Die Kultivierung der menschlichen Nasen Epithelzellen an der Air flüssig-Grenzfläche

Zusammenfassung

Nasen Epithelzellen, durch oberflächliche Schürf Biopsie der menschlichen Freiwilligen erhalten, werden erweitert und auf Gewebekultureinsätze übertragen. Nach Erreichen der Konfluenz werden die Zellen an der Luft Flüssigkeit-Grenzfläche angebaut, was Kulturen der Wimper und nicht-Geißelzellen. Differenzierte Nasen epithelialen Zellkulturen bieten tragfähige experimentelle Modelle für die Untersuchung der Schleimhaut der Atemwege.

Zusammenfassung

In-vitro-Modelle mit humanen primären Epithelzellen sind wesentlich für das Verständnis wichtigen Funktionen des respiratorischen Epithels im Rahmen von mikrobiellen Infektionen oder inhaliert Mittel. Direkte Vergleiche von Zellen von erkrankten Populationen erlauben es uns, verschiedene Phänotypen charakterisieren und sezieren die zugrunde liegenden Mechanismen der Vermittlung Veränderungen in epithelialen Zellfunktion. Kultivierung epithelialer Zellen aus dem menschlichen Tracheobronchialbereich ist gut dokumentiert, aber wird durch die Verfügbarkeit von humanem Lungengewebe oder Invasivität bei der Beschaffung der Bronchien Bürsten Biopsien Dritter. Nasen Epithelzellen durch viel weniger invasive Nasen oberflächliche Schürf Biopsien erhalten und Themen kann mehrfach ohne signifikante Nebenwirkungen biopsiert werden. Darüber hinaus ist die Nase der Einstiegspunkt für die Atemwege und damit eine der ersten Websites, um jede Art von luftgetragenen Stressor ausgesetzt werden, wie Mikroben, Schadstoffe oder Allergene.

Kurz gesagt, werden Nasenepithelzellen an menschlichen Freiwilligen erhalten auf beschichteten Gewebekulturplatten ausgebaut und dann auf Zellkultureinsätze übertragen. Beim Erreichen der Konfluenz werden Zellen weiterhin an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) für mehrere Wochen, die mehr physiologisch relevanten Bedingungen schafft, kultiviert werden. Die ALI Kulturbedingungen verwendet definierten Medien, die zu einer differenzierten Epithelien, die morphologischen und funktionellen Eigenschaften ähnlich dem menschlichen Nasenschleimhaut, sowohl mit Flimmerepithel und Schleim produzierenden Zellen aufweist. Gewebekulturplatten mit differenzierten Nasenepithelzellen können in einer Vielzahl von Möglichkeiten, abhängig von den Forschungsfragen (Behandlung mit pharmakologischen Mitteln, Transduktion mit lentiviralen Vektoren, die Exposition gegenüber Gasen oder Infektion mit Mikroben) manipuliert und für zahlreiche verschiedene Endpunkte von analysierende zellulären und molekularen Signalwege, funktionale changes, Morphologie, usw.

In-vitro-Modelle von differenzierten humanen nasalen Epithelzellen wird Ermittlern ermöglichen, neue und wichtige Forschungsfragen mit Hilfe organotypischen experimentelle Modelle, die weitgehend imitieren die Nasenschleimhaut in vivo zu adressieren.

Einleitung

Ziel der Technik

Epithelzellen (EC) in den Atemwegen gehören zu den ersten Websites, um direkt mit inhalativen belastenden Umweltfaktoren, wie z. B. Krankheitserreger, Allergene oder Luftschadstoffe ausgesetzt werden. ECs sind mehr als eine strukturelle Barriere: Sie wirken als eine Telefonzentrale über die Freisetzung von löslichen Mediatoren ^6.4 und der Expression von Liganden / Rezeptoren auf ihrer surfac ^7-9 initiieren und regulieren die Immunantwort Atem ^1-3. Während immortalisierten Zelllinien können als Modelle verwendet werden, um Atmungs ECs in vitro zu untersuchen, können sie einfach in het....

Protokoll

1. Bereiten Plastic Ware: Mantel-Kennzeichen

1. In 500 ul PureCol (1:100 mit sterilem Wasser verdünnt) in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte.
2. Bei 37 ° C im Brutschrank für 30 Minuten, entfernen Sie die PureCol und spülen Sie mit HBSS rechts, bevor die Zellen zu der Platte gegeben (siehe Schritt 3.1 unten).

2. Beziehen und Vorbehandeln Biopsie der Menschen NEC

1. Nasen kratzen Biopsie
   1. Erhalten oberflächlichen ECs Auskleidung der Nasenmuscheln unter direkter Sicht durch eine 9 mm wiederverwendbare Polypropylen Nasenspekulum (Modell 22009) auf einem Betriebs Otoskop mit Speculum (Modell 21700). Dies....

Ergebnisse

NEC kultiviert nach dem hier beschriebenen Protokoll wieder zu differenzieren in eine heterogene Schicht der ECs von Flimmer-und Nicht-Geißelzellen, die die in vivo Situation (Abbildung 1) besteht. Einige der differenzierten NEC sind Schleim produziert (Zellen Färbung in blau mit AB / PAS, Abbildung 1B). Auch wenn die hier vorgestellten Protokoll optimiert wird, kann die Differenzierung in Bezug auf die Verteilung der Gesamt-Zellpopulationen (: Schleim-produzierenden Zellen:

Diskussion

Atem ECs bieten nicht nur eine physische Barriere, um den menschlichen Körper von exogener Stimuli ²⁰ zu schützen, sondern auch als Telefonzentrale über Sekretion von löslichen Mediatoren oder direkte Rezeptor-Ligand-Zell-Zell-Interaktionen zu initiieren und regulieren Immunabwehrreaktionen der Atemwege ^3.1 handeln. Um weiter zu untersuchen, die Rolle von ECs in der Immunantwort, um mögliche Unterschiede zwischen ECs aus erkrankten Populationen zu untersuchen, oder die Auswirkungen exogener Stresso.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Nasenspekulum	Welch Allyn	Modell 22009	9 mm, wiederverwendbares Polypropylen
Operationsotoskop	Welch Allyn	Modell 21700
Rhinosonden-Küvette	Arlington Scientific	SY-96-092	Biegen Sie den Kopf der Küvette etwas mehr
12-Well-Kulturplatten	Corning	3512
Transwell Membran-Zellkultureinsätze	Corning	3460
Gewebekulturkolben	Corning	430639 und 430641	T25 und T75 belüfteter Kolben
RPMI 1640 Medien (mit L-Glutamin)	Gibco	11875
Bronchial-/Trachealepithelzellwachstumsmedium	Zellanwendungen	511-500
BEGM Bronchialepithelzellwachstumsmedium	Lonza	CC-3170	Dies wird als Kit mit einer Flasche Medium und Fläschchen mit Nahrungsergänzungsmitteln geliefert.
Natriumbicarbonat 7,5% ige Lösung	Gibco	25080	So verwenden, wie es ist.
NuSerum	BD Biosciences	355104	so verwenden, wie es ist.
BAMBANKER Gefriermedium	BAMBANKER	302-14681	So verwenden, wie es ist.
CoolCell	Biocision	HTBCS-136	(CryoPrep alkoholfreier Zellgefrierbehälter)
PureCol	AdvancedBioMatrix	5005-B	1:100 mit sterilem Wasser verdünnen (sollte ca. 0,03 mg/ml betragen)500 μm verwenden; l/Well einer 12-Well-Platte
HBSS mit Ca2 und Mg2+	Gibco	14025
DNAse 1	Sigma	DN25	Auflösen bei 1,5 mg/ml, was einer 100-fachen Lösung entspricht, 10 μm; l zu jedem ml Medium
Trypsin, 0,25%, 1x, mit Phenolrot	Gibco	25200-056	Verwendung bei es ist
Sojabohnen Trypsin Inhibitor (SBTI)	Sigma	T6522	Verwendung gelöst in HBSS in einer Konzentration von 1 mg/ml
Retinsäure	Sigma	R7632	Make it up 100 μ M Stammlösung (siehe unten), verdünnt auf 10 μm; M mit absolutem Alkohol, nehmen Sie 5 μm; l davon und geben Sie es zu 1 ml BEDM-Medium (unserer Arbeitslösung). All-trans-Retinol hat einen Extinktionskoeffizienten von 52.480 in Ethanol bei 325 nm. 25 mg in 50 ml absolutem Ethanol auflösen. Es müssen serielle Verdünnungen vorgenommen werden, 50 ml Stamm in 450 ml absolutem Ethanol verdünnen, 50 ml davon nehmen, in 450 ml absolutem Ethanol verdünnen, 50 ml davon nehmen, in 450 ml absolutem Ethanol verdünnen, wieder 50 ml davon nehmen, in 450 ml absolutem Ethanol verdünnen, 100 ml davon nehmen und in 900 ml absolutem Ethanol verdünnen und im Spektralphotometer bei 325 nm ablesen, Diese Zahl wird dann mit ihrer Verdünnungsfaktor, dann dividiert durch den Extinktionskoeffizienten von 52.480, ergibt sich eine Zahl in mM. Stellen Sie einen Vorrat von 100 mM her (lagern Sie bei -20 °; C) und aus diesem Bestand wird ein 10 mM Aliquot hergestellt, so beträgt der täglich benötigte Retinsäure 5 ml dieses 10 mM Aliquot in 995 ml ALI-Medium. Beispiel: Der Messwert von 325 nm beträgt 1,15. 1,15 x 10.000 (Verdünnungsfaktor) / 52.480 = 0,219 = 219 mM, daraus einen 100 mM Vorrat in absolutem Ethanol herstellen.
DMEM hoher Glukosegehalt (1x), flüssig, mit L-Glutamin und Natriumpyruvat	Gibco	11995
Rinderhypophysenextrakt	Gibco	13028-014	Wird für BEGM ALI-Medien verwendet.
Nystatin	Sigma	N4014-50 mg	Stellen Sie eine Lösung von 3,3 mg/ml her.
Rinderserum Albumin	Fisher Scientific	BP1600-100	Stellen Sie eine Lösung von 10 mg/ml Lösung in milliQ Wasser her.
PneumaCult-ALI media	StemCell	5001	Dies wird als Kit bestehend aus einer Flasche Medium und Fläschchen mit Nahrungsergänzungsmitteln geliefert. Weitere Informationen finden Sie unten.
Hydrocortison	StemCell	7904	Lösen Sie 2,4 mg Hydrocortison in 1 ml ddH2O (zur Herstellung der 200x Hydrocortison-Stammlösung)
Heparin-Natriumsalz in PBS (2 mg/ml)	StemCell	7980	Verwenden Sie es dabei.
Filterkolben (500 ml)	Corning	431097	0,22 μ m Porengröße
Filterröhrchen (50 ml)	Millipore	SCGP00525	Steriflip, 0,22 μ m Porengröße
Pipettenspitzen - ART Barrier Tips	Molecular Bioproducts	2139RI, 2069RI, 2179RI
Konische Röhrchen, steril, 15 ml und 50 ml
ddH2O, absolutes Ethanol, Eis
CO2 Inkubator
gekühlte Zentrifuge
Sicherheitswerkbank
Pipetten (P2, P200, P1000), 9 Zoll Glaspipetten
Handschuhe
Laborkittel mit engen Manschetten
<> 4250 μ l gelöstes Natriumchlorid 2 μ l Heparin (aus einer 2 mg/ml Stammlösung) Verwendete Medien und Lösungen: Rezept Verwendet für Allgemeine Bemerkung: Erhitzen Sie das Medium immer auf Raumtemperatur BEGM media 500 ml BEGM Cell Applikationsmedium mit einem Aliquot Retinsäure (zur Hälfte mischen und filtrieren) 500 ml BEGM Lonza Medien mit einem Aliquot von Single Quot Supplementen < ul> Verdau der Biopsie BEGM+ media 50 ml BEGM Medien die Zellerhaltung auf Kunststoff in den Platten (Durchgang0) 10 μ L Retinsäure (Arbeitslösung) Aussaatzellen im Kolben (Passage1; teilweise) halten die Zellen im Kolben BEGM++ media 50 ml Lonza' s BEGm-Medium mit Nahrungsergänzungsmitteln Aussaat frischer Zellen in einer 12-Well-Platte auf Kunststoff 1 ml NatriumbiCarb Halten von Zellen in den Platten auf Kunststoff (Passage0; nur teilweise) 2,5 ml NuSerum Aussaat von Zellen im Kolben (Passage1; teilweise) BEGM ALI media 250 ml DMEM-H Zellen auf dem Transwell halten, bevor sie ALI 250 ml BEGM einschließlich Nahrungsergänzungsmittel 2 ml Rinder-Hypophysenextrakt (12,5 mg/ml Lösung) 1 ml Nystatin (3,3 mg/ml Lösung) 75 μ l BSA (10 mg/ml Lösung) 200X Hydrocortison-Stammlösung (96 μ l/ml Lösung) 200 μ l gelöstes Hydrocortison Als Ergänzung zum PneumaCult-ALI Complete Base Medium für den letzten Tag im Kolben und wenn sich die Zellen auf den Inserts befinden 540 μ l ddH2O 10 μ l absolutes Ethanol Filterlösung durch 0,22 μm; m filtrieren, aliquot lösen und bei -20 & deg lagern; C, vermeiden Sie zusätzliche Einfrier-/Auftauzyklen PneumaCult-ALI Complete Base Media 450 ml PneumaCult-ALI Basalmedium Basismedium für alle drei PneumaCult-ALI Medien 50 ml PneumaCult 10x Supplement Das PneumaCult Medium ist lichtempfindlich und hält es daher immer im Dunkeln PneumaCult-ALI Maintenance Medium Pro 1 ml PneumaCult-ALI Complete Base Medium add: ALI-Kultur auf Inserts 10 μ l PneumaCult 100x Wartung Ergänzung 5 μ l Hydrocortison (von 96 μ L/ml Stammlösung) < td>(dies ist 2 Wochen lang bei 2-8 & Grad stabil; C oder für bis zu 6 Monate bei -20°; C)

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