Modell Netzhautablösung in Nagetiere durch subretinale Injektion von Natriumhyaluronat

Zusammenfassung

Erstellen experimentellen Netzhautablösungen mit einer reproduzierbaren und anhalt Höhe Ablösung, und ohne subretinalen Blutung, ist wichtig für die Erforschung der Pathophysiologie der Photorezeptorzellverlust in der Netzhauterkrankungen und Bewertung potenzieller therapeutischer Interventionen. Hier ist ein solches Verfahren im Detail beschreiben wir.

Zusammenfassung

Subretinale Injektion von Hyaluronsäure ist ein weithin akzeptiertes Verfahren zur Induktion der Netzhautablösung (RD). Jedoch kann die Höhe und Dauer der RD oder das Auftreten von subretinaler Blutung Photorezeptorzelltodes in der Netzhautablösung beeinflussen. Vorteilhaft Daher ist es um reproduzierbare RDS subretinalen Blutung ohne Photorezeptor für die Bewertung Zelltod erstellen. Wir bereits berichtet eine modifizierte Methode, um bullösen und anhalt RDS in reproduzierbarer Lage mit seltenen Auftretens von subretinalen Blutung erstellen. Der kritische Schritt in diesem modifizierten Verfahren ist die Schaffung eines selbstdicht Skleraeinschnitt, die Leckage von Natriumhyaluronat nach Injektion in den subretinalen Raum verhindern. Um das selbstdicht Skleraeinschnitt ein Skleratunnel erstellt wird, gefolgt von skleralen Eindringen in die Aderhaut mit einer 30 G Nadel machen. Obwohl choroidalen Blutung kann während dieses Schrittes auftreten, astriction mit einem chirurgischen Speer reduziert die Rate der choroidalen Saumorrhage. Diese Methode ermöglicht eine reproduzierbare und zuverlässige Modell der Photorezeptor Tod in Krankheiten, die RD wie rhegmatogener RD, Frühgeborenen-Retinopathie, diabetische Retinopathie, Zentral RCS und altersbedingte Makuladegeneration (AMD) zu beteiligen.

Einleitung

Photorezeptorzelle Tod und die anschließende visuelle Rückgang tritt auf, wenn die Photorezeptoren werden von der zugrunde liegenden retinalen Pigmentepithel getrennt. Räumliche Trennung von Photorezeptoren in verschiedenen Netzhauterkrankungen, einschließlich der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), Zentral serosa, diabetische Retinopathie und Frühgeborenen-Retinopathie, sowie rhegmatogener (dh durch einen Bruch in der Netzhaut verursacht) Netzhautablösung (gesehen RD). Subretinale Injektion von Hyaluronsäure ist ein weithin akzeptiertes Modell, eine RD, die Photorezeptorzelle Tod führt, die einen Einblick in die Pathophysiologie der Photorezeptordegeneration ^1-15 erstellen.

Photorezeptordegeneration durch subretinale Injektion Hyaluronsäure induziert, zuerst in 2001 ⁷ eingeführt wird, hat den Vorteil eines angemessenen Zeitkurs (Tage bis Wochen). Allerdings kann es erhebliche Variabilität der Photorezeptorzelle Verlust von Tier zu haben animal auf zwei wichtige Faktoren, die Photorezeptorzelle Tod nach RD beeinflussen: 1) Höhe und Dauer der RD, und 2) das Auftreten von subretinalen Blutung. Es ist eine steile technische Lernkurve der Methode, die beide Faktoren beiträgt. Photorezeptorzelldegeneration steigt mit der Höhe des RD, wie der Abstand zwischen dem retinalen Pigmentepithel (RPE)-Schicht und die Photorezeptoren erhöht ^16-17. Im Einklang mit dieser Berichte zeigte unsere bisherigen Experimente mehr Photorezeptor Tod bullösen RDS als flache RDS. Es wurde auch berichtet, dass subretinaler Blutung ist giftig für Photorezeptorzellen und betrifft Photorezeptor Zelltod ^18-21. Ebenso haben wir mehr Photorezeptor Tod im RDS mit subretinalen Blutung als RD ohne subretinale Blutungen beobachtet. Daher haben Techniken, um die Variabilität zu minimieren, um auf die Erzielung konsistenter Höhen von RD unter Vermeidung subretinalen Blutung zu konzentrieren.

Unsere modifizierte Methode der inducing RD reproduzierbare bullösen und anhalt RD an der gleichen Position des Auges mit seltenen Auftretens von subretinalen Blutung zu machen. Wir durchgeführte Operation mit einer zeitlichen Ansatz, weil es einfacher ist, einen größeren operativen Bereich zu erreichen, verglichen mit anderen Websites. Nach Bindehautschnitt wird eine selbstdicht skleralen Einschnitt unter Verwendung einer 30 G-Nadel vorgenommen. Ein Skleratunnel erstellt wird, gefolgt von skleralen Eindringen in die Aderhaut. Wenn choroidalen Blutung in diesem Schritt stattfindet, wird die Blutung das Auge durch das sklerale Wunde zu beenden, und die Blutung durch astriction mit einem chirurgischen Speer gestoppt werden. Eine vordere Kammer Einstich wird dann von der Hornhaut durchgeführt, um den Augeninnendruck zu senken. Dies ist ein wichtiger Schritt, weil subretinale Injektion allein wird zu erhöhter Augeninnendruck mit daraus resultierenden Arterienverschluss und Ischämie der inneren Netzhaut führen. Eine 33 G-Nadel in eine 10 &mgr; l Hamilton-Spritze verbunden wird dann in den subretinalen Raum eingelegt und 3,5 μ; L Natriumhyaluronat wird sanft eingespritzt, um die neurosensorischen Netzhaut von der zugrunde liegenden RPE zu lösen. Im Gegensatz zu anderen Verfahren zur Induktion RD, die unter Fundusbeobachtung durchgeführt werden, wird diese Technik unter direkter Sicht durchgeführt. Da die sklerale Wunde ist selbstdichtend wird Natriumhyaluronat nicht austreten nach der Injektion. Schliesslich wird Klebstoff auf die sklerale Wunde gelegt und die Bindehaut in ihre ursprüngliche Position wieder befestigt. Diese Schritte dauert das Risiko von Natriumhyaluronat Reduzierung der Leckage auch. Die Injektion von 3,5 &mgr; l Natriumhyaluronat schafft reproduzierbare RDS (50% der Netzhaut) in den Augen von 8 Wochen alten Mäusen. Erstellen des selbstdichtende Wunde ist der wichtigste Schritt in unserer modifizierten Verfahren, weil es verhindert, dass der eingespritzte Hyaluronsäure Auslaufen aus dem Auge, so dass reproduzierbare bullösen und anhalt RDS.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Association for Research in Vision and Ophthalmology Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research durchgeführt und die Richtlinien und Vorschriften von der Massachusetts Eye and Ear Infirmary Animal Care Ausschuss dargelegt.

1. Vorbehandlung

1. Betäuben einen 8 Wochen alten Maus mit einer intraperitonealen Injektion einer Mischung von 60 mg / kg Ketamin und 6 mg / kg Xylazin.
2. Schneiden Sie die Barthaare. Dies wird gemacht, weil sie mit der Visualisierung und Instrumenten Platzierung stören.
3. Dilatation der Pupille mit 5% und 0,5% Phenylephrin Tropicamid.
4. Schneiden Sie die Zilien. Dies wird auch getan, weil sie mit der Visualisierung und Instrumenten Platzierung stören.
5. Bewerben Lokalanästhesie (0,5% Proparacain Hydrochlorid-Augentropfen).

2. Chirurgie unter dem Mikroskop

1. Stellen Sie die Maus in einer seitlichen posITION mit der Nase in Richtung des Chirurgen. Eine Zehe Prise durchgeführt, um chirurgische Anästhesie zu bestätigen, und sterile Handschuhe sind vor Beginn der Operation angelegt.
2. Inzision die zeitliche Bindehaut am hinteren Limbus und trennen Sie die Bindehaut von der Lederhaut. Vermeiden Sie das Eindringen der Lederhaut. Nach diesem Schritt erfassen die Bindehaut am Limbus mit einer Pinzette, um das Auge zu steuern.
3. Machen Sie ein selbstdicht Skleraeinschnitt mit der Spitze einer 30 G-Nadel mit dem Kegel deutete. Machen Sie eine Skleratunnel durch die Lederhaut und dringen in die Lederhaut in die Aderhaut (Abbildung 1). Vermeiden Eindringen in die Netzhaut. Wenn choroidalen Blutung auftritt und kommt durch die Sklerawunde, führen Sie eine astriction mit einem chirurgischen Speer, bis die Blutung aufhört. Diese Sklerawunde wird Selbst-versiegelt mit Augeninnendruck sein.
4. Die Punktion der Hornhaut mit einem 30-G-Nadel, um den Augeninnendruck senken. Verwenden Sie die Nadel parallel zur Iris nicht zu verletzen die Iris und Linse während entry in die Vorderkammer. Der Augeninnendruck führt dazu, dass die Wunde auf Selbstdichtung.
5. Legen Sie eine 33 G-Nadel auf eine 10 ul Hamilton-Spritze in den subretinalen Raum mit der Kegel zeigte nach unten (in Richtung der inneren Auge) verbunden ist, und spritzen 3,5 ul Natriumhyaluronat sanft, um die neurosensorische Netzhaut von der zugrunde liegenden RPE zu lösen. Vermeiden Eindringen in die Netzhaut mit der 33 G-Nadel, weil Hyaluronsäure wird in die Glaskörperraum, aber nicht den subretinalen Raum zu gehen, wenn die Netzhaut eingedrungen. Vermeiden Sie auch schnelle Injektion, weil es eine mündliche Tränen erstellen und Hyaluronsäure wird in die Vorderkammer austreten.
6. Lassen Sie das Kammerwasser abfließen von der Hornhautpunktion, indem die Hornhaut um das Hornhautpunktion mit einer Pinzette, um den Augeninnendruck einzustellen.
7. Abwesenheit von Leckagen aus der Sklerawunde Bestätigen Sie mit einer chirurgischen Speer.
8. Um das Risiko von Natriumhyaluronat Reduzierung der Leckage, legen Cyanacrylat chirurgische Kleber aufdie Lederhautwunde.
9. Bringen Sie die Bindehaut in ihre ursprüngliche Position mit Cyanacrylat chirurgische Kleber. Dies wird das Risiko von Natriumhyaluronat Leckage.
10. Überprüfen Sie den Fundus mit einem Deckglas und bestätigen die Schaffung eines bullösen RD ohne subretinalen Blutung.

3. Nach der Behandlung

1. Bewerben Bacitracin antibiotische Salbe für die Augen, um das Risiko einer Infektion zu verringern.
2. Halten Sie die Maus auf einem Heizkissen, um die Anästhesie (Mischung aus Ketamin und Xylazin) aus verursacht niedrige Körpertemperatur im Anschluss an niedrigem Blutdruck zu verhindern.
3. Legen Sie die Maus zurück in die Tierkäfig, nachdem sie aus der Narkose erwachen. Überwachen Sie die Mäuse täglich für Komplikationen. Wenn keine Komplikationen auftreten, einschläfern die Mäuse wie unten beschrieben.

4. Sacrifice

1. Euthanize die Mäuse durch zervikale Dislokation nach intraperitonealer Injektion von 100 mg / kg Natrium-Pentobarbital und enucleate der Augen zu geeigneten Zeitpunkten für jedes Experiment (nicht gezeigt). Üben Sie keinen Druck auf das Auge während der Entkernung, weil Natriumhyaluronat austreten. Bullöse RDS sollte mindestens 14 Tage hartnäckig sein.

Ergebnisse

Um die Persistenz der RD von diesem Protokoll gemacht zu beurteilen, wurden Gefrierschnitte an den Tagen 3, 7 gemacht, und 14 nach Induktion der RD. Sechs Augen wurden für jeden Zeitpunkt verwendet. Hämatoxylin und Eosin (HE)-Färbung wurde verwendet, um die Abschnitte zu visualisieren. Alle Abschnitte zeigten eine bullösen RD nähert sich der Linse (Abbildung 2). Ein Auge zeigte subretinalen Blutung am 7. Tag. Keine Augen zeigten keine Anzeichen einer Infektion oder Linsenverletzung.

Fig. 1 ist. Erstellen eines selbstdicht Skleraeinschnitt. Dieses Schema zeigt ein Querschnittsbild einer normalen Maus Auge. Rote Linie zeigt den selbstdicht Skleraeinschnitt. Ein Skleratunnel gefolgt von skleralen Eindringen in die Aderhaut mit einer 30 G-Nadel erzeugt eine selbstdicht Skleraeinschnitt. Diese Sklerawundewird selbst versiegelt mit Augeninnendruck, die eine Leckage von Natriumhyaluronat nach Injektion in den subretinalen Raum zu verhindern und zu erreichen persistent bullöse Hautablösungen kann.

2. Zeitlicher Verlauf der Netzhautablösung. Dieses Foto zeigt einen Fundus bullösen Hautablösung ohne subretinalen Blutung unmittelbar nach der Operation. Gefrierschnitte mit Hämatoxylin und Eosin (HE)-Färbung zeigen anhalt bullösen Hautablösung ohne subretinalen Blutung durch mindestens 14 Tage.

Diskussion

Mehrere Verfahren zur Gründung einer RD-Modell in Nagetier-Augen wurde berichtet, ^{3-15, 22.} Die meisten von ihnen nutzen subretinalen Injektion von Natriumhyaluronat, weil es ein viskoses Material, das üblicherweise während einer intraokularen Operation bei Menschen verwendet, und es ist nicht mit irgendeinem bekannten okulare Toxizität ^1-15 zugeordnet. Natriumhyaluronat, anstatt normaler Kochsalzlösung oder Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), erhöht sich die Dauer der RD.

Die Methoden für das subretinale Injektion von Hyaluronsäure eine von zwei Ansätze: a transvitreal Ansatz ^3-6 oder ein transskleralen Ansatz ^7-15. Beide Verfahren werden mit der Beobachtung des Augenhintergrunds durchgeführt. Im transvitreal Ansatz wird ein subretinalen Injektor in den Glaskörperhohlraum eingebracht, ein Retinotomie in der peripheren Netzhaut erzeugt und das Natriumhyaluronat in den subretinalen Raum eingespritzt. In diesem Verfahren werden zwei Netzhautrisse gebildet, die das Risiko von Retina erhöhtl Blutung, die in den subretinalen Raum gehen könnten. Darüber hinaus besteht die Gefahr von Verletzungen, wenn die Linse Retinotomie erzeugt. Es gibt mehrere Methoden für die modifizierte transskleralen Ansatz. In den meisten dieser Verfahren ^7-12, nach der Verringerung des Augeninnendrucks mit einer Vorderkammerpunktion einer 30 G-Nadel in eine Spritze gefüllt mit Natriumhyaluronat wird direkt in den subretinalen Raum durch die Bindehaut, Lederhaut, Aderhaut und RPE eingesetzt ist. Die Natriumhyaluronat wird dann in den subretinalen Raum eingespritzt. Die Gefahr von Netzhautschäden Tränenlinse und mit diesen transskleralen Verfahren ist geringer als die mit der transvitreal Ansatz. Jedoch ist das Loch in die Sklera durch eine 30 G-Nadel groß gemacht, insbesondere für die Augen der Maus, und das Natriumhyaluronat in den subretinalen Raum injiziert leicht leckt aus dem Auge durch das sklerale Wunde. Dies führt zu einer niedrigeren, weniger hartnäckig RD und variabler Photorezeptorzelle Tod. Außerdem, wenn in der Aderhautblutungen auftrittdie Lederhaut Perforation Schritt wird die Blutung in den subretinalen Raum ausbreiten, weil der Augeninnendruck hat vor dem subretinalen Hyaluronat Injektion reduziert.

Mehrere Faktoren können die Wirkung von RD auf der Netzhautablösung zu beeinflussen, einschließlich subretinaler Blutung, und die Höhe und Persistenz von RD ^16-21. Photorezeptor Zelltod mit zunehmender Höhe RD ^{16, 17} und Photorezeptorzellschädigung kann wegen der verringerten Diffusion von Sauerstoff und essentiellen Nährstoffen aus der Choriokapillaris mit höheren RD Vergleich zu flachen RD umfangreicher sein. Subretinalen Blutung ist auch giftig für Photorezeptorzellen ^18-21, mögliche Mechanismen dieser Toxizität in der Netzhautablösung sind Hypoxie und metabolische Störungen durch subretinalen Blutung als Diffusionsbarriere und die direkte Neurotoxizität von Blutkomponenten (wie zB Eisen) induziert. Linsenverletzung, von der berichtet wurde, um eine Schutzwirkung auf reti habennal Ganglienzellen ^23, kann auch Auswirkungen auf Photorezeptorzelltodes nach Induktion der RD. Darüber hinaus, wenn der Eintrag Wunde ist nicht versiegelt, Hyaluronsäure kann mit Auge Manipulationen während Enukleation auslaufen. Dies kann zu fehlerhaften Klassifizierung eines RD so flach führen, was wiederum Auswirkungen auf die Interpretation der Ergebnisse.

Wir modifizierten die transskleralen Verfahren für subretinale Injektion von Hyaluronsäure, um die Reproduzierbarkeit RD erhöhen und die Rate der subretinalen Blutung. Der kritische Schritt in diesem Protokoll ist die Schaffung einer selbstdicht skleralen Einschnitt unter Verwendung einer 30 G-Nadel, die eine Leckage von Natriumhyaluronat nach dem Einspritzen verhindert. Im Gegensatz zu bisherigen Verfahren wird dieses Protokoll ohne Beobachtung des Augenhintergrundes durchgeführt, mehr Aufmerksamkeit auf die sklerale Wunde bezahlt. Aufbringen von Klebstoff verhindert auch das Natriumhyaluronat Austreten des Auges. Nach unserer Erfahrung ist die Rate der subretinalen Blutung mit diesem Protokoll wals deutlich geringer als bei anderen Protokollen. Wenn choroidalen Blutungen während der Skleraeinschnitt Schritt auftritt, wird es das Auge durch das sklerale Wunde zu verlassen, da dieser Schritt vor der Verringerung des Augeninnendrucks durchgeführt. Wenn choroidalen Blutung nach der Reduktion des Augeninnendrucks und Ablösung der Netzhaut neuro auftreten, wird das Blut in den subretinalen Raum zu sezieren. Wir fanden, dass dies geschieht in etwa 5% der Fälle im Gegensatz zu 10-20% mit den anderen Techniken. Diese Tiere sollten von der Analyse ausgeschlossen werden.

Diese Technik kann auch für die subretinale Injektion von Vektor-vermittelten Gentransfer verwendet werden, um Ziel-Photorezeptor oder RPE-Zellen ^{24, 25} werden. Da die typischen Fahrzeug (PBS, Kochsalzlösung) für diese Injektionen deutlich weniger viskos als Natriumhyaluronat werden Standard-Techniken, die von mehr Lecks geplagt. Die hier beschriebene Technik, durch Reduzierung dieses Risikos macht Vektor Transferexperimente mehr reproduzierbar undzuverlässig.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ketaject	Phoenix	2010025
AnaSed	LLOYD	4004821
5 % Phenylephrin / 0,5 % Tropicamid	Massachusetts Augen- und Ohrenapotheke
0,5 % Proparacainhydrochlorid Ophthalmische Lösung	AKORN	17478-263-12
Provics	Alcon	8065183085
Webglue	Patterson Veterinary	07-8566128
Mikroskop	Leica	MG90
30G1/2 PrecisionGlide Nadel	BD	305106
Weck-Cel Eye Spears	Beaver-Visitec	0008685
10 Mikroliter Spritze	Hamilton	7635-01
33 Gauge, 0,5 Zoll Nadel	Hamilton	7803-05
18x18mm Deckglas	Fisher Scientific	18-548A