präparationsständer
Silberdraht (10/1.000 Zoll)A-M Systems782500
Computerbeliebiges Unternehmen
AC/DC-DifferenzverstärkerA-M SystemsModell 3000
PowerLab 26Tfigure-materials-1 AD Instruments27T
Kopfverstärkerfigure-materials-2 AD InstrumentsWird mit AC/DC-Verstärker geliefert
LabChart7figure-materials-3 AD Instruments
Elektrische Leitungenbeliebiges Unternehmen
Glaswerkzeuge selbst hergestelltZum Manipulieren von Nerven
Kabel und Steckerbeliebiges Unternehmen
Pipetten mit Gummiball Fisher Scientific13-711-7Schachtel mit 500 Stück
Bechergläserbeliebiges Unternehmen
Wachs oder Modelliermassebeliebiges Unternehmen oder örtliche Geschäfte
StimulatorGrass InstrumentsSD9 oder S88
Kunststoffspitze für Saug-Elektrodeörtlicher Baumarkt (Marke Watt’s)¼ Zoll Außendurchmesser x 0,170 Zoll InnendurchmesserIn kleine Stücke schneiden. Über eine Flamme ziehen und die Spitze auf die richtige Größe zurückschneiden.

Referenzen

  1. Fuchs, P. A., Nicholls, J. G., Ready, D. F. Membrane properties and selective connexions of identified leech neurones in culture. J Physiol. 316, 203-223 (1981).
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