Antikörperfärbung in C. Elegans Mit der "Freeze--Cracking"

Zusammenfassung

"Freeze-Cracking", ein Verfahren zur Freilegung der inneren Gewebe des Nematoden C. elegans, um Antikörper für die Proteinlokalisierung, wird demonstriert.

Zusammenfassung

Um C. Fleck elegans mit Antikörpern müssen die relativ undurchlässig Kutikula durch chemische oder mechanische Verfahren umgangen werden. "Freeze-Cracking" ist eine Methode verwendet, um körperlich ziehen Sie die Nagelhaut von Nematoden durch Komprimieren Nematoden zwischen zwei haftenden Folien, Einfrieren, und ziehen Sie die Folien auseinander. Gefrier Cracken liefert eine einfache und schnelle Möglichkeit, den Zugang zu den Geweben ohne chemische Behandlung erhalten und kann mit einer Vielzahl von Fixiermitteln verwendet werden. Sie führt aber zum Verlust von vielen der Proben und die erforderliche Kompression der Probe mechanisch verformt. Praxis ist erforderlich, um Rückgewinnung der Proben mit guter Morphologie zu maximieren. Gefrier Cracken kann für bestimmte Fixierbedingungen, Rückgewinnung der Proben oder niedrige nicht-spezifische Färbung optimiert werden, aber nicht für alle Parameter auf einmal. Für Antikörper, die sehr schwer Fixierung Bedingungen erfordern und tolerieren die chemischen Behandlungen erforderlich, um chemisch permeabilisieren die Nagelhaut, treatment intakter Nematoden in Lösung bevorzugt werden. Wenn der Antikörper erfordert eine leichtere Lösung oder, wenn die optimale Fixierung Bedingungen bekannt sind, bietet gefrier Cracken eine sehr nützliche Methode, um schnell zu testen, die den Antikörper und spezifische subzelluläre und zelluläre Lokalisation Information für das Antigen von Interesse zu ergeben.

Einleitung

Um die zellulären und subzellulären Lokalisation von Proteinen zu bestimmen, haben Wissenschaftler traditionell mit Antikörpern ausgewählt, um bestimmte Proteine ​​spezifisch erkennen, ^ein markierter Gewebe. In einigen Modellorganismen wie C. elegans, Antikörperfärbung wurde oft durch molekulargenetische Techniken, die Ergebnisse schneller erzielen ersetzt. Diese umfassen die Umwandlung Organismen mit Konstrukten aus Genfusionen zwischen dem Promotor und der codierenden Regionen des Gens von Interesse und das grün fluoreszierende Protein. Jedoch unterliegen einer Anzahl von Artefakten, einschließlich der Probleme mit Kenntnis der wahren Promotor und Veränderungen in der Expression von Konstrukten mit hoher Kopienzahl (die üblichen Techniken in C. elegans) ^2,3 molekularen Techniken. Daher Färbung mit Antikörpern bleibt ein Ziel für viele Wissenschaftler, die Proteinfunktion in vivo.

Anfärben mit Antikörpern Gewebe kann schwierig sein, da eineAntikörpern kann nur ihre Antigen in einer bestimmten Konformation ¹ zu erkennen. Zum Beispiel können Antikörper nur denaturiert oder intakten Antigen fixiert in einer bestimmten Weise zu erkennen und nicht das Antigen in situ zu erkennen. Das Problem der Antikörperfärbung in Nematoden wird durch die Tatsache, dass die Kutikula der Nematoden bildet eine relativ undurchlässige Barriere, die Blockierung des Zugangs von Antikörpern gegen Gewebe verstärkt.

Es gibt mehrere verschiedene Methoden für die Antikörper-Färbung verwendet in C. ⁽⁴ in unserer bisherigen Arbeit überprüft) elegans. Um intakte Fleck "Würmer", wurden Methoden entwickelt, zu frieren und tauen in einem relativ harten Fixiermittel (Formaldehyd oder Glutaraldehyd), die Frost-Tau-Zyklen helfen, die Nagelhaut zu knacken, um eine schnelle Durchdringung der Fixiermittel ⁵ zu ermöglichen. Nach der Fixierung wurde die Kutikula permeabilisiert, um das Eindringen der Antikörper zu ermöglichen; Methoden enthalten eine Behandlung mit Reduktionsmitteln, Collagenase oder beides ^5-7. Diese Treatments Morphologie erhalten, aber oft reduziert oder zerstört Antikörpererkennung. Alternative Methoden sind Dissektion ⁸ bis Antikörper Eindringen zu ermöglichen.

"Freeze-Cracking" ist eine Möglichkeit, den Zugang zum Inneren des Halb intakt Wurm gewinnen, damit Antikörperfärbung ^9-10. Gefrier Cracken kann mit einer Vielzahl von Befestigungs Bedingungen durchgeführt werden, während die Vermeidung Kollagenase-und Reduktionsbehandlungen. Die Nematoden sind zwischen zwei Folien gelegt Klebstoffe, gefroren, und dann werden die Folien voneinander getrennt sind, so dass die meisten der Nematode auf der Bodenschieber und viel von der Kutikula auf der oberen Folie. Die untere Folie kann in Fixiermittel gelegt und die gesamte Folie mit haft Nematoden durch den Antikörper Färbeverfahren übertragen. Die Methode hat derzeit zwei große Schwierigkeiten. Erstens ist es schwierig, die richtige Menge von Druck notwendig, um die Nematoden, ohne ernsthaft zu verformen aufgeteilt anzuwenden. Zweitens sind viele der Würmer wird nicht sTick ​​zu jeder Folie, und werden in der Fixiermittel oder Spülungen verloren. Doch mit den richtigen Folien und Praxis wird das Verfahren rasch ergeben Nematoden mit vernünftigen Morphologie, die mit einer Vielzahl von Fixiermittel und Antikörpern verwendet werden kann.

Das Verfahren kann leicht in Abhängigkeit von dem Ziel der Experimentator variiert werden. Wenn Färbung der einzelnen Nematoden erwünscht ist (z. B. um zu bestimmen, ob eine einzelne Transformante wurde Antikörperfärbung verändert), gleitet dann mit maximaler Haftung (aber höhere Hintergrundfärbung) verwendet werden können, wie Labor hergestellte Folien mit zusätzlichen Polylysin (siehe unten). Für Formaldehyd oder Glutaraldehyd-Fixierung, sollte höher Adhäsions-Objektträger (Labor vorbereitet Polylysin Dias) verwendet werden, da Nematoden mehr haften schlecht auf Polylysin nach diesen Fixierungen. Wenn Wildtyp-Nematoden werden mit Methanol und / oder Aceton fixiert, gleitet dann mit geringerer Haftung und geringer Hintergrundfärbung verwendet werden sollte (kommerziell oder labor vorbereiteten Folien). Wenn eine Vielzahl von Antikörpern und Fixiermittel werden im Labor verwendet werden, kann eine Auswahl von Folien voraus hergestellt und gelagert, bis sie benötigt werden.

Nach dem Zugriff auf die Nematoden-Gewebe wurde gewonnen, Antikörperfärbung Verfahren folgen Standardverfahren (mit längeren Inkubationszeiten Merkmal von Geweben statt Zellen ^1,11).

Protokoll

HINWEIS: Mehrere Protokollschritte sind mit Optionen für die Einrichtung und Vorbereitung abhängig von den spezifischen Bedingungen des Experiments vorgestellt. Für diese Fälle sind alternative Schritte A, B, C usw. dargestellt Das Protokoll mit alternativen Schritte ist in Fig. 1 skizziert.

1. Vorbereitung von Polylysin beschichtete Objektträger

Drei verschiedene Arten von Folien verwendet werden können, abhängig von dem gewünschten Kompromiß zwischen der Leichtigkeit der Herstellung, relativ Haftung und nicht-spezifische Bindung des Antikörpers. Details der Objektträgerpräparations Alternativen sind unten in den Schritten 1A-1C in der Reihenfolge zunehmender Komplexität und Adhäsion gegeben. Folien mit diesen verschiedenen Verfahren hergestellt werden, können für ein einzelnes Experiment zusammen verwendet werden.

1A. Keine Rutsche Vorbereitung

Im Handel erhältliche Polylysin beschichtete Objektträger bieten geringe Haftung und niedrigen Hintergrund.

1B. Slide preparation Optimum für Methanol-Aceton-Fixierung

Medium Haftung und geringe Hintergrund.

1. Bereiten Sie einen Polylysin-Lösung für das Eintauchen der Objektträger: In 400 mg mit sehr hohem Molekulargewicht (150.000 - 300.000 D) Poly-L-Lysin zu 200 ml doppelt destilliertem Wasser. 2 ml 10% Natriumazid Lager (Endkonzentration 0,1%) als Konservierungsmittel. ACHTUNG: trocken Natriumazid ist reaktiv und alle Formen sind giftig. Maske tragen und Handschuhe beim Wiegen Pulver zu 10% Lager in doppelt destilliertem Wasser zu machen.
2. Wischen einzelne Ende Milchglasobjektträger mit fusselfreien Tüchern, Entfernen Flecken und Partikel. Dies sollte auch auf Objektträger mit der Bezeichnung gekauft getan werden "vorgereinigt."
3. Die Objektträger Rücken an Rücken in einer Objektträgerhalter, Glasküvette oder andere Dia-Färbung Behälter, halten mattierte Kanten und nicht ganz perfekt ausgerichtet (um spätere Trennung einfacher). Zeigen Scheibe Halter im Becherglas mit 70% Ethanol (Alkohol Reagenzqualität nicht erforderlich) mit 1% HCl in diWasser gestillt oder füllen Küvette zu Ebene der Zuckerguss. Steinschlag in der Lösung für mindestens 5 min. ACHTUNG: Diese Lösung ist ätzend, Handschuhe tragen. HINWEIS: Diese Lösung kann mehrfach wiederverwendet werden können (bis zu mehreren Monaten).
4. Spülen Sie Folien in destilliertem Wasser läuft für 1 min.
5. Trockenrutschen komplett in einer staubfreien Umgebung entweder, indem in einem Ofen 40-60 ° C für 30-60 Minuten oder über Nacht bei Raumtemperatur zu halten.
6. Die Objektträger in Polylysin-Lösung (für unfrosted Teile) auf Wippe für 15 min.
7. Wiederholen Trocknung von Folien.
8. Wiederholen Polylysin-Lösung Inkubation und Trocknungsschritte.
9. Trennen Sie die Folien mit einem schlanken Metallgegenstand mit einem Gewicht von einer dünnen Spachtel. Wenn sie korrekt eingehalten werden, sind sie schwierig zu trennen. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung (Schutzbrille) und die Arbeit an Tischpapier (nach Gebrauch weggeworfen werden), da kleine Glassplitter fliegen können lose, wenn Folien voneinander getrennt sind.
10. Shop Dias in Rein(Staubfrei) Dia-Box bei 4 ° C bis benötigt.

1C. Schieben Vorbereitung optimal für Formaldehyd-Fixierung

Höchste Haftung, aber hohe Hintergrund.

1. Objektträger mit der Methode 1B Wohnung in einer staubfreien, ofenfeste Form (für das Trocknen im Ofen) oder auf einer flachen Oberfläche staubfrei vorbereitet (für die Lufttrocknung).
2. Platzieren einer 20-60 &mgr; l Tropfen der Polylysin-Lösung auf die Mitte der einzelnen Folien.
3. Trocken Folien vollständig im Ofen oder bei Raumtemperatur. Die Polylysin hinter blass Ovale lassen, wie es verdunstet. Diese Ovale sind sehr Kleber. Leider sind sie auch für die primären und sekundären Antikörper zu binden, auch nach der Blockierung.
4. Shop Folien sauber (staubfrei) Dia-Box bei 4 ° C bis benötigt.

2. Herstellung von Frozen Nematode Slides

Bereiten Nematoden für die Färbung durch Spülen vollständig frei von Bakterien mit der Methode 2A (für Platten von Nematoden) oder2B (für einzelne Nematoden).

2A. Herstellung von Folien aus Platten von Nematoden

1. Stellen Sie ein flaches Stück Metall auf Trockeneis Vorkühlung.
2. Verwenden Sie destilliertes Wasser und einer Glaspipette (verringert Verlust von Würmern) oder Mikropipette, um Würmer aus NGM-Platte mit Bakterien in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen spülen. Die Platten können synchronisiert werden oder gemischt Alters; verwenden Sie keine Platten mit vielen dauers (schwer zu knacken) oder verhungert Würmer (erhöhte Autofluoreszenz), sofern erforderlich.
3. Mit destilliertem Wasser spülen die Würmer 3-4x, bis sie frei von Bakterien. (Um den Verlust von Würmern verringern die gleiche Glaspipette.) Zum Pellet Würmer, entweder wir sie auf der Bank sitzen für 3-5 min (zu meist Erwachsene auf dem Boden des Röhrchens zu sammeln) oder Spin 30 Sekunden bei ~ 1000 rpm (~ 500 g) in einer Tischzentrifuge (für Erwachsene, Larve, sammeln und Embryonen).
4. Entfernen Sie die meisten von Wasser aus Rohr mit Würmern, so dass etwa die doppelte Menge Wasser wie Würmer (mindestens jedoch 25 ul Gesamtvolumen).
5. Etiketten mattierte Seite der "Boden" (in Schritt 1) ​​behandelt Polylysin Folien mit wasserfester Tinte und Objektträger auf Zähler nächsten Behälter mit Trockeneis Etikett nach oben.
6. Eine gleiche Anzahl von regelmäßigen (sauber gewischt, aber nicht behandelt Polylysin) "oben" Folien zur Verfügung.
7. Platz ~ 25 ul Würmer im Wasser auf dem "Boden" haftRutsche und die Ausbreitung der Flüssigkeit, die die Würmer über den mittleren Abschnitt des Schlittens mit der Seite der Pipettenspitze.
8. Lassen Sie die Würmer für 30 Sekunden bis 2 Minuten zu begleichen. Wenn der Schieber entsprechend klebrig, werden die Enden der Schnecken halten, wie sie den Schieber kontaktieren.
9. Halten Sie den Boden gleiten in einer Hand und legen Sie den Oberschlitten über den Boden gleiten, so dass alle, aber die Vereiste Bereiche überlappen. Die Flüssigkeit sollte die Folien leicht auseinander halten, so dass die Würmer noch leicht bewegen lassen Sie sich nicht die Folien gleiten übereinander -. Diese verdreht die Würmer.
10. Drücken Sie vorsichtig gerade nach unten sleicht auf den Oberschlitten, mit dem Daumen und Zeigefinger jeder Hand. Mit der idealen Menge an Druck, wird ein paar der größten Hermaphroditen am Rande der Folien reißen, während die meisten Erwachsenen und Larven wird jede Folie zu kontaktieren, aber intakt bleiben.
11. Sofort und vorsichtig (ohne zu rutschen) setzen die Folien auf dem Stück Metall auf Trockeneis. Die Folien sollten innerhalb einer Minute eingefroren erscheinen. Halten Sie auf Trockeneis für 5 Minuten, bis sie gründlich eingefroren.
12. An diesem Punkt können die Objektträger in ein Eingabefenster bei -80 ° C für mehrere Tage gelagert werden. (Wenn sie bei -80 ° C gehalten Wochen sind, wird das Wasser anfangen zu sublimieren entfernt und die Würmer nicht so gut färben). Wenn Folien werden bei -80 ° C gelagert, lassen Sie sie "warm up" auf Trockeneis für 10 min vor Rissbildung.
13. Gehen bis 3 (Fixierung) Schritt.

2B. Herstellung von Folien aus einzelnen Nematoden

1. Stellen Sie ein flaches Stück Metall auf Trockeneis precHügel.
2. Verwenden Sie einen Wurm holen, um einzelne Nematoden zu einem Wassertropfen auf einem NGM Platte übertragen, um sie von Bakterien zu befreien. Nematode (n) sollte gut zugeführt, um die Autofluoreszenz zu verringern, wenn möglich. Wiederholen Übertragung auf neue Spots von Wasser wie nötig, bis Wurm (n) frei von Bakterien.
3. Beschriften mattierte Seite der "Boden" Polylysin-Objektträger mit wasserfester Tinte und Objektträger auf Zähler nächsten Behälter mit Trockeneis Etikett nach oben. Eine gleiche Anzahl von weniger haft "oben" (unbehandelt) Folien zur Verfügung.
4. Platzieren 5-10 &mgr; l-Tropfen Wasser auf den Bereich der Bodenträger mit Polylysin doppelt behandelt. Verwenden Sie die größere Lautstärke, wenn die Übertragung mehr Würmer, um das Wasser zu verdunsten vor Fertigstellung zu verhindern.
5. Übertragen Sie die Schnecke (s) an die Wassertropfen mit dem Wurm-Pick, mit dem Mikroskop zu beobachten, wie die Würmer sinken, um die klebrige Gleitfläche berühren. Übertragen so wenig wie ein Wurm, so viele wie 20 + Würmer pro Tropfen.
6. Halten Sie den Boden slide in einer Hand und legen Sie den Oberschlitten über den Boden gleiten, so dass alle, aber die Vereiste Bereiche überlappen.
7. Sofort und vorsichtig (ohne zu rutschen oder Kompression) setzen die Folien auf dem Stück Metall auf Trockeneis. Halten Sie auf Trockeneis für 5-30 min. (Diese Folien lagern langfristig, da die Folien leicht austrocknen.)
8. Gehen bis 3 (Fixierung) Schritt.

3. Fixierung

Fixierungsmittel sind notwendig, um "fix" das Antigen an Ort und Stelle in der Zelle, entweder durch Ausfällen ("light-Fixierung") oder Vernetzung ("harte Fixierung") das Antigen. Die Fixierung kann Antigenität stören, die meisten bekannten Antikörper funktionieren am besten mit einer bestimmten Fixierung Zustand. Für neue Antikörper, sollte ein Bereich der Fixierung Bedingungen getestet werden.

Für jede Fixierung, ist der erste Schritt, um Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung herzustellen. Weiter fix Folien mit Nematoden zur Antikörperfärbung nach Methode A (Lichtfix mit Methanol und Aceton) oder B (härter fix mit Formaldehyd oder Glutaraldehyd).

1. Bereiten Sie eine sterile 10x PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) Stammlösung durch Zugabe von 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 27,2 g Na ₂ HPO ₄ • H ₂ 0, 2,4 g KH ₂ PO _4, 20 ml 10% Natriumazid Lager. Um diese Stammlösung zu machen, wiegen Natriumazid Pulver zu 10% ige Lösung in doppelt destilliertem Wasser zu machen. Rühren Sie mit Kochsalzlösung sanfte Wärme bis gelöst. ACHTUNG: trocken Natriumazid ist reaktiv und alle Formen sind giftig. Tragen Maske und Handschuhe bei der Arbeit mit trockenen Natriumazid oder Lösungen.
2. Lassen Salz cool (Tris pH temperaturempfindlich ist), dann pH-Wert auf 7,2 mit 1-10 M NaOH. Top auf 1 L mit doppelt destilliertem Wasser und Autoklaven zu sterilisieren. Lagerung bei Raumtemperatur und verdünnt auf 1x als mit sterilem doppelt destilliertem Wasser benötigt. ACHTUNG: NaOH ist ätzend - Handschuhe während der Anwendung zu tragen.

3A. Licht fix mit Methanol-Aceton-

1. Setz 100% Methanol, 100% Aceton und 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in Küvetten auf Eis für mindestens 10 min Vorkühlung. ACHTUNG: Methanol und Aceton sind giftig, Handschuhe.
2. Nehmen Sie ein Paar von unteren und oberen Dias aus dem Trockeneis, schnell verdrehen sie auseinander, und sofort tauchen die "unten" slide in eiskaltem Methanol für 2 min. Die "Top"-Rutsche können verworfen werden.
3. Objektträger aus Methanol kaltem Aceton für 4 min Eis. Wenn die Folien hatte viele Würmer, die meisten (90%) wird in dem Update fallen, auch mit den am besten vorbereiteten Folien. Wenn einzigen Wurm Träger wurden richtig vorbereitet, sollten die Würmer eingehalten bleiben.
4. Zeigen oder tauchen Sie die Folien in das Glas mit PBS (abzuspülen Fixiermittel) und fahren bis 4 (Färbung) Schritt.

3B. Fest fix unter Verwendung von Formaldehyd oder Glutaraldehyd

1. Verdünnen Reagenzqualität Formaldehyd oder Glutaraldehyd-Lösung in 1x PBS auf 0,5-4% Endkonzentration. Aliquots (1,5 ml) may gespeichert dicht bei -20 bis -30 ° C begrenzt werden; auftauen Aliquots auf Eis kurz vor der Verwendung. HINWEIS: Formaldehyd-Lösungen mit der Zeit abgebaut und an der Luft. ACHTUNG: Formaldehyd und Glutaraldehyd sind giftig, Handschuhe und arbeiten in der Kapuze.
2. Nehmen Sie ein Paar von unteren und oberen Dias aus dem Trockeneis, schnell verdrehen sie auseinander, und sofort legen Sie die "unten" slide mit Würmern in der flachen Schale mit Deckel. (Der Oberschlitten kann verworfen werden).
3. Unmittelbar pipettieren 200 ul giftig Fixiermittel über der Mitte der Fläche des Objektträgers mit Würmern. Das Fixiermittel wird teilweise an Ort und Stelle einzufrieren, dann schmelzen, um einen größeren Bereich der Folie abzudecken.
4. Wenn die Würmer nicht völlig mit Fixiermittel bedeckt, sofort und vorsichtig mehr Fixiermittel mit einer Mikropipette. Nicht Fixiermittel über den Rand der Folie fließen.
5. Decken Sie die Schüssel mit einem Deckel und lassen für 10 min bis über Nacht bei Raumtemperatur. Seien Sie sicher, dass das Gericht wird befeuchtet, wenn längere Inkubationen are verwendet - dies kann durch Zugabe von gefalteten feuchten, fusselfreien Tüchern in die Schale durchgeführt werden. Lassen Sie sich nicht die Tücher berühren Sie die Folien.
6. Nach der vollständigen Fixierung vorsichtig pipettieren Fixiermittel mit losen Würmer in ein 1,5-ml-Röhrchen und tauchen Sie die Folie in eine Küvette mit PBS.
7. Drehen Sie das Rohr mit Würmern, die locker für 30 Sekunden kam mit hoher Geschwindigkeit zu pelletieren. Zweimal mit PBS spülen Würmer, verarbeitet dann parallel zu den Schnecken auf den Folien (tut Schritte Mikrozentrifugenröhrchen statt auf Folien).
8. Gehen bis 4 (Färbung) Schritt.

4. Antikörperfärbung

Die Antikörperfärbung Protokoll ist ähnlich wie Standard-Protokolle für jedes Gewebe auf Folien. Dieses Protokoll ist für alle Folien, unabhängig von der Herstellung in den Schritten 1-3.

1. Antikörper herzustellen Puffer durch Mischen 700 ml doppelt destilliertem Wasser, 100 ml 10-fach PBS, 5 ml Triton X-100 (0,5% Endkonzentration), 2 ml 0,5 M EDTA pH 8 (1 mM final), 1 g BSA (0,1% Endkonzentration), 5 ml 10% iger azide-Lösung (0,05% endg.). pH-Wert auf 7,2 mit HCl, fügen Sie dann doppelt destilliertem Wasser auf 1 L; lagern bei 4 ° C
2. Bereiten Blockieren durch Rekonstitution Esel-Serum mit doppelt destilliertem Wasser, dann Zugabe von 5 ml Serum 45 ml Antikörperpuffer (final 10% Serum).
3. Bereiten Sie Primär-und Sekundärantikörperlösungen durch Verdünnen Antikörper in Antikörperpuffer plus 1% BSA. Empfohlene Verdünnungen 1:50-1:2,000 für Primärantikörper und 1:1,000-1:5,000 für Sekundärantikörper (Cy3or OG488 konjugierte Antikörper gegen Esel verwendet, um primäre Antikörper erhöhen Arten).
4. Bereiten DAPI Lager durch Mischen von 2,5 mg / ml in doppelt destilliertem Wasser; Store in 8 ul Aliquots bei -30 ° C eingefroren ACHTUNG: DAPI ist ein giftiges DNA-bindenden Farbstoff, Handschuhe, während Einwaage aliquotiert.
5. Vorbereitung 10 ml Mounting Medium durch Mischen von 200 mg n-Propylgallat, 0,3 ml 1 M Tris, pH 9, 2,7 ml doppelt destilliertem Wasser in einem 15 ml konischen Röhrchen. Hitze bei 65 ° C für etwa 10 min bis gelöst.In 7 ml Glycerin und eine 8 ul Aliquot von DAPI und Wirbel auch. Aliquot Medium in 1,5-ml-Röhrchen, in Folie wickeln und nur im Dunkeln bei 4 ° C (sowohl Luft und Licht verschlechtern die Mittel - wenn es mehr gelb, verwerfen in Biohazard Abfall). ACHTUNG: n-Propylgallat ist eine reaktive Anti-Oxidationsmittel, Handschuhe beim Wiegen.
6. Übertragen Objektträger in eine Küvette mit Sperren für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C (bevorzugt über Nacht hart fix). Vermeiden Sie Schütteln, um zu verlieren, Würmer zu vermeiden.
7. Objektträger auf Glas mit primären Antikörper oder Objektträger flach in einer Schüssel und befeuchtet oben mit jeweils 100-500 ul primären Antikörper-Färbung. Dias über Nacht bei 4 ° C ohne Schütteln inkubiert.
8. Nach der primären Antikörper-Inkubation, Transfer gleitet, um Glas PBS Färbung.
9. Filterblock durch den Trichter mit Filterpapier und bei 4 ° C gefüttert, und wenn steril filtriert alle 1-2 Wochen, können Sperren für 1 oder mehrere Monate wiederverwendet werden. Ebenso filtern und speichernprimären Antikörper bei 4 ° C für die Wiederverwendung (bis zu 10 oder mehr Runden der Färbung).
10. Rinse gleitet dreimal (~ 20 min jeweils) in Antikörperpuffer.
11. Die Objektträger in sekundäre Antikörper in einem lichtdichten Behälter Färbung und Inkubation 4 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
12. Objektträger auf Glas PBS Färbung. Filter und sparen sekundären Antikörper bei 4 ° C für die Wiederverwendung (für bis zu 10 oder mehr Runden-Färbung).
13. Rinse gleitet dreimal (~ 20 min jeweils) in Antikörperpuffer.
14. Objektträger zu PBS und lassen in PBS (Minuten bis über Nacht bei 4 ° C) bis bereit zu montieren.
15. Arbeiten Sie schnell auf einzelne Folien, so dass die Würmer auf der Vorderseite der Folie bleiben nass. Einen Objektträger aus dem PBS, trocknen Rückseite der Folie mit einem fusselfreien abwischen, und auf Küchenpapier.
16. Platz ~ 20 ul Montagemedium über Würmer, so dass es zu etwa gleichen Teilen Mittel-und PBS auf Schiebe-Kipp-Schiebe sanft auf die beiden Lösungen mischen. CAUTION: Montage Medium ist giftig.
17. Kippschiebers so Mattrand ist niedriger und Lösung sammelt in der Nähe von Zuckerguss, dann legen Sie einen Rand von 24 x 60 mm Deckglas auf Lösung.
18. Senken Sie die Deckglas, um Luftblasen (die Bleich erhöhen und stören Leser) zu minimieren. Wenn sich Blasen bilden, heben Sie den Rand des Deckglases langsam, dann relower ohne Verschieben des Deckglases über die Würmer.
19. Die Kante der Folie vorsichtig trocknen, ohne den Deckglas, durch Zusammendrücken der Kanten mit einem fusselfreien zu wischen. Der relativ trockene Kante der Folien müssen rund um den Rand des Deckglases sichtbar
20. Deckglas mit 2-3 Schichten Nagellack. Dias können in einem flachen Trägerhalter bei Herstellung und Lagerung vor Licht zu schützen platziert werden. Sobald Schlitten gut verschlossen und trocken, reinigen Sie die Deckglas-und Rückseite der Folie.
21. Gut verschlossenen Folien können im Dunkeln Tage bei 4 ° C oder Wochen bei -20 ° C gehalten werden, Über längere Zeiträume, DAPI staining von DNA und die meisten grünen Farbstoffe (z. B. 488 nm Anregung) verblassen. Verschließen Sie das Deckglas mit Nagellack nach Bedarf, z. B. nach Verwendung eines Ölimmersionsobjektiv.

Ergebnisse

Wenn Würmer richtig komprimiert, rissig, und leicht fixiert ist, kann nahezu die gesamte Schnecken zugänglich Antikörper-Färbung (siehe Abbildung 2). Die Lage der Kerne durch DAPI-Färbung angezeigt anzeigt, welche Teile der Schnecke sind intakt, wenn die Würmer zu einem härteren Fixiermittel wie Formaldehyd ausgesetzt wird, kann sich die Morphologie der Schnecke verzerrt werden (wie durch die unnatürlich wellige Aussehen der gesehen Muskeln in den Fig. 3A-D). Ein weiteres häufiges Probl...

Diskussion

Das gefrierCrack Protokoll ist eines von mehreren Verfahren zur Antikörperfärbung in C. elegans. Es bietet eine relativ einfache Möglichkeit, Würmer Fleck, erfordert aber spezifische Reagenzien und Praxis für optimale Ergebnisse. Kritische Schritte (in Abbildung 1 dargestellt) umfassen: 1) Bei Objektträgervorbereitung (siehe Schritte 1 und 2) manuelle Kompression der Nematoden (siehe Schritte 2 und 3) schnelle Fixierung (siehe Schritt 3). Erstens, um die Haftung der Nematoden auf die Objektträg...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Poly-L-Lysin-Objektträger (Marke ESCO)	Fisher	12-545-78	Objektträger der Marke Sigma eignen sich auch für
Poly-L-Lysinhydrobromid	Sigma	P1524	WICHTIG: Marke und hohes Molekulargewicht von Polylysin kritischer
einfacher mattierter Rand Objektträger	Fisher	48312-002	Andere Marken sind geeignet
Natriumazid	Sigma	S2002-25G	TOXIC, tragen Sie Handschuhe und Maske, während Sie das Pulver abwiegen, um 10% Vorrat zu erhalten. Tragen Sie Handschuhe, wenn Sie Stammlösung
Coplin Färbeglas	VWR	47751-792	Andere Marken sind geeignet
5-Objektträger-Versandtasche	Elektronenmikroskopie Wissenschaft	71549-01	Eine von vielen verschiedenen Marken von kleinen Objektträgerhaltern, geeignet zum Färben von
Paraformaldehyd	VWR	MK262159	WICHTIG: Normale Formalinlösungen (37% Formaldehyd) sind NICHT geeignet. Entweder 1) Crysatlaline paraformaldehyd in Phosphatpuffer auflösen und in kleinen Aliquoten gefroren lagern. Oder 2) Kaufen Sie Paraformaldehyd in Elektronenmikroskopiequalität in Aliquoten. GIFTIG - Handschuhe tragen; Entsorgen Sie überschüssiges Waschbecken mit Wasser.
Glutaraldehydlösung, 25% in Wasser	Sigma	G 5882	WICHTIG: Glutaraldehyd in Elektronenmikroskopiequalität in Ampullen kaufen; GIFTIG - Handschuhe tragen; Entsorgen Sie überschüssiges Waschbecken mit Wasser.
Triton X-100	VWR	EM-9410	Andere Marken sind geeignet
Rinderserum Albumin	Fisher	ICN820451	Andere Marken sind geeignet
Eselserum, lyophilisiert	Jackson Immunoresearch	017-000-121	Andere Marken sind geeignet
Cy3 Donkey Anti-Maus IgG Multi-Labeling	Jackson Immunoresearch	715-165-150	Dieses Unternehmen wird für hochwertige Multi-Label-Antikörper (affinitätsarmiert) empfohlen. Wählen Sie den geeigneten Farbstoff und das geeignete Antigen (Tier, das zur Aufzucht des Primärantikörpers verwendet wurde).
n-Propylgallat	Fisher	ICN10274750	Andere Marken eignen sich DAPI
, 4',6'-diamidino-2-phenylindol dihydrochlorid	Sigma	D 9542	TOXIC. Tragen Sie Handschuhe und dosieren Sie in kleine Aliquots und feeze, um die Exposition zu minimieren
Whatman #1 Filter mit 15 cm Durchmesser	Fisher	09805G
Deckglas #1 1/2 Rechteck 24 x 60 mm	VWR	48393-252	#1 1/2 Dicke ist optisch am besten
Objektträgermappe	VWR	48429-092	Andere Marken sind geeignet