Wir beschreiben hier eine überarbeitete Protokoll für die groß angelegte Kultur von embryonalen C. elegans-Zellen. Embryonale C. elegans in vitro kultivierte Zellen unter Verwendung dieses Verfahrens scheinen in einer zellspezifischen Weise zu differenzieren und zu rekapitulieren, die Expression von Genen. Techniken, die direkten Zugriff auf die Zellen oder Isolierung von spezifischen Zelltypen aus den anderen Geweben erfordern kann auf C angewendet werden elegans kultivierten Zellen.
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Methodenartikel
Ein Verfahren zur Kultivierung von embryonalen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
C. elegans ist ein leistungsfähiges Modellsystem, in der genetischen und molekularen Techniken sind leicht anwendbar. Bis vor kurzem aber Techniken, die direkten Zugang zu den Zellen und Isolierung von spezifischen Zelltypen benötigen, konnten nicht in C angewendet werden elegans. Diese Beschränkung resultiert aus der Tatsache, dass Gewebe in einem unter Druck Kutikula, die nicht leicht durch die Behandlung mit Enzymen und / oder Detergenzien aufgeschlossen wird beschränkt. Basierend auf frühen Pionierarbeit von Laird Bloom, Christensen und Kollegen entwickelten ein ein robustes Verfahren für die Kultivierung von C. elegans embryonalen Zellen in großem Maßstab. Die Eier werden von schwangeren Erwachsenen durch Behandlung mit Bleichmittel / NaOH isoliert und anschließend mit Chitinase behandelt, um die Eierschalen zu entfernen. Embryonale Zellen werden dann durch manuelles Pipettieren dissoziiert und auf das Substrat beschichtete Glas im Serum angereicherten Medien ausplattiert. Innerhalb von 24 Stunden von Isolationszellen beginnen, indem Morphologie und durch zellspezifische marke ausdrücken unterscheidenrs. C elegans Zellen mit dieser Methode kultiviert überleben bis 2 Wochen in vitro und haben für elektrophysiologische, immun verwendet, und Bildanalysen sowie wurden sie sortiert und für die Microarray-Profiling eingesetzt.
Einleitung
Caenorhabditis elegans (C. elegans) ist ein leistungsfähiges Modellorganismus für die Untersuchung der molekularen Grundlagen der zellulären Funktion, Differenzierung und Verhalten. Während sein Genom, Stoffwechsel-und Biosynthesewege ähnlich Wirbeltiere "sind, sind die genetischen und molekularen Lenkbarkeit weit größer 2. Einer der Vorteile sind seine Größe und einfache Anatomie, seiner schnellen Lebenszyklus (3 Tage bei 25 ° C), kurze Lebensdauer (2 Wochen) und große Anzahl von Nachkommen (> 200). Aufgrund seiner Zwitter Natur und kurzen Lebenszyklus, sind molekulare und genetische Manipulationen einfach in C. elegans, einschließlich d....
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Protokoll
Sternchen (*) zeigen an neuen oder modifizierten Schritten im Vergleich zu Christensen et al. 1
1. Material Einstellungs
- Das Zellkulturverfahren erfordert große Mengen an Eiern von schwangeren Erwachsenen isoliert. Wachsen C. elegans auf Agar-Platten ausgesät 8P mit NA22 (durch C. elegans Genetic Consortium - CGC) Bakterien, um große Mengen von Eiern zu isolieren. In diesen Platten die Menge Pepton verwendet wird, ist 8-mal der Betrag, der normalerweise für die NGM-Platten verwendet. Je höher Peptonkonzentration trägt das Wachstum von Bakterien NA22 effizienter, was gegen OP50-, wachsen in ....
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Ergebnisse
C. elegans kultivierten Zellen zu differenzieren und Express-Zell-spezifische Marker
Christensen und Kollegen mit Trypanblaufärbung gezeigt, dass> 99% der embryonalen C. elegans Zellen überleben die Isolierungsverfahren. Am Tag 9 und 22 nach dem Plattieren, 85% und 65%, bzw. 1 sind noch am Leben. Isoliert embryonalen C. elegans-Zellen müssen auf ein Substrat, um zu unterscheiden haften. Zellen, die Klumpen bilden nicht einhalten und es ist nicht klar, ob.......
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Diskussion
C. elegans ist ein leistungsfähiges Modellorganismus für die Entschlüsselung der genetischen Pfade in der Entwicklung, Verhalten und Alterung beteiligt. Seine Bequemlichkeit liegt vor allem in der Leichtigkeit, mit der sie genetisch manipuliert werden können und von seiner kurzen Lebenszyklus. Trotz seiner Bequemlichkeit, C. elegans hat seine Grenzen. C elegans-Zellen sind klein und in einem unter Druck Cuticula, die die Anwendung von Verfahren, die direkten Zugriff auf die Zellen, wie elektro.......
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| Bacto Peptone | VWR International Inc. | 90000-382 | |
| Difco Agar Granulat | VWR International Inc. | 90000-784 | |
| Bacto Trypton | VWR International Inc. | 90000-284 | |
| Bacto Hefeextrakt | VWR International Inc. | 90000-724 | |
| Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetales Rinderserum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase aus Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| NA22 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| Saccharose | Sigma | 57903-1KG | |
| D-(+)Glucose | Sigma | 67528-1KG | |
| Ethylenglykol-bis (2-amin– Thylether), N,N,N',N'- tetrasaure Säure (EGTA) | Sigma | E0396-25G | |
| Hepes | Sigma | H3375-500G | |
| Cholesterin | |||
| NaCl Sigma | 57653-1KG | ||
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| MgSO4 | Sigma | M2643-500 g | |
| K2HPO4 | Sigma | P2222-500G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-500G | |
| NaOH | Sigma | S8045-500G | |
| KOH | Sigma | P1767-500G | |
| Ethanol | |||
| Autoklaviered destilliertes H2O | |||
| Bleach | |||
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μ l Blaue graduierte Pipettenspitzen | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml sterilisierte Pipette einzeln verpackt | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomisch mit variablem Volumen (100-1000 μ l) Pipette mit Spitzenabwerfer | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Tragbares Pipettierhilfegerät, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transferpipette aus Kunststoff steril | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Konisches Röhrchen | USA Scentific | 1475-1611 | |
| 50 ml Konisches Röhrchen | USA Scentific | 1500-1811 | |
| Sterile 18 Gauge Nadeln | Becton, Dickinson & Co. | ||
| sterile 10 ml Spritzen | Becton, Dickinson und Co. | ||
| Kunststoff-Spritzenvorsatzfilter Corning 0,20 μ m Porengröße | Corning | 431224 | |
| m versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60x15 mm Petrischale, steril | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100x15 mm Petrischale, steril | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| Glasdeckgläser mit 12 mm Durchmesser VWR | International Inc. | 48300-560 | |
| Klare Zellkulturplatten 24 Well mit flachem Boden und Deckel | Thomas Scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Feinzange | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Zentrifuge 5702 | Eppendorf | ||
| mit x10-Objektiv | |||
| Befeuchteter Inkubator |
Referenzen
- Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D.
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Nachdrucke und Genehmigungen
